本文以诺丽(Morinda citrifolia Linn.)果和叶中分离得到的8株内生真菌为研究对象,使用乙酸乙酯萃取其次生代谢产物。采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和FRAP总还原能力分析其抗氧化活性,用福林–肖卡法和AlCl3显色法测定其总多酚(TPC)、总黄酮(TFC)含量并构建其系统发育树。结果表明,诺丽8株内生真菌菌株的抗氧化活性均较强,其DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力的最高值,分别为31.24 mmol/L-Trolox/g DW、10.92 mmol/L-Trolox/g DW和9.62 mmol/L。在1.0 mg/mL时,TPC、TFC含量范围值分别为17.99~79.03 mg/g,48.38~158.97 mg/g。较强的抗氧化活性,使得诺丽内生真菌在探寻天然抗氧化活性产物中具有重要价值。 The secondary metabolites were obtained by using ethyl acetate as solvent for 8 kinds of fermen-tation liquid extraction from endophytic fungi of Noni leaves and fruits. The antioxidant activity was analyzed by DPPH radical scavenging method, ABTS radical scavenging assay and FRAP total reduction capability, and the total polyphenols content (TPC) and total flavonoid content (TFC) of the secondary metabolites were determined by using Folin-reagent method and AlCl3 colorimetric method. The results showed that the antioxidant activities of 8 strains of Noni endophytic fungi were strong, the highest value of DPPH, ABTS and FRAP of the antioxidant capacity was 31.24 mmol/L-Trolox/g DW, 10.92 mmol/L-Trolox/g DW and 9.62 mmol/L, respectively. At 1 mg/mL, the content range of TPC and TFC was 17.99 - 79.03 mg/g, 48.38 - 158.97 mg/g, respectively. The strong antioxidant activity made the Noni endophytic fungi have the important value in exploring the natural antioxidant activity of products.
马文婷,吴友根*,胡征波,张军锋,于靖
海南大学热带农林学院,海南 海口
收稿日期:2017年11月13日;录用日期:2017年11月23日;发布日期:2017年11月30日
本文以诺丽(Morinda citrifolia Linn.)果和叶中分离得到的8株内生真菌为研究对象,使用乙酸乙酯萃取其次生代谢产物。采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和FRAP总还原能力分析其抗氧化活性,用福林–肖卡法和AlCl3显色法测定其总多酚(TPC)、总黄酮(TFC)含量并构建其系统发育树。结果表明,诺丽8株内生真菌菌株的抗氧化活性均较强,其DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力的最高值,分别为31.24 mmol/L-Trolox/g DW、10.92 mmol/L-Trolox/g DW和9.62 mmol/L。在1.0 mg/mL时,TPC、TFC含量范围值分别为17.99~79.03 mg/g,48.38~158.97 mg/g。较强的抗氧化活性,使得诺丽内生真菌在探寻天然抗氧化活性产物中具有重要价值。
关键词 :诺丽,内生真菌,抗氧化活性,系统发育树
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诺丽(Morinda citrifolia Linn.)是茜草科巴戟天属的传统药用植物 [
海南拥有适宜诺丽生长的热带沿海气候和土壤条件,对诺丽的开发研究具有地理优势且内生真菌的药用价值已成为国际热点。本文以诺丽(M. citrifolia)果和叶中分离得到的8株内生真菌为研究对象,采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和FRAP总还原能力分析其抗氧化活性,以期寻找一种新型天然抗氧化剂的潜在来源,并为诺丽内生真菌在医药健康领域的应用价值提供理论依据。
对采自我国海南省不同市县的八成熟诺丽果和叶,用纯净水洗净,依次以2.6%次氯酸钠 + 75%酒精做6个梯度32组进行表面消毒:次氯酸钠溶液消毒的时间为60~300 s,乙醇溶液消毒的时间为30~180 s。然后用无菌水洗涤3次,用无菌滤纸吸干水分后,用灭菌过的手术刀将果和叶边缘部分去除,果内部或中心部分切分成1 cm × 1 cm大小的组织块,叶内部或中心部分切分成0.5 cm × 0.5 cm大小的组织块 [
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基,马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基。
乙酸乙酯、无水乙醇均为国产分析纯,没食子酸、芦丁、水溶性维生素E来自中国药品生物制品鉴定所;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、过硫酸钾、甲醇、醋酸钠缓冲液、三氯化铁、福林酚、碳酸钠、氯化银。
在超净工作台上,将保留菌种接种到新PDA上开始活化,用打孔器在活化菌落边沿处打孔获得直径为6 mm菌饼,转接到装300 mL PDB的500 mL锥形瓶内,在25℃,130 rpm摇床内孵育8~10天。用减压抽滤法分离发酵液,收集菌液,然后用乙酸乙酯溶剂在12个小时之内等体积萃取3次,静置待分层后收集萃取液,40℃旋转蒸发浓缩,在烘箱内加热烘干得粗提物。称重,配制成1.0 mg/mL浓度供测试。
母液:0.0626 g的Trolox标准品用无水乙醇定容到25 mL,浓度为10 mmol/L。
ABTS法中的Trolox标准溶液:200 µmol/L、400 µmol/L、600 µmol/L、800 µmol/L、1000 µmol/L、1200 µmol/L和1400 µmol/L。
DPPH法中的Trolox标准溶液:400 µmol/L、800 µmol/L、1200 µmol/L、1600 µmol/L、2000 µmol/L、2400 µmol/L和2800 µmol/L。
Code | Closest (published) Genbank match | Accession number | Max Identiy | Parts useda | Sourceb |
---|---|---|---|---|---|
M22 | Colletotrichum LL-2015 isolate LJTJ30 | KP748221.1 | 99% | F | H (N 20˚03'35''E 110˚19'44'') |
M10 | Ascomycota sp. AR-2010 isolate ATT242 | HQ607907.1 | 100% | F | Q (N 19˚16'56''E 110˚37'46'') |
M20 | Uncultured fungus clone CMH541 | KF800630.1 | 99% | F | S (N 18˚20'38''E 109˚34'41'') |
M19 | Fungal endophyte sp. g32 | HM537036.1 | 100% | L | W (N 18˚45'24''E 110˚72'06'') |
M18 | Cladosporium cladosporioides isolate SZ8M-5 | JN226994.1 | 99% | F | W (N 18˚45'24''E 110˚72'06'') |
j22 | Cryptococcus sp. 3 TMS-2011 | HQ631014.1 | 99% | F | D (N 19˚30'38''E 109˚34'21'') |
j20 | Rhodotorula mucilaginosa strain KKUY-0221 | KM816742.1 | 99% | F | S (N 18˚20'38''E 109˚34'41'') |
j19 | Sterigmatomyces halophilus | KX791366.1 | 95% | L | Q (N 19˚16'56''E 110˚37'46'') |
表1. 诺丽内生真菌样本库
a:L:叶;F:果实。The letter of L represents Noni leaf, and F is the meaning of Noni fruit。b:H:海口;D:儋州;S:三亚;Q:琼海:W:万宁。The letter of H, D, S, Q, W represents Haikou city, Danzhou city, Sanya city, Qionghai city and Wanning city, respectively
FRAP法中的Trolox标准溶液:800 µmol/L、1600 µmol/L、2400 µmol/L、3200 µmol/L、4000 µmol/L、4800 µmol/L和5600 µmol/L。
自由基的产生使用ABTS与K2S2O8反应体系 [
12.5 mg DPPH溶解到甲醇中,定容到100 mL,使用时稀释5倍到25 mg/L,现配现用。适当体积的粗提液加入2 mL DPPH甲醇溶液中,黑暗条件20 min后在517 nm测量吸光值,以提取溶剂作为对照,最终结果以TEAC表示。
TPTZ溶液的配制:由0.3 mol/L醋酸盐缓冲液25 mL,10 mmol/L TPTZ工作液25 mL,20 mmol/L FeCl3溶液25 mL组成。现用现配。适当体积的粗体液按次加入1 mL ddH2O 和1.8 mL TPTZ溶液,摇匀,水浴37℃反应10 min,593 nm测量吸光值,溶剂做对照。最终结果TEAC表示。
TPC测定使用福林–肖卡法 [
总黄酮含量测定采用AlCl3显色法 [
DPPH、FRAP、ABTS法的抗氧化能力数据用Microsoft Excel版软件分析,TPC、TFC与其抗氧化活性之间的相关性分析用SAS V8。
登陆NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),利用BLAST将测序获得的霉菌以基于核糖体ITS区域的序列和酵母菌以基于26s rDNA D1/D2区域的序列,与GenBank中的已知序列进行比对,寻找相似度最高菌种,联合形态学特征,确定分离菌株的分类地位。并用MEGA 5.2.1软件按照邻接法(Neighbour-Joining,N-J),自展数(boostrap)为1000,构建系统发育树 [
517 nm测定吸光值,所得标曲方程:y = −0.0003x + 0.9403,R2 = 0.9978,表现出显著的量效相关性。DPPH是一种稳定的自由基,其溶液呈紫色,当与抗氧化剂反应时,溶液变为浅黄色,吸光度降低,是评价物质抗氧化性的常用方法之一。由表2可知,随着样品提取液浓度的增加,对DPPH的清除能力也在逐渐增加,说明样品提取液与清除DPPH的能力存在量效关系。m20、m18、j22、j20的自由基清除能力均较强,当体积为225 µl时,其清除率均 ≥ 30 mmol/L-Trolox/g DW,其余4种亦具有较强的清除能力。
732 nm测定吸光值,所得标曲方程:y = −0.0004x + 0.6354,R2 = 0.9936 (图1),表现出显著的量效相关性。ABTS是一种较为稳定的自由基,其溶液呈蓝绿色,当有自由基清除剂存在时,ABTS溶液颜色变浅,吸光值减小。8种诺丽内生真菌均具有一定程度的ABTS活性(图2),其中j22和j19的自由基清除活性较强,在体积为18 µl时,清除率分别为10.92和9.71 mmol/L-Trolox/g DW。而同等稀释倍数下,其余5种皆具有一定的ABTS+·自由基清除能力。
图1. ABTS法标准曲线(732 nm)
图2. ABTS法测定菌株的抗氧化活性
菌株Code | 粗提液各体积Volume of crude extract (µl) | ||||
---|---|---|---|---|---|
10 µl | 25 µl | 75 µl | 140 µl | 225 µl | |
m22 | 2.04 | 5.08 | 22.51 | 23.58 | 23.94 |
m10 | 4.18 | 10.44 | 27.31 | 28.68 | 29.01 |
m19 | 3.98 | 9.43 | 25.84 | 28.08 | 28.79 |
m20 | 4.69 | 11.98 | 29.74 | 30.97 | 31.24 |
m18 | 4.76 | 11.14 | 26.51 | 30.27 | 30.87 |
j22 | 4.99 | 12.38 | 28.48 | 30.58 | 31.21 |
j20 | 4.02 | 9.48 | 26.44 | 29.51 | 30.24 |
j19 | 2.67 | 6.18 | 21.28 | 26.64 | 27.03 |
表2. 粗取物清除DPPH自由基能力的测定结果
593 nm测定吸光值,所得标曲方程:y = 0.0001x + 0.2711,R2 = 0.9863 (图3),表现出显著的量效相关性。酸性情况下抗氧化物可以还原Fe3+-TPTZ生产蓝紫色的Fe2+-TPTZ,可作为样品总抗氧化能力的指标。如图4所示,其中j22和j19的还原能力最强,在体积为90 µl时,还原力分别为9.45和9.62 mmol/L。m19和m20也具有较强的还原能力。
于765 nm和510 nm处测定吸光度,标准品没食子酸、芦丁的浓度为横坐标(X),吸收值为纵坐标(Y)绘制标准曲线。所得线性回归方程为:y = 0.0013x − 0.0027,R2 = 0.9991 (图5),y = 1.4703x + 0.0152,R2 = 0.9966 (图6),表现出显著的量效相关性。
诺丽内生真菌提取物抗氧化活性成分TPC和TFC如图7所示,m18、j22、j19具有较高含量的总酚和总黄酮,在浓度为1.0 mg/mL时,m20的TPC含量达79.03 mg/g,m18和j22的TFC含量分别为144.49和158.97 mg/g。
通过NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库,进行BLAST比对霉菌ITS区域序列和酵母菌的26 s rDNA D1/D2区域序列,应用MEGA 5.2.1软件按照N-J法构建聚类分析树状图,序列相似性 ≥ 99%,即为相同种。已确定8个菌株的分类归属(图8和图9)。分别属于属于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)两个类群。3种酵母菌分属于嗜盐酵母属(Sterigmatomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、蔷薇色酵母属(Rhodotorula),5种霉菌属于刺盘孢属(Colletotrichum)、枝孢属(Cladosporium),还有m10、m19、m20未确定属。
生活质量的不断提高,使人类对延缓衰老及治疗相关疾病日渐重视,渴望寻求安全、高效的清除自由基、活性氧等抗氧化天然产物已成了国内外研究热点。已有大量诺丽抗氧化活性物质的研究 [
图3. FRAP法标准曲线(593 nm)
图4. FRAP法测定菌株的抗氧化活性
图5. 没食子酸标准曲线(765 nm)
图6. 芦丁标准曲线(510 nm)
图7. 8种内生真菌粗提物总多酚和总黄酮含量。注:不同字母表示彼此之间存在显著性差异(p < 0.05)
图8. 基于rDNA ITS序列的系统发育分析
图9. 基于26s rDNA D1/D2序列的系统发育分析
其DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力的最高值,分别为31.24 mmol/L-Trolox/g DW、10.92 mmol/L-Trolox/g DW和9.62 mmol/L,TPC、TFC的含量在1.0 mg/mL时范围值分别为17.99~79.03 mg/g,48.38~158.97 mg/g。经筛选其抗氧化活性较高的有三株菌m18、j19和j22,分布属于嗜盐酵母属(Sterigmatomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、枝孢属(Cladosporium)。可见诺丽内生真菌的菌株普遍具有抗氧化活性,故可作为筛选天然抗氧化剂开发的重要生物资源,也证明诺丽内生真菌可以产生较多抗氧化活性物质,与文献 [
海南省中药现代化专项:海巴戟内生真菌抗肿瘤活性的次生代谢产物研究[专项编号:(2015ZY15)]。
马文婷,吴友根,胡征波,张军锋,于靖. 诺丽内生真菌抗氧化活性的研究及其系统发育树的构建 Studies on Antioxidant Activity of Endo Phytic Fungi Isolated from Morinda citrifolia (Noni) and Construction of Phylogenetic Tree[J]. 植物学研究, 2017, 06(06): 429-438. http://dx.doi.org/10.12677/BR.2017.66056