本文介绍了细胞在接受MTOR、AMPK等上游信号刺激下,在多种自噬相关蛋白参与下如何形成隔离膜、并进一步延伸形成自噬特征性结构“自噬体”以及成熟的自噬体如何与溶酶体结合完成胞浆物质的降解和再利用的动态过程,并简述了翻译后修饰(包括磷酸化作用、糖基化修饰、泛素化修饰、乙酰化修饰及硫醇修饰)如何调控自噬的研究进展,指出自噬蛋白的翻译后修饰在细胞自噬过程中发挥重要作用。理解自噬蛋白中哪个氨基酸残基被修饰,以及证实这些修饰氨基酸在相关疾病的表达状态,将会为疾病的诊断和治疗提供重要的靶点。 In this review, we will describe the dynamic progress how cells form isolation membranes with the participation of various autophagy-related proteins under the stimulation of upstream signals such as MTOR and AMPK, and further extend to form autophagic characteristic structures “au-tophagosome”, and how mature autophagosomes combine with lysosome to complete the degra-dation and reuse of cytoplasmic substances. In addition, the research progress of post-translational modification (including phosphorylation, glycosylation, ubiquitination, acetylation and mercaptan modification) in regulating autophagy was briefly reviewed. It was pointed out that post-translational modification of autophagic proteins played an important role in the process of autophagy. Understanding which amino acid residues in autophagic proteins are modified and confirming the expression of these modified amino acids in related diseases will provide important targets for disease diagnosis and treatment.
夏丹
山东医学高等专科学校病理教研室,山东 临沂
收稿日期:2019年2月4日;录用日期:2019年2月13日;发布日期:2019年2月25日
本文介绍了细胞在接受MTOR、AMPK等上游信号刺激下,在多种自噬相关蛋白参与下如何形成隔离膜、并进一步延伸形成自噬特征性结构“自噬体”以及成熟的自噬体如何与溶酶体结合完成胞浆物质的降解和再利用的动态过程,并简述了翻译后修饰(包括磷酸化作用、糖基化修饰、泛素化修饰、乙酰化修饰及硫醇修饰)如何调控自噬的研究进展,指出自噬蛋白的翻译后修饰在细胞自噬过程中发挥重要作用。理解自噬蛋白中哪个氨基酸残基被修饰,以及证实这些修饰氨基酸在相关疾病的表达状态,将会为疾病的诊断和治疗提供重要的靶点。
关键词 :自噬,MTOR,翻译后修饰
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细胞自噬(Autophagy)是一个进化保守的代谢过程,基于溶酶体自我消化损伤的细胞器、蛋白聚集体和胞浆组分(这种表述来源于希腊语,“auto”-self和“phagia”-eating),从而形成自身营养池。当细胞处于饥饿或应激状态时,通过自噬实现能量和营养再循环以做出对不同应激的适应性反应。自噬受很多高度保守的自噬相关分子ATGs (Autophagy-related gene)调节,目前已被证实的有36个ATG分子参与自噬的发生。除了基本的“管家”功能外,还有一些刺激因素会诱导自噬发生,如细胞因子、应激、病原体、错误折叠或聚集的蛋白、损伤的细胞器甚至是蛋白合成的抑制 [
自噬的发生,从起始到自噬体形成经历一系列膜的动态变化。首先,各种胞浆组分包括受损细胞器被“隔离膜”结构包裹,随后,新月形的隔离膜不断融合、延伸,直到形成完整的双层膜细胞器——自噬体(Autophagosome) (图1)。
图1. 细胞自噬过程
酵母中的自噬体形成时Atg蛋白聚集到液泡膜附近的一个点,自噬体在这个特异位点形成,因此称它为自噬前体结构“PAS”(pre-autophagosomal structure) [
隔离膜形成、组装中一个重要复合物是Class III PI3K复合物(由PIK3C3、p150、Atg14和BECN1组成),其主要功能是产生PI3P (phosphatidylinositol-3-phosphate),PIK3C3复合体招募一些PI3P结合蛋白后进一步招募两个泛素样蛋白连接复合物,Atg12-Atg5-Atg16L1和LC3/Atg8-PE (phosphatidylethanolamine)到隔离膜参与膜的进一步延伸 [
在正常条件下,大部LC3/Atg8主要在细胞质中, 而当自噬被诱导发生时,LC3/Atg8则以LC3/Atg8-PE连接体形式定位于隔离膜两侧。LC3/Atg8可控制细胞自噬体的大小,因其始终存在于自噬体膜上,所以Atg8及其哺乳动物细胞同源物LC3的脂化水平被广泛用于衡量细胞自噬发生的指标。
目前的研究进展表明,多种细胞器和质膜为自噬体膜的形成提供了脂类或重要蛋白。Ktistaki课题组通过研究ZFYVE1证实了内质网是自噬体膜的来源之一 [
完整的双层膜自噬体形成后,将内容物运送到溶酶体以完成最终的降解过程。来自酵母的研究结果显示,Atg8从自噬体外膜释放可作为它解聚自噬发生的起始因子进而准备融合的信号 [
溶酶体是细胞内降解蛋白质、脂质、糖类和核酸等的重要细胞器。各种来源的物质(胞外、细胞表面或胞内的底物)通过胞内一些相互关联的运输途径运送到溶酶体进行降解,其终末产物被循环利用。溶酶体功能受损将阻断各种底物的降解,导致废物大量堆积,引起溶酶体病变。
自噬体和溶酶体均是膜包裹的能够行使独立功能的细胞器,自噬体分布相对随机,而溶酶体常位于细胞核附近的中心位置。因此,自噬体要与它们融合,先要运动到它们所在的位点,这个过程受到细胞内骨架蛋白及相关马达动力蛋白的调控 [
大量的研究证明,在饥饿条件下,自噬体形成显著增多。这一过程主要由MTOR信号通路的调控。
MTOR复合体1 (MTORC1)由MTOR、RAPTOR (regulatory-associated protein of MTORC1),MLST8/GbL (mammalian lethal with Sec13 protein 8/G protein subunitblike),DEPTOR (DEP-domain-containing and MTOR-interactive protein)和PRAS40 (proline-rich AKT substrate of 40 kDa)组成,参与自噬的负调控。MTORC1可被RAPA (Rapamycin)显著抑制。正常情况下,RAPA抑制MTORC1能有效诱导自噬,表明MTOR负调控自噬。胞外氨基酸通过SLC1A5和SLC7A5氨基酸运输载体转运入胞内,MTORC1能直接感受氨基酸进入,且被磷酸化修饰 [
AMPK信号通路感应细胞内能量。胞内ATP/AMP下降时,LKB1激酶被激活进而激活AMPK。活化的AMPK使TSC1/2复合体磷酸化激活,活化的TSC1/2通过RHEB 来抑制MTOR从而激活自噬 [
图2. 细胞自噬的信号调控
氧化应激:ROS能够诱导细胞自噬。产生ROS的主要场所是线粒体,而高水平的ROS也会损伤线粒体或其它细胞器,进一步增加自噬的产生。一些化合物可抑制线粒体电子传递链,诱导ROS产生和自噬性细胞死亡 [
自噬蛋白需要翻译后修饰的调节。磷酸化作用是迄今为止研究最为广泛的翻译后修饰,然后是泛素化和乙酰化作用。最近的研究发现自噬蛋白还有糖基化修饰和硫醇残基氧化还原反应调节。蛋白的翻译后修饰在蛋白结构、定位、活性和功能上起重要作用,如磷酸化作用可以调节催化活性及蛋白与蛋白的相互作用;糖基化作用能保证蛋白的正确折叠,泛素化作用参与信号降解,脂化则能使蛋白嵌入脂质膜 [
磷酸化作用是将一个磷酸基团插到丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上,改变蛋白构造、活性和蛋白与蛋白相互作用 [
MTORC1磷酸化抑制自噬:最有特征性的自噬调节子之一是MTOR (mammalian target of rapamycin)。在营养丰富情况下,MTORC1处于磷酸化状态,进而介导ULK1在758位丝氨酸磷酸化,抑制其活性。ULK1/ATG1复合体也包括FIP200/ATG17 (focal adhesion kinase (FAK) family interacting protein of 200 kDa)和ATG101。细胞应激(如缺氧或营养剥夺)时,细胞内MTORC1蛋白激酶复合物被抑制,从而失去了对ULK1 蛋白的抑制作用,导致ULK1蛋白激酶的自身磷酸化激活,活化的ULK1激酶磷酸化它的伙伴ATG13和FIP200,参与自噬体的形成 [
AMPK和AKT调节MTORC1:作为自噬起始的主要调节子,MTORC1活性受多种上游信号通路调节。主要信号通路之一是AKT/AMPK (AMP-activated protein kinase)级联酶反应。AMPK (AMP activated protein kinase)是细胞能量传感器,能量缺失能够使LKBl (1iver kinase B1)磷酸化AMPK,然后AMPK磷酸化TSC2 (Tuberous sclerosis complex 2)。TSC2是一个含有GTP酶活化蛋白(GAP) domain的蛋白,能使 Rheb GTPase失活,抑制MTORC1的活性。最近,AMPK被证实直接磷酸化RAPTOR,RAPTOR是另一个MTORC1复合体蛋白,在能量应激时使MTORC1完全失活 [
另一方面,PI3K class I (PI3KI)通过合成phosphatidylinositol-3,4-diphosphate (PI-3,4-P2)和phosphatidyl-inositol-3,4,5-trisphosphate (PI-3,4,5-P3),招募含有Pleckstrin Homology (PH) domain的蛋白如3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1)或它的下游靶标AKT,反过来激活MTORC1,抑制细胞自噬,发挥负向调节自噬过程的作用 [
磷酸化作用调节BECN1/PIK3C3复合物:在哺乳动物细胞中,PIK3C3/VPS34与P150 (PI3-kinase P150 subunit)/VPS15和BECN1 (coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein 1)/ATG6相互作用 [
磷酸化作用调节ATG9:与其它的ATG蛋白不同,ATG9是位于PAS上的跨膜蛋白 [
磷酸化作用调节ATG8/LC3:LC3 (microtubule associated protein-light chain 3)在哺乳动物细胞的类似物GABARAP (gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein)和GABARAPL2/GATE-16,它们与ULK1/ATG1相互作用对囊泡运输和神经元的延伸有重要作用 [
磷酸化作用调节SQSTM1/p62、ATG29和ATG31:SQSTM1 (sequestosome 1)/p62在ubiquitin-associated (UBA) domain Ser403位点被casein kinase 2 (CK2)磷酸化 [
参与线粒体自噬的蛋白磷酸化:线粒体自噬(mitophagy)对线粒体的质量控制是非常重要的,它受多个蛋白和通路调节 [
除了PINK1和PARKIN的参与,去极化的线粒体也能独立地招募ATG9A和ULK1起始phagophore的形成,在招募LC3之前,招募WIPI-1、ATG14、ZFYVE1和ATG16L1,促进隔离膜的延伸。然而,ULK1激酶的底物在这个过程中未被证实 [
溶酶体膜上TFEB的磷酸化:除了在自噬的起始过程中发挥重要作用,MTORC1还会与TFEB (transcription factor EB)相互作用,从而参与溶酶体循环。在正常条件下,MTORC1与TFEB在溶酶体膜上共定位,并且MTORC1可以磷酸化TFEB而阻止它运输到核。在饥饿条件下,MTORC1被抑制,因而释放TFEB转位到核以活化参与溶酶体生成和自噬的基因,包括LC3B、WIPI、ATG9B和SQSTM1 [
除了被磷酸化修饰,丝苏氨酸残基也能被O-linked attachment of b-N-acetyl-glucosamine (O-GlcNAc)修饰。与经典的O-和N-连接的糖基化不同,经典的糖基化受限在内质网和高尔基体上,而O-GlcNAcylation发生在细胞核、细胞浆和线粒体蛋白。目前约有1000多个蛋白以O-GlcNAc乙酰葡糖胺为靶点,在调节蛋白酶体活性 [
Uridine-diphosphate-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc)是O-GlcNAcylated蛋白形成的重要糖供者。O-GlcNAc转移酶(OGT)催化O-GlcNAcylated蛋白,O-GlcNAcylation 蛋白的总体水平受精确调节,其产生由OGT催化,其去除β-N-acetylglucosaminidase (OGA)催化。既然丝苏氨酸残基既是糖基化也是磷酸化的靶点,对于它们来说完成一种修饰后再完成另一种修饰是完全有可能的,然而,越来越多的证据表明在两种修饰之间存在复杂的相互作用。例如,减少OGA的280位点磷酸化,升高148位点磷酸化,可使细胞中O-GlcNAc水平增多 [
而O-GlcNAc水平的改变最常见的是与慢性疾病相关,如糖尿病和癌症。现在比较明确的是O-GlcNAc对哺乳动物细胞的生存能力是非常重要的,依据OGT或OGA缺陷小鼠能引起胚胎致死 [
在神经退行性疾病的哺乳动物细胞和啮齿类动物模型中,OGA在神经元和人类大脑中mRNA和蛋白水平上都呈现高表达 [
自噬体膜的延伸涉及了自噬蛋白ATG8/LC3和ATG12的泛素样反应。E1样蛋白ATG7激活ATG8/LC3和ATG12,然后分别通过E2样蛋白ATG3和ATG10,分别与 phosphatidylethanolamine (PE)和ATG5结合。在一个类似E3样活性的过程中,ATG16 与ATG12-ATG5结合并刺激ATG8/LC3-PE结合。泛素化作用,通过结合8-kDa泛素到蛋白的赖氨酸残基,能调节自噬活性。MTORC1调节子DEPTOR、ULK1、BCL-2、BECN1和BNIP1能被泛素化。在富含生长因子的条件下SCF (Skp-cullin-F-box protein)泛素化DEPTOR,抑制DEPTOR,释放MTORC1,减少自噬 [
UBR4 (Ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 4)是内胚层派生的,在卵黄囊的自噬激活细胞中高表达,在胚胎发育中有重要作用。证据显示UBR4促进细胞内细胞器和大分子被递送到自噬体,但UBR4的底物有哪些分子,以及它的泛素连接酶活性在这个过程中的发生机制目前还不明确 [
核糖体自噬(ribophagy)是在饥饿状态时,依赖LTN1 (一个60S核糖体相关的E3连接酶)的迅速减低,随后引起核糖体蛋白RPL25泛素化减少的过程 [
线粒体自噬(mitophagy)也被PARKIN介导的泛素化调节 [
有证据表明,在应对线粒体膜的去极化时,包括TOM20和FIS1在内的线粒体蛋白池会被PARKIN和泛素化蛋白酶体介导的机制所降解,这两种机制在线粒体自噬中都有重要作用 [
泛素化结合蛋白借助其LIR在运送泛素化蛋白到自噬体的过程中发挥重要作用。这些泛素化结合蛋白包括SQSTM1/p62、NBR1 (neighbor of BRCA1 gene 1)、组蛋白脱乙酰酶6 HDAC6 (histone deacetylase 6)、NDP52 (the nuclear dot protein 52 kDa)和视神经蛋白OPTN (optineurin) [
自噬途径的调节组分也被赖氨酸乙酰化作用所调控。营养饥饿迅速地耗尽乙酰辅酶A,导致下游胞浆蛋白乙酰化,与自噬的增强相关 [
饥饿诱导的微管高度乙酰化也促进自噬和细胞存活。在这种情况下,微管高度乙酰化由a-微管蛋白乙酰转移酶a-tubulin acetyltransferase-1 (aTAT-1/MEC-17)介导,其活性由p-300抑制,由AMPK激活 [
自噬蛋白的乙酰化在自噬流中也发挥重要作用。乙酰转移酶p-300可以乙酰化 ATG5、ATG7、LC3和ATG12蛋白,从而抑制自噬 [
Liu W科研团队报道 [
SIRT1 (哺乳动物去乙酰酶)可以去乙酰化几种ATG蛋白,如ATG5、ATG7和LC3。SIRT1缺失能引起自噬损伤导致SQSTM1/p62水平升高和自噬体形成抑制 [
靶蛋白的翻译后修饰也能调节它们的自噬性清除。HDAC1的抑制或CBP介导的乙酰化的激活显示突变的HUNTINTIN(HTT)的乙酰化增多、清除增多以及神经毒性减少 [
氧化还原反应敏感蛋白在半胱氨酸残基上(R-SH)有高度反应的硫醇组 [
PARKIN半胱氨酸(Cys59、Cys95和Cys182)也能被H2S所修饰,导致疏水合作用sulfhydration,能拮抗相同残基的致病性亚硝化作用,竞争性提高PARKIN活性和神经保护性效应 [
自噬蛋白的翻译后修饰在细胞自噬过程中发挥重要作用。作为大部分包含可修饰的丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸或半胱氨酸残基的蛋白,在应对营养缺乏、生长因子剥夺、高氧、低氧等应激状态下,常会发生辅助修饰,从而决定生物学活性。这方面的研究还有许多问题有待阐明,如在自噬蛋白中翻译后修饰是如何影响经典自噬或选择性自噬流的,翻译后修饰的细胞、组织特异性调节是如何获得的。理解自噬蛋白中哪个氨基酸残基被修饰,以及证实这些修饰氨基酸在相关疾病的表达状态,将会为疾病的诊断和治疗提供重要的靶点 [
本研究由国家自然科学基金项目(81702776);山东省高等学校科技计划项目(J17KA238);山东省医药卫生科技发展计划项目(2016WS0569)资助。
夏 丹. 细胞自噬调控的研究进展Advances in the Regulation of Autophagy[J]. 临床医学进展, 2019, 09(03): 163-179. https://doi.org/10.12677/ACM.2019.93027