镰刀菌种类繁多,地理分布复杂,寄主范围广,寄生繁殖能力强,大部分对植物具有致病性和毁灭性。近来,由镰刀菌引起的橡胶树病害在中国植胶区内发生并呈现逐渐增加趋势。为了查明海南广坝植胶区的一株橡胶幼树枯死的原因,本文通过病原菌分离、形态学、分子生物学和致病性鉴定等方法,最终确定该致病菌是一种木贼镰刀菌(Fusarium equiseti),这里命名为Fusarium-Hb。由于该镰刀菌在条件合适的情况下致病性强,又因为其对温度(16℃~35℃)和pH适应范围广(pH 4~11),光照比黑暗条件下更易形成孢子,能产生大量大、小分生孢子及厚垣孢子,因而该病原菌是需要引起重视的病原菌。另外,本研究通过5种单剂药效筛选试验表明,40%福星乳油是防治该镰刀菌的首选药剂;其次为70%甲基托布津可湿性粉剂。本文是木贼镰刀菌引起橡胶树枯死的致病菌的首次报道,并为大田防治提供了有效的防治药剂。 Fusarium spps. are diverse and exist widely, with a large range of hosts and capability of rapid propagation, making them as pathogens even lethal to most of plants. Recently, diseases caused by Fusarium spps. occur frequently in rubber tree plantation in China. In order to find the death reason of a young rubber tree in Hainan Guangba region, one pathogen was finally identified as Fusarium equiseti based on its pathogenicity, morphology and molecular identification, named as Fusarium-Hb in this study. Owing to its high pathogenicity and its easy adaption to light, temperature and a large range of pH 4 - 11 growth condition, this Fusarium-Hb could produce abundant microspores, macrospores and chlamydospores, which should be given enough attention in future. In addition, the most efficient fungicide agents and adoptions were screened by comparison with the inhibition effect of five fungicide single agents on Fusarium-Hb. These results showed that 40% Fuxing emulsifiable concentrates were the first choice for killing Fusarium-Hb and 70% thiophanate methyl powder was the second. In a word, Fusarium-Hb was firstly identified as pathogen of killing rubber tree and the most efficient fungicides were selected out for application to field management in this study.
秦云霞1,卢基来2,周慧珍2,戚继艳1,龙翔宇1,方永军1,唐朝荣1*
1中国热带农业科学院橡胶研究所,农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室,海南 儋州
2海南大学热带农林学院和热带作物学院,海南 海口
收稿日期:2017年11月12日;录用日期:2017年11月26日;发布日期:2017年12月6日
镰刀菌种类繁多,地理分布复杂,寄主范围广,寄生繁殖能力强,大部分对植物具有致病性和毁灭性。近来,由镰刀菌引起的橡胶树病害在中国植胶区内发生并呈现逐渐增加趋势。为了查明海南广坝植胶区的一株橡胶幼树枯死的原因,本文通过病原菌分离、形态学、分子生物学和致病性鉴定等方法,最终确定该致病菌是一种木贼镰刀菌(Fusarium equiseti),这里命名为Fusarium-Hb。由于该镰刀菌在条件合适的情况下致病性强,又因为其对温度(16℃~35℃)和pH适应范围广(pH 4~11),光照比黑暗条件下更易形成孢子,能产生大量大、小分生孢子及厚垣孢子,因而该病原菌是需要引起重视的病原菌。另外,本研究通过5种单剂药效筛选试验表明,40%福星乳油是防治该镰刀菌的首选药剂;其次为70%甲基托布津可湿性粉剂。本文是木贼镰刀菌引起橡胶树枯死的致病菌的首次报道,并为大田防治提供了有效的防治药剂。
关键词 :橡胶树,茎腐病,镰刀菌,药剂筛选
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天然橡胶主要来源于巴西橡胶树(Hevea brasiliensis),这种高大乔木生长寿命约60年,经济寿命为25~40年。我国橡胶树种植区主要分布于海南、云南、广东等非传统植胶区。这类植胶区病害多,尤其是随着橡胶树种植年限的延续和生态、生产条件的转变,一些新的病虫害逐渐显现出来,如2006年西双版纳发现了镰刀菌Fusarium sp.,其侵染引起茎干爆皮流胶和茎干溃疡 [
据报道,镰刀菌是专一引起植物维管束病害的病原,一旦进入维管束系统后能马上堵塞导管,产生有毒物质,不断扩散和向上延展,导致病株茎干部腐烂直至死亡,造成的损失还是很大的。镰刀菌生态适应性极强,分布很广,寄主种类繁多 [
样品采集:2017年6月釆集于海南省东方广坝农场的已经栽种4年的橡胶树枯死病株。
供试橡胶树幼苗材料:选用品种热研7-33-97自根无性系试管苗和袋装苗,本研究所种苗课题组提供。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。70%甲基托布津(hiophanate-Methyl) [
病原物分离采用组织分离法 [
通过镰刀菌载玻片培养、棉兰染色及显微镜观察方法进行其形态学鉴定。观察并记录分生孢子大小、形状,小型分生孢子、大型分生孢子数量、形状,产孢细胞、厚垣孢子的有无。根据Booth分类系统对镰刀菌进行分类鉴定 [
本文采用伤根接种法鉴定所分离镰刀菌的致病性。接种镰刀菌和无菌水(对照)到长势一致的橡胶自根无性系热研7-33-97试管苗上,处理和对照分别是三株为一个重复,共设3次重复。每天观察接种苗、病原菌及处理苗子根部的生长变化情况,第12天统一测量处理每棵橡胶树幼苗的株高、叶片数及总鲜重,且从发病的植株上再次分离到该病原菌。
镰刀菌形态多样化,且极易受温度、pH值、光照、营养条件、湿度等影响而变化。本试验具体试验操作参照文献 [
除了进行形态鉴定外,我们克隆其ITS序列,分析系统进化从而鉴定其类别。以CTAB法 [
参照文献 [
计算公式如下:抑制率 (%) = [(对照菌落直径 − 处理菌落直径)/对照菌落直径] × 100
以农药浓度取以10为底的对数为横坐标,通过查生物统计机率值换算表,以各个浓度时抑制率对应的几率值作为纵坐标,求出每个试验浓度的回归方程和相关系数R和EC50值。
已经栽种4年的橡胶树死了。致病菌使橡胶幼树病株根部维管束变黑腐烂,叶片脱落,树梢渐渐发黄,最终枯萎死亡。从症状上初步判断是维管束病害,看似与已报道的镰刀菌危害症状相似(图1(A)~(C))。
该病原菌Fusarium-Hb在28℃培养箱黑暗培养3天,它在PDA上菌落为白色丝状,日生长率为16 mm;在孟加拉红培养基上形成亮黄色菌落(图2(A)和图2(B))。小分生孢子直接由营养菌丝产生,有3个分隔,大小为12~13.5*1~1.25 μm,孢子量大(图2(C));但是随着帚状分枝的分生孢子梗产生(图2(C)),镰刀型的大分生孢子大量产生,每个大分生孢子有7个分隔,大小为 40~43.5*1.25~1.5 μm (图2(D));厚垣孢子间生,成链或成节,球形(图2(E))。
图1. 感染Fusarium-Hb而死亡的橡胶树。(A) Fusarium-Hb引起橡胶树幼苗死亡;(B) 枯死的茎秆;(C) 病原菌使根茎维管束变黑腐烂
图2. Fusarium-Hb的形态特征。(A) Fusarium-Hb在PDA上的生长特征;(B) Fusarium-Hb在孟加拉红培养基上产生黄色色素;(C) 镰刀菌的小分生孢子及小分生孢子梗特征,bar = 10 μm,放大400倍;(D) 大分生孢子梗及大分生孢子特征,bar = 10 μm,放大400倍;(E) 镰刀菌厚垣孢子特征,bar = 10 μm,放大400倍
所分离病原菌Fusarium-Hb的ITS 序列长度为517 bp,经与相关Fusarium种类的序列进行同源比对,菌株 Fusarium-Hb的ITS序列与KR094457.1 (F. equiseti)同源性最高,达到100%,所以该菌株应为F. equiseti木贼镰刀菌。Fusarium-Hb与木贼镰刀菌、变红镰孢菌、尖孢镰刀菌聚类在同一组;与层出镰孢菌、砖红镰孢、三线镰刀菌、燕麦镰孢和锐顶镰孢菌相距较远(图3)。
按照1.2.2的实验方法,致病性鉴定的结果表明,在橡胶试管苗根部接种Fusarium-Hb 3天就看到该病菌在受伤部位生长,第6天开始就看到接种镰刀菌的处理苗根部变褐,第12天细根根毛显著减少,根系腐烂变黑,植株萎蔫,生长停滞、叶色暗淡甚至部分叶字脱落现象(图4(B)),也是因为处理时间还较短,上部部分茎叶还保持存活状态。但是接种无菌水(对照)的橡胶树幼苗生命力强盛,叶色鲜绿,根系生长旺盛发达(图4(A));对比其鲜重可知,接种苗已经显著受到抑制。可见该致病菌致病力强,对橡胶苗的生长影响大甚至是致命性的。处理后第12天结果表明接种病菌的处理苗的单株鲜重(3.4845 g)和单株叶片数(4片)显著低于对照试管苗(5.5245 g和6片),苗高变化不显著(表1)。
试验结果表明Fusarium-Hb的适应性很强,适宜生长的温度范围为16℃~35℃,最适宜的温度为30℃,致死温度为50℃ (10 min),低温10℃处理5天仍旧能保持活性,而且在光照条件下生长快,容易产生大量分生孢子(图5(A),图2(C)和图2((D))。在6种不同碳源培养基上生长速度相差不大,以麦芽糖、葡萄糖和蔗糖生长较好,在甘露醇和山梨醇生长较差(图5(B),表2);在6中氮源培养基(氯化铵、硫酸铵、硝酸钾,尿素、硝酸钠和硝酸铵)上差异很明显,该菌株在氯化铵和硫酸铵上几乎不生长,而在氮源利用上的先后顺序为硝酸钾 > 硝酸钠 > 硝酸铵 > 尿素(图5(C),表2)、在培养基pH 4~11范围都能生长(图5(D),表2)。
图3. 根据ITS序列构建的Fusarium-Hb的最小进化树F. equiseti KR094457.7和EU595566.1木贼镰刀菌;F. incarnatum变红镰孢;F. oxysporum EU839393.1尖孢镰刀菌;F. proliferatum EU364856.1层出镰孢菌;F. lateritium AY266406.1砖红镰孢;F. tricinctum AF008921.1三线镰刀菌;F. avenaceum KU529155.1燕麦镰孢;F. acuminatum LC193726.1锐顶镰孢菌
图4. Fusarium-Hb对橡胶幼苗的致病性。(A) 对照幼苗;(B) 接种Fusarium-Hb的橡胶幼苗
Fresh weight (g) | Leaf number/seedling | Height (cm) | |
---|---|---|---|
Control | 5.5245a | 6a | 15.65a |
Treatment | 3.4845b | 4b | 15.55a |
表1. 橡胶树木贼镰刀菌Fusarium-Hb对橡胶树幼苗生长的抑制作用
Note: Different litter letter denote significant difference between control and treatments (p < 0.01) and the same litter letter denote no difference (p < 0.05) after Duncan’s test.
图5. Fusarium-Hb在不同培养上的生长特征
Carbon source | Rate of growth mm/d | Nitrogen source | Rate of growth mm/d | Different pH | Rate of growth mm/d |
---|---|---|---|---|---|
麦芽糖 | 1.46 | KNO3 | 1.48 | 4 | 1.29 |
葡萄糖 | 1.49 | NaNO3 | 1.1 | 5 | 1.43 |
蔗糖 | 1.35 | NH4NO3 | 1.2 | 8 | 0.94 |
可溶性淀粉 | 1.24 | CO(NH2)2 | 1.06 | 9 | 1.18 |
甘露醇 | 1.13 | NH4Cl | 0.2 | 10 | 1.2 |
山梨醇 | 1.12 | (NH4)2SO4 | 0.2 | 11 | 1.4 |
表2. Fusarium-Hb在不同碳源和氮源培养基上的生长速率
Note: The growth data was average value of three days based on four replicates.
5种杀菌剂对Fusarium-Hb抑制作用的测定结果表明(表3):40%福星乳油对Fusarium-Hb抑制效果最好,可以稀释20,000倍使用,其EC50最小,为0.0554 μg/ml;其次为70%甲基托布津可湿性粉剂,可以稀释4000倍使用,EC50值为0.3870 μg/ml;99%恶霉灵可湿性粉剂的抑制效果不明显,其EC50值为0.1874 μg/ml;50%扑海因可湿性粉剂和50%多菌灵可湿性粉剂(数据略)对镰刀菌没有任何抑制效果。
本文通过形态学和分子生物学手段鉴定了一种橡胶树基腐病的致病菌——木贼镰刀菌Fusarium-Hb (图3),并回接验证其对橡胶苗的高致病性(爆发条件下,能快速破坏植株的根系) (图4)。虽然该菌在高温(>37℃)下不易存活,对铵态氮适应性差,但是其具有广泛的酸碱适应性(pH 4~11)和耐低温的能力(10℃,5天不死,16℃缓慢生长),光照会促进其快速生长和产生孢子(图5(A)),产孢量大而且速度快,具有小、大分生孢子和厚垣孢子(图2),因此一旦条件合适,其爆发时对植物很可能是毁灭性病害,因此是一种需要高度重视的致病菌。
Name of fungicide | Times of dilution | Reagent concentration (μg/ml) | Log of concentration (x) | Probability value (Y) | Virulence regression equation Y = a + bx | EC 50 (μg/ml) | R2 |
---|---|---|---|---|---|---|---|
99%恶霉灵 可湿性粉剂 | 3000 | 0.33 | −0.4815 | 5.6219 | Y = 6.9325 + 2.6572x | 0.1874 | 0.9099 |
3500 | 0.29 | −0.5376 | 5.5622 | ||||
4000 | 0.25 | −0.6021 | 5.3055 | ||||
50%扑海因 可湿性粉剂 | 1000 | 1.00 | 0 | 4.1110 | Y = 4.1438 + 3.5295x | 1.7482 | 0.9709 |
1200 | 0.83 | −0.0809 | 3.9197 | ||||
1500 | 0.76 | −0.1739 | 3.5015 | ||||
70%甲基托布津 粉剂 | 2500 | 0.40 | −0.3979 | 5.0728 | Y = 8.3307 + 8.0776x | 0.3870 | 0.994 |
3000 | 0.33 | −0.4815 | 4.5155 | ||||
4000 | 0.25 | −0.6021 | 3.4368 | ||||
40%福星乳油 | 12,000 | 0.0833 | −1.0794 | 5.4565 | Y = 8.1243 + 2.4859x | 0.0554 | 0.9927 |
15,000 | 0.0667 | −1.1759 | 5.1738 | ||||
20,000 | 0.0500 | −1.3010 | 4.9021 |
表3. 四种杀真菌剂对Fusarium-Hb生长的效果
另外,5种单剂试验结果表明,40%福星乳油对Fusarium-Hb杀菌效果最好,可作为防治镰刀菌的首选药剂,尤其是40%福星乳油(氟硅唑)属于有机硅类杀菌剂,可以安全使用于作物幼嫩组织,因此可用稀释10,000~20,000倍的40%福星乳油在移栽橡胶前进行预处理,能起到很好的预防作用,当然也可用于灌根处理感染植株。其次为70%甲基托布津可湿性粉剂,可用3000~4000倍稀释用于灌根(表3)。据报道在春夏季节,若栽培基质温度较高,潮湿,移栽时根系伤害较多,植株生长势弱则发病重;而且大苗龄的橡胶苗比小苗龄的容易发病;栽培中氮肥施用过多,有利于病菌的生长和侵染,并促进病害的发生和流行。根据Fusarium-Hb的氮源利用特性,我们建议大田生产中可以通过施用铵态氮肥抑制其繁殖和传播。另外,根据近几年云南、海南植胶区出现的橡胶树镰刀菌病害特征,很有必要进行全面调查分析,特别观察这类病害与橡胶树不利的立地条件、营养状况和生势的关系,以期对病害的经济地位有准确评价和予以有效、合理的控制。今后还需要加大对橡胶树镰刀菌根腐病病原菌的研究,进一步明确其发生危害情况以及发病规律,制定综合防治策略和技术,为抗病选育和大田管理奠定基础。
感谢田维敏研究员、李维国研究员和橡胶产业技术体系东方试验站站长莫东红对试验取材的帮助。
中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630022016006-01)。
秦云霞,卢基来,周慧珍,戚继艳,龙翔宇,方永军,唐朝荣. 橡胶树基腐病致病菌——木贼镰刀菌的分离及鉴定Isolation and Identification of Fusarium equiseti Causing Rubber Tree Stem Rot[J]. 农业科学, 2017, 07(09): 621-629. http://dx.doi.org/10.12677/HJAS.2017.79084