以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,研究了不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼体长体重、SOD和POD酶活性的影响。结果表明,在硬度为50 mg/L与250 mg/L条件下,不同的Cu2+浓度,对斑马鱼的体长体重无明显影响。另一方面,Cu2+对斑马鱼SOD和POD活性有不同的影响,其中斑马鱼SOD活性在暴露2天后呈现低浓度诱导高浓度抑制的状态。POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应,高浓度为抑制-诱导效应。 Effects of Cu2+ on the body weight, body length, SOD and POD enzyme activities of Danio rerio under different water hardness were studied. Results showed that there was no significant effect of different Cu2+ concentrations on body length and weight either at water hardness of 50 mg/L or 250 mg/L. However, there were effects of Cu2+ concentrations on SOD and POD enzymatic activities of Danio rerio. SOD enzymatic activity was induced at lowCu2+ concentrations and was inhabited at high Cu2+ concentrations after 2-day exposure. POD enzymatic activity was first inhabited, then induced and then inhabited at low concentrations, while it was first inhabited and then induced at high concentrations.
郭京君
山东省青岛第二中学,山东 青岛
收稿日期:2018年4月7日;录用日期:2018年4月21日;发布日期:2018年4月28日
以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,研究了不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼体长体重、SOD和POD酶活性的影响。结果表明,在硬度为50 mg/L与250 mg/L条件下,不同的Cu2+浓度,对斑马鱼的体长体重无明显影响。另一方面,Cu2+对斑马鱼SOD和POD活性有不同的影响,其中斑马鱼SOD活性在暴露2天后呈现低浓度诱导高浓度抑制的状态。POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应,高浓度为抑制-诱导效应。
关键词 :铜,斑马鱼,酶活,SOD,POD
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重金属铜是生命必需的微量元素,作为氧化还原催化剂或氧的载体参与生物体内30多种酶的组成,但超过一定浓度就会产生毒性 [
铜是水产养殖中常用的药物,可以防治鱼病,也可作除藻剂,杀死除去丝状藻等浮游植物。同时,较多的鱼用药物添加了铜以增加药效,且以硫酸铜为主要形式,研究表明溶解态铜对水生生物的毒性最强 [
目前,水环境的污染日趋严重,引起了人们的广泛重视 [
试验用鱼为斑马鱼(Danio rerio),为国际上公认的标准试验鱼,已被广泛应用于药物毒理学、生态毒理学、环境监测以及疾病研究等科研领域 [
硫酸铜(CuSO4·5H2O,AR)为北京化学试剂三厂生产。配制时,先用蒸馏水配制成质量浓度为320 mg/L的Cu2+的母液,在实验中所用的质量浓度由其稀释而成。
缓冲液:含0.25 mol/L蔗糖、6 mmol/L EDTA-Na2,10 mmol/L Tris,pH值为7.14。
超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)酶活力检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白浓度测定试剂盒为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产。
实验用水为标准稀释水,由CaCl2、MgSO4、NaHCO3、KCl和去离子水配置而成。实验水温为(22 ± 1)℃。
选定4个间隔较大的质量浓度范围进行预实验,与此同时,设不加毒物的空白组对照,观察24、48、72、96 h斑马鱼反应,并按50 mg/L和250 mg/L两种硬度设置每组不同的浓度梯度。
具体浓度设计如下:1) 50 mg/L:2,8,32,128 μg/L;2) 250 mg/L:8,32,128,512 μg/L。根据半静态生物试验法,实验期间每24 h更换一次实验液,每浓度放5尾斑马鱼,在实验中观察其行为和中毒症状。中毒后,经多次刺激无反应则判断为死亡,将死亡斑马鱼从水中捞出并记录死亡数。根据预实验所得出的质量浓度范围来确定正式实验的质量浓度。
本实验参考鱼类14天延长毒性试验的标准方法 [
取整条斑马鱼,用预冷蒸馏水(0~4℃)洗净,滤纸吸干。按每克组织加9 mL冰冷酶提取液(0.125 mmol/L蔗糖,6 mmol/L EDTA-Na2,10 mmol/L Tris,pH = 7.14),用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆。匀浆液在高速冷冻离心机中于10,000 r/ min 离心20 min,取上清,测定酶活力。多余酶液−20℃冷冻保存。
样品上清液中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝比色法,SOD测定采用黄嘌呤氧化法改进的方法-羟胺法,POD测定采用一般分光光度法。酶活检测试剂盒按照操作说明进行 [
SOD活性单位定义为每mg组织蛋白在1 mL反应液中,SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个活性单位(U) [
所有数据分析均采用单因素方差分析(One-factor analysis of variance)。数据分析与作图软件为SPSS18.0与Origin 9.0。
斑马鱼在不同质量浓度Cu2+中表现出不同程度的中毒症状,在最高浓度组,斑马鱼暴露24 h后开始出现异常现象,喜欢在水面附近活动,开始剧烈水平游动然后逐渐变得缓慢,最后躺卧死于水面,死亡个体有轻微浮肿。
表1显示,各Cu2+处理组,斑马鱼体长与体重与对照组相比,无显著性差异(p > 0.05)。说明在水体硬度50 mg/L且长期暴露于Cu2+条件下,Cu2+对斑马鱼体长与体重的影响不显著。
表2显示,各Cu2+处理组,斑马鱼体长与体重与对照组相比,无显著性差异(p > 0.05)。说明在水体硬度250 mg/L且长期暴露于Cu2+条件下,Cu2+对斑马鱼体长与体重的影响不显著。
由以上可知,Cu2+对斑马鱼的体长体重无明显影响。
图1显示,当水体硬度为50 mg/L时,斑马鱼的Cu2+各处理组在2 d内组织SOD活性变化不明显,但随着时间的延长,到4 d后,Cu2+各处理组的变化趋于显著,且低浓度组SOD 的活性提高,高浓度组SOD活性得到抑制。其中浓度为2.00 μg/L和3.00 μg/L的Cu2+处理组,SOD活性在开始均表现为增强,后表现出抑制;浓度为4.50 μg/L组在2~8 d时间段呈现缓慢上升趋势,14 d后开始呈现显著下降趋势。10.13 μg/L和15.19 μg/L组在2~8 d期间呈现下降趋势,8 d之后有上升趋势,14 d后趋于平稳。
图2表明,当水体硬度为250 mg/L时,整体上在前4 d内,所有浓度组SOD活性均处于被抑制状态,然后SOD活性逐渐上升。6.00 μg/L和9.00 μg/L Cu2+浓度组在8 d之后趋于稳定,并且略有下降。而其他浓度组在8 d到14 d内有所下降,14 d后逐渐上升。
Cu2+浓度(μg/L) | 体长(cm) | 体重(g) |
---|---|---|
对照 | 2.75 ± 0.31 | 0.115 ± 0.027 |
2.0 | 2.59 ± 0.83 | 0.112 ± 0.023 |
3.0 | 2.66 ± 0.35 | 0.094 ± 0.026 |
4.5 | 2.74 ± 0.46 | 0.116 ± 0.032 |
6.75 | 2.94 ± 0.20 | 0.143 ± 0.062 |
10.13 | 2.72 ± 0.33 | 0.128 ± 0.034 |
15.19 | 2.63 ± 0.21 | 0.103 ± 0.021 |
表1. 50 mg/L硬度下Cu2+对斑马鱼体长与体重的影响
Cu2+浓度(μg/L) | 体长(cm) | 体重(g) |
---|---|---|
对照 | 2.60 ± 0.26 | 0.101 ± 0.022 |
6.0 | 2.29 ± 0.24 | 0.108 ± 0.031 |
9.0 | 2.64 ± 0.36 | 0.115 ± 0.034 |
13.5 | 2.74 ± 0.30 | 0.116 ± 0.040 |
20.25 | 2.61 ± 0.34 | 0.108 ± 0.025 |
30.38 | 2.71 ± 0.31 | 0.103 ± 0.037 |
45.56 | 2.61 ± 0.31 | 0.107 ± 0.043 |
表2. 250 mg/L硬度下Cu2+对斑马鱼体长与体重的影响
图1. 水体硬度50 mg/L下斑马鱼SOD活性与Cu2+暴露时间关系
图2. 水体硬度250 mg/L下斑马鱼SOD活性与Cu2+暴露时间关系
Cu2+对斑马鱼POD酶活影响的数据见图3和图4,在50 mg/L硬度组中,Cu2+浓度为2.00 μg/L和3.00 μg/L时,POD活性在2 d内受到抑制,在2~4 d内逐渐增强,4 d后又开始受到抑制,8 d之后趋于稳定。Cu2+浓度为4.50 μg/L和6.75 μg/L组在2~8 d呈现缓慢下降趋势,8 d之后逐渐上升。10.13 μg/L和15.19 μg/L组从第2 d到14 d呈现下降趋势,14 d后10.13 μg/L浓度组趋于平稳,15.19 μg/L浓度组略有上升。
图3. 水体硬度50 mg/L下斑马鱼POD活性与Cu2+暴露时间关系
图4. 水体硬度250 mg/L下斑马鱼POD活性与Cu2+暴露时间关系
图4表明,在250 mg/L硬度组中,浓度为6.00 μg/L组的POD活性在2 d增强,其余浓度组2 d内基本无明显变化。2 d后6.00 μg/L组的POD活性开始受到抑制,其后逐渐下降,8 d之后趋于稳定。9.00 μg/L组4 d后开始受到抑制,POD活性随时间逐步降低。13.50 μg/L 4 d内趋于平稳,4 d后呈现抑制诱导状态,14天又趋于平稳。20.35 μg/L,30.38 μg/L和45.56 μg/L组4 d后呈现抑制状态。
动物体在新陈代谢过程中,产生的超氧阴离子自由基(OH−、
SOD是
对于斑马鱼,Cu2+各处理组在2 d内,组织SOD活性的变化不明显,但随着时间的延长,Cu2+各处理组的变化趋于显著。低浓度组提高了SOD的活性,高浓度组SOD活性得到抑制。
在低浓度或短时间内,鱼暴露在重金属中,鱼体内产生过量
SOD清除
毒物在低浓度下出现的这种现象,是其在无毒情况下的应激反应,这一现象称为“毒物兴奋效应”。到目前为止,许多研究证明,“毒物兴奋效应”具有普遍性;高浓度Cu2+胁迫下,斑马鱼体内SOD性极显著性下降,因此,Cu2+胁迫下SOD活性的降低,造成斑马鱼的活性氧伤害很可能是Cu2+对斑马鱼形成毒害的重要原因之一 [
POD存在于真核生物细胞的过氧化物酶体中,以铁卟啉为辅基,能催化过氧化氢、氧化酚类等有毒物质和调节氧含量使细胞免受高浓度氧毒害。它利用H2O2氧化供氢体,它对H2O2要求专一而对供氢体要求广泛,能够反映生物体产生和消除自由基的能力以及细胞代谢的强度。SOD是生物体防御氧化损伤的重要酶类,它能催化
有研究表明生物在轻度逆境胁迫时,POD会升高来抵御外界刺激,但在重度逆境胁迫下超过机体抵御能力,POD会降低,生物积累大量活性氧自由基导致机体受损。
Cu2+暴露对斑马鱼POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应,高浓度为抑制-诱导。暴露初期斑马鱼机体产生POD清除含氧自由基,抵抗外界刺激机体增强自身防御,但此时POD产生和清除含氧自由基平衡已打破,表现为POD活性降低。而Cu2+随暴露时间增加,POD活性降低。这是因为斑马鱼机体受到损伤,含氧自由基浓度增大,超出POD清除能力,机体清除含氧自由基机制严重失衡的表现,导致POD活性急剧下降 [
Cu2+各处理组中低浓度组Cu2+暴露时,对斑马鱼体长体重无显著影响,而短期内斑马鱼SOD活性变化不明显,但随着时间的延长,SOD活性提高,导致“毒物兴奋效应”。高浓度Cu2+曝露时,随着时间的延长和浓度的增加,SOD的活力抑制明显。而POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应,高浓度为抑制-诱导。
Cu2+对斑马鱼体长体重无显著影响,Cu2+各处理组SOD活性表现为低浓度诱导-抑制,高浓度抑制。而POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应,高浓度为抑制-诱导。
青岛二中教师发展基金项目(EZ2016010)资助。
郭京君. Cu2+对斑马鱼SOD及POD酶活的影响研究 Effects of Cu2+ on SOD and POD Enzymatic Activities in Danio rerio[J]. 农业科学, 2018, 08(04): 397-405. https://doi.org/10.12677/HJAS.2018.84062