目的:研究泰山玉竹提取物玉竹多糖(EA-PAOA)对I型糖尿病小鼠的降血糖作用及可能的细胞免疫学机制。方法:采用常规的链脲佐菌素(STZ)多次注射诱导法制备I型糖尿病小鼠模型,试验组分低、中、高三个剂量灌胃等体积的EA-PAOA,对照组灌胃等体积的生理盐水。于用药后1~4周每周检测各组小鼠血糖和胰岛素水平;通过流式细胞仪检测外周血CD4 +T细胞和CD8 +T细胞比例,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清Th1型细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和Th2型细胞因子白细胞介素4 (IL-4)浓度。最后进行数据的统计学分析。结果:与模型组相比,实验组空腹血糖水平显著降低(P < 0.05~0.01);胰岛素水平则显著升高(P < 0.01);外周血CD4 +T细胞比例显著降低而CD8 +T细胞比例显著降低(P < 0.01),CD4 +/CD8 +比例显著降低(P < 0.01)。血清中Th1型细胞因子IFN-γ显著降低(P < 0.05~0.01),而Th2型细胞因子IL-4显著升高(P < 0.05~0.01)。结论:泰山玉竹多糖治疗能明显降低1型糖尿病小鼠血糖,其降糖作用可能通过调节糖尿病小鼠T细胞亚群及Th1型和Th2型细胞因子水平而发挥的。 Objective: To study the therapeutic effects of extraction from Polygonatum odoratum (EA-PAOA) from Taishan on type 1 diabetes and the possible immunological mechanism. Methods: Diabetic mouse models were established by repeated injection of small dosage of STZ. Mice were divided into 3 different groups according to different concentrations of EA-PAOA which were administrated by intragastric. The control group was administrated the same volume saline by intragastric. Changes of blood glucose, insulin were monitored from 1 to 4 weeks after administration. Changes of levels of serum interferon γ (IFN-γ) and interleukin-4(IL-4) in diabetic mouse were tested with enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) after administration. Finally, data were analyzed by statistic method. Results: Levels of blood glucose were significantly lower after administration in all extrac-tion groups than that in the model group (P < 0.05 - 0.01). Levels of insulin were significantly higher after administration in all extraction groups than that in the model group (P < 0.01). In the periph-eral blood, CD4 + T cells were significantly decreased, whereas CD8 + T cells were significantly in-creased (P < 0.01), and the ratio of CD4 +/CD8 + was significantly decreased (P < 0.05 - 0.01). Levels of type 1 cytokine IFN-γ were lower in each extraction groups than that in the model group, whereas levels of type 2 cytokine IL-4 were significantly higher in each extraction groups than that in the model group (P < 0.05 - 0.01). Conclusion: EA-PAOA can markedly decrease the blood glucose of the in mice with diabetes. The mechanisms were probably related to regulating of T cell subsets.
郭珊珊,张雪,刘宁宁,修鹏程
泰山医学院,山东 泰安
收稿日期:2017年9月30日;录用日期:2017年10月19日;发布日期:2017年10月25日
目的:研究泰山玉竹提取物玉竹多糖(EA-PAOA)对I型糖尿病小鼠的降血糖作用及可能的细胞免疫学机制。方法:采用常规的链脲佐菌素(STZ)多次注射诱导法制备I型糖尿病小鼠模型,试验组分低、中、高三个剂量灌胃等体积的EA-PAOA,对照组灌胃等体积的生理盐水。于用药后1~4周每周检测各组小鼠血糖和胰岛素水平;通过流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞比例,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清Th1型细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和Th2型细胞因子白细胞介素4 (IL-4)浓度。最后进行数据的统计学分析。结果:与模型组相比,实验组空腹血糖水平显著降低(P < 0.05~0.01);胰岛素水平则显著升高(P < 0.01);外周血CD4+T细胞比例显著降低而CD8+T细胞比例显著降低(P < 0.01),CD4+/CD8+比例显著降低(P < 0.01)。血清中Th1型细胞因子IFN-γ显著降低(P < 0.05~0.01),而Th2型细胞因子IL-4显著升高(P < 0.05~0.01)。结论:泰山玉竹多糖治疗能明显降低1型糖尿病小鼠血糖,其降糖作用可能通过调节糖尿病小鼠T细胞亚群及Th1型和Th2型细胞因子水平而发挥的。
关键词 :泰山玉竹多糖,1型糖尿病,细胞免疫
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I型糖尿病是一种T细胞介导的慢性自身免疫性疾病,免疫系统选择性攻击胰岛β细胞,导致β细胞的损伤以及胰岛素的绝对缺乏。主要表现为多饮、多食、多尿、消瘦、疲乏无力以及血糖增高等症状 [
玉竹,产于泰山,由泰安金泰联大药店提供。链脲佐菌素(STZ) (Sigma公司),小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA试剂盒(美国eBioscience公司),胰岛素放免分析试剂盒(上海西唐科技公司)。
流式细胞仪(Aria II, BD公司),Touch血糖仪(迈瑞公司),酶标仪(Tecan Infinite F200/M200型,瑞士)。旋转蒸发仪(RE-52AA型,上海予华公司)。
C57BL/6小鼠,雄性,50只,8 w龄(北京维通利华公司提供)。
取泰山玉竹,洗净粉碎后,以30%乙醇常温浸提24 h,G4过滤分离,旋转蒸发仪蒸发回收乙醇,得黄棕色沉淀,于烘箱干燥后成浸膏,即为中性多糖成分。使用前配制成所需浓度的溶液。
将50只8 w龄健康的雄性C57BL/6小鼠随机分成五组,每组10只小鼠。正常对照组、糖尿病模型组、三个剂量实验组。正常对照组小鼠只注射等体积的枸橼酸钠缓冲液,其余小鼠应用0.1 mol/l枸橼酸钠缓冲液(PA 4.4)配制成0.4%链脲佐菌素(STZ)溶液,按40 mg/kg剂量进行腹腔注射,每天1次,连续5天制备糖尿病模型。药物处理方法如下,正常对照组与糖尿病对照组,灌胃0.2 ml生理盐水,每日1次,共4周;实验组采用玉竹多糖EA-PAOA的1 g/kg为基础给药量,另取5倍、10倍量,即EA-PAOA低剂量组(1 g/kg)、EA-PAOA中剂量组(5 g/kg)、EA-PAOA高剂量组(10 g/kg)分别以等体积的0.2 ml进行灌胃,每日1次,共4周。本研究相关动物实验得到泰山医学院动物伦理委员会的许可。
血糖及胰岛素含量检测:对各组小鼠每周分别测血糖及胰岛素含量,动态监测1型糖尿病模型建立。在注射STZ 72小时后,血糖稳定升高,出现多食、多饮、多尿的三多症状。最终以血糖 ≥ 11.1 mmol/L以上2周,为造模成功 [
空腹血糖测定:割尾法于尾静脉采血1滴,采用血糖快速检测仪进行血糖检测。用药前及用药过程每周检测1次,共5次。
CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群检测:眼眶取血1滴,肝素钠抗凝,加入Rat-anti-mouse CD4和CD8单抗标记15 min,红细胞裂解液ACK裂红15 min,加入1 ml 0.01M PBS,3000 rpm离心5 min,加入300 μl PBS定容,进行流式细胞仪检测,结果以各亚群占淋巴细胞的百分比表示。
ELISA检测细胞因子:小鼠用摘眼球法取血,离心分离血清,置−20℃保存。采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immuosorbent assay, ELISA)测定各组标本干扰素γ (interferon γ, IFN-γ)和白细胞介素4 (interleukin 4, IL-4)水平,操作方法按照试剂盒说明书进行。
采用SPSS 17.0软件系统进行分析,实验数据用均数±标准差(x ± s)表示,组间比较采用单因素方差分析,以P < 0.05为差异具有统计学意义。
实验组空腹血糖水平比模型组显著降低(P < 0.05~0.01),胰岛素水平则有明显升高(P < 0.05),细胞因子IFN-γ,实验组较模型组显著低(P < 0.05~0.01)。细胞因子IL-4实验组较模型组显著升高(P < 0.05~0.01)。各项检测指标检测结果见表1~4。
用药前 | 用药后 | ||||
---|---|---|---|---|---|
1周 | 2周 | 3周 | 4周 | ||
正常对照组 | 5.94 ± 0.83 | 5.94 ± 0.77 | 5.95 ± 0.49 | 5.85 ± 0.73 | 5.65 ± 0.56 |
模型组 | 23.50 ± 1.34 | 24.26 ± 1.35 | 24.55 ± 1.18 | 24.80 ± 1.44 | 25.18 ± 1.26 |
EA-PAOA低剂量组 | 23.63 ± 2.78 | 18.48 ± 2.41# | 16.45 ± 2.34## | 14.30 ± 1.92## | 12.83 ± 1.74## |
EA-PAOA中剂量组 | 23.18 ± 1.65 | 16.67 ± 1.58# | 13.76 ± 2.01## | 11.78 ± 1.02## | 10.15 ± 0.75## |
EA-PAOA高剂量组 | 23.71 ± 2.81 | 17.17 ± 2.93# | 15.28 ± 2.62## | 13.35 ± 1.98## | 11.74 ± 1.26## |
表1. EA-PAOA对各组STZ小鼠血糖水平的影响(x ± s, mmol/L)
注:#P < 0.05, ##P < 0.01 vs模型组
用药前 | 用药后 | ||||
---|---|---|---|---|---|
1周 | 2周 | 3周 | 4周 | ||
正常对照组 | 51.24 ± 10.92 | 52.45 ± 9.19 | 52.37 ± 10.10 | 5243 ± 10.06 | 52.16 ± 10.55 |
模型组 | 19.69 ± 5.71 | 19.71 ± 6.02 | 19.87 ± 5.93 | 19.72 ± 4.51 | 19.88 ± 5.32 |
EA-PAOA低剂量组 | 19.70 ± 5.67 | 44.62 ± 11.51## | 41.47 ± 12.71## | 37.50 ± 13.05## | 36.50 ± 13.22## |
EA-PAOA中剂量组 | 19.82 ± 5.79 | 46.59 ± 12.16## | 43.54 ± 11.62## | 40.53 ± 11.78## | 34.52 ± 12.33## |
EA-PAOA高剂量组 | 19.81 ± 5.68 | 47.02 ± 11.92## | 43.98 ± 12.31## | 40.99 ± 11.53## | 36.92 ± 11.55## |
表2. EA-PAOA对各组STZ小鼠胰岛素的影响(x ± s, mmol/L)
注:##P < 0.01 vs模型组
CD4+T | CD8+T | CD4+T/CD8+T | |
---|---|---|---|
模型组(n = 20) | 64.13 ± 9.27 | 32.24 ± 7.66 | 2.052 ± 0.722 |
EA-PAOA组(n = 20) | 37.93 ± 6.10## | 61.17 ± 5.47## | 0.672 ± 0.212## |
表3. EA-PAOA对组和模型组外周血T细胞亚群的比较(x ± s, %)
注:##P < 0.01 vs模型组
IFN-γ | IL-4 | |
---|---|---|
正常对照组 | 73.21 ± 10.15 | 49.38 ± 5.88 |
模型组 | 159.82 ± 4.51 | 31.51 ± 5.37 |
EA-PAOA低剂量组(1 g/kg) | 137.43 ± 9.63# | 39.52 ± 6.35# |
EA-PAOA中剂量组 | 89.38 ± 7.74## | 48.93 ± 10.19## |
EA-PAOA高剂量组 | 54.57 ± 5.64## | 58.19 ± 5.33## |
表4. EA-PAOA对各组STZ小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-4水平的影响 (x ± s, mmol/L)
注:#P < 0.05, ##P < 0.01 vs模型组
链脲佐菌素(STZ)是一种含有亚硝基的化合物,能够破坏胰岛β细胞,大量的β细胞被破坏导致胰岛素原的合成障碍,从而导致糖尿病,因此常被广泛用于糖尿病的化学诱导 [
细胞免疫在1型糖尿病的发病机制中发挥了重要作用,其特征表现为CD4+T和CD8+T淋巴细胞在胰岛的浸润引起的胰岛炎,选择性的损伤胰岛β细胞,导致胰岛素分泌降低或缺乏 [
正常机体中各T淋巴细胞亚群之间会相互作用维持着机体正常免疫功能。根据分泌的细胞因子不同,CD4+T淋巴细胞分为Th1和Th2亚群 [
综上所述,泰山玉竹多糖通过调节细胞免疫平衡,发挥了对1型糖尿病的治疗作用,而且具有毒性低、制备方便等优点,可望用于I型糖尿病的临床治疗。
基金号:201510439096,2015年国家级大学生创新训练计划。
郭珊珊,张 雪,刘宁宁,修鹏程. 泰山玉竹多糖对小鼠糖尿病的治疗作用及细胞免疫机制研究 Effect and Cellular Immunological Mechanism on Mice of Diabetes with Extraction of Polysaccharide from Taishan Polygonatum odoratum[J]. 临床医学进展, 2017, 07(04): 258-263. http://dx.doi.org/10.12677/ACM.2017.74043