采用划线分离法从天女木兰外植体培养基中分离污染菌株,用16S rDNA序列对污染菌株进行核酸分类学鉴定,运用MEGA7.0软件中NJ树法对天女木兰组培污染菌进行聚类分析。结果:从天女木兰组培培养基中分离出95株污染菌,天女木兰污染菌Shannon指数(H e’)值为1.91,存在明显优势菌群,绝大多数为革兰氏阴性菌。污染菌大多数在进化上较为接近。结论:天女木兰组培污染菌多样性较低,以革兰氏阴性菌为主,在污染菌控制上可重点参考革兰氏阴性菌的抑菌方法。 Contaminant bacteria were isolated from the tissue culture medium of Magnolia sieboldii using streak plate method. Strains were identified using 16S rDNA sequencing analysis. Then cluster analysis was performed by NJ tree method in MEGA7.0 software. Results: 95 strains were isolated from the tissue culture medium of Magnolia sieboldi. Shannon index (H e’ ) of flora is 1.91. Most strains were gram-negative bacteria. Those strains were close in evolution relationship. Conclusion: The diversity of contamination bacteria of Magnolia sieboldii was lower, most belongs to gram-negative bacteria. So the control strategy of gram-negative bacteria could be used in con-taminant of Magnolia sieboldii tissue culture.
郑小平,唐薇,尹靖琨,马一宁,陈露,杨影,王瑞俭,王欢*
北华大学林学院,吉林
收稿日期:2019年4月24日;录用日期:2019年5月8日;发布日期:2019年5月15日
采用划线分离法从天女木兰外植体培养基中分离污染菌株,用16S rDNA序列对污染菌株进行核酸分类学鉴定,运用MEGA7.0软件中NJ树法对天女木兰组培污染菌进行聚类分析。结果:从天女木兰组培培养基中分离出95株污染菌,天女木兰污染菌Shannon指数(He’)值为1.91,存在明显优势菌群,绝大多数为革兰氏阴性菌。污染菌大多数在进化上较为接近。结论:天女木兰组培污染菌多样性较低,以革兰氏阴性菌为主,在污染菌控制上可重点参考革兰氏阴性菌的抑菌方法。
关键词 :天女木兰,组织培养,污染菌,鉴定,多样性
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在植物组织培养过程中,菌类污染是经常遇到并难以解决的问题之一。污染率过高,会导致生产成本增加,浪费人力、物力和财力。因此如何控制污染,把污染率降低到可以接受的范围是组培工厂化生产亟待解决的问题。
目前,关于植物组织培养污染的研究主要集中在污染的原因及防控措施方面。采用一种或几种抗生素混合溶液对外植体进行预处理可以有效减少一些植物组培污染,但有些种类抗生素不利于试管苗的生长分化 [
关于植物组织培养过程中的菌类污染种类的鉴定研究较少。周俊辉等以组培实验室中污染的组培苗为材料,进行污染菌的分离纯化,经纯菌培养镜检得出引起组培苗污染的菌类主要是棒杆菌属、曲霉属、肠杆菌属、地霉属、葡萄球菌属、毛霉属和根霉属。并通过实验得出庆大霉素对细菌的抑制能力较青霉素、四环素强 [
天女木兰(Magnolia sieboldii K. Koch)是集观叶、赏花、赏果于一体的珍稀濒危植物 [
试验材料采自吉林农业科技学院种植园。于5月、6月晴天的午后,采集当年萌发的幼嫩或半木质化天女木兰枝条。采集的枝条处理:流水冲洗1 h,洗洁精溶液浸泡20 min,0.1% HgCl2消毒7 min,无菌水冲洗6次。
1) B5培养基母液的配制
按照B5培养基的配方,分别配制B5大量元素母液(10倍),B5微量元素母液(200倍),B5铁盐母液(200倍)与B5有机物质母液(100倍)。各种化学试剂充分溶解,然后用容量瓶准确定容,最后移入试剂瓶中,贴好标签,放在4℃冰箱中保存待用。
2) 生长调节物质母液的配制
先用少量1 mol/L NaOH溶解生长素IBA,再用温热的蒸馏水定容配成0.5 mg/mL IBA母液;用少量1 mol/L HCL溶解细胞分裂素6-BA,再用温热的蒸馏水定容配成0.5 mg/mL 6-BA母液备用。
3) B5固体培养基的配制
琼脂粉6 g、蔗糖30 g,加水约800 ml,加热溶解。按照大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物质母液和植物生长调节物质母液的顺序分别加入100 mL、5 mL、5 mL、10 mL,再加入6-BA母液2 mL,IBA母液0.6 mL,定容至1000 ml,用1 mol/L NaOH溶液调pH = 5.8。高压蒸汽灭菌后备用。
将枝条剪成1 cm左右的带芽茎段接种在B5 + 1.0 mg/L6-BA + 0.3 mg/L IBA培养基,放在培养室内培养15 d。培养条件为:培养温度(23 ± 2)℃,光照强度1500 lx,光照时间10~12 h/d。
组培瓶中出现污染现象时,对染菌瓶进行编号、拍照并记录各菌落特征,在无菌环境下取污染菌在LB固体培养基上划线分离,在28℃倒置培养1~2 d。取单菌落用YMA固体培养基划线纯化3次,得到纯化菌株。
1) 细菌DNA提取
取各菌株单菌落于5 mL LB液体培养基中培养过夜,取菌液200 μL,12,000 r离心2 min,弃上清,沉淀加100 μL 0.2% SDS,涡旋混匀,100℃处理10 min,12,000 r离心5 min,上清中含菌株的基因组DNA。
2) PCR扩增与检测
以提取的细菌基因组DNA为模板,用16S rDNA通用引物进行PCR扩增。上游引物均为BSF8 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),下游引物1:BSR1541 (5’-AAGCAGGTCATCCAGCCGCA-3’) [
3) 16S rDNA片段的序列测定
将扩增效果良好的PCR产物委托上海美吉生物技术公司进行DNA序列测定,测序引物为PCR扩增用引物。
4) DNA序列整理及分析
测序结果经MEGA7.0软件去除无用序列后,递交在线NCBI核酸数据库分析,对各菌株进行核酸分类学鉴定。根据与数据库中已知菌株16S rDNA序列同源性确定菌株的种属。用Excel (BiodixcelforExcel2007.xlsx [
采用划线分离法,从30瓶天女木兰组培污染样本中分离、纯化出105株菌,采用细菌16S rDNA序列核酸分类法从中鉴定了95株菌,其中引物BSF8-BSR1541鉴定出34株菌,引物BSF8-Mlb16鉴定出61株菌。从污染菌种类上看,天女木兰污染以银耳假单胞菌(29株)、丁香假单胞菌(21株)、柠檬酸菌(15株)为主,其中假单胞菌类约占60%,绝大多数为革兰氏阴性菌(表1)。
引物 | 菌株 | 数量 | 基因ID | 拉丁名 | 中文名 | 相似度(%) | 革兰氏染色 |
---|---|---|---|---|---|---|---|
BSF8-BSR1541 | B2B25 | 4 | KU738958.1 | Enterobacteriaceae bacterium | 肠杆菌 | 97.95 | G- |
B2H25 | 2 | KR010982.1 | Pantoea agglomerans | 成团泛菌 | 98.29 | G- | |
B5X25 | 20 | MH884040.1 | Pseudomonas sp. | 丁香假单胞菌 | 100.00 | G- | |
B8-45 | 1 | LT962480.1 | Pseudomonas syringae pv. | 丁香假单胞菌 | 98.30 | G- | |
B12-35 | 1 | MF077144.1 | Pseudomonas cichorii | 菊苣假单胞菌 | 100.00 | G- | |
B111 | 5 | MH686062.1 | Methylobacterium sp. | 甲基杆菌 | 99.42 | G- | |
B114 | 1 | MH379725.1 | Stenotrophomonas maltophilia | 嗜麦芽窄食单胞菌 | 99.88 | G- | |
BSF8-Mlb16 | M10-17 | 29 | MK517637.1 | Pseudomonas tremae | 山黄麻假单胞菌 | 100.00 | G- |
M12-17 | 5 | MF943243.1 | Pseudomonas cichorii | 菊苣假单胞菌 | 100.00 | G- | |
M2B17 | 15 | CP011132.1 | Citrobacteramalonaticus | 柠檬酸菌 | 99.28 | G- | |
M2H17 | 5 | MH101508.1 | Pantoea agglomerans | 成团泛菌 | 100.00 | G- | |
M111 | 1 | MH686062.1 | Methylobacterium sp. | 甲基杆菌 | 99.48 | G- | |
M114 | 5 | CP031741.1 | Stenotrophomonas sp. | 短食单胞菌 | 100.00 | G- | |
M123 | 1 | AP018587.1 | Staphylococcus caprae | 山羊葡萄球菌 | 100.00 | G+ |
表1. 天女木兰组培污染菌的鉴定
天女木兰污染菌的多样性分析结果表明,污染菌优势度较高(Berger-Parker指数(d)),说明污染菌中有明显优势菌群,本文中鉴定的菌株中超过半数为假单胞菌属。污染菌总体丰富度并不太高,Margalef指数(dMa)为1.98,说明天女木兰污染菌来源并不是很多。Simpson指数(λ)值较低为0.18,说明污染菌群中优势菌群数量较多。污染菌整体群落多样性较低,Shannon指数(He')值为1.91,说明污染菌的来源并不复杂,在控制上相对较为容易。群落的均匀程度Pielou指数(Je)值为0.83,说明各菌群分布不均匀,存在某些优势或数量极少的种群(表2)。
Berger-Parker指数(d) | Margalef指数(dMa) | Simpson指数(λ) | Shannon指数(He') | Pielou指数(Je) |
---|---|---|---|---|
3.28 | 1.98 | 0.18 | 1.91 | 0.83 |
表2. 天女木兰组培污染菌的多样性分析
应用MEGA7.0软件对天女木兰组培污染菌进行聚类分析,结果见图1。分析显示,天女木兰的95株污染菌,基本上按扩增引物不同分成两枝。比较特殊的是BSF8-BSR1541组的菌株B8-45 (丁香假单胞菌),其序列在进化上与BSF8-Mlb16组更接近(图1)。
图1. 天女木兰组培污染菌的聚类分析图
从天女木兰茎段外植体组织培养过程中分离纯化了95株污染菌株。多样性分析结果表明,天女木兰组培污染菌多样性较低,且存在明显优势菌群,在种群分布上不平衡,均一性较差,提示天女木兰污染菌种类较少,且主要为少数几类菌,因此,其组培污染菌在控制上难度相对较低。只要采取针对主要污染菌的抑制措施就能大幅度降低其污染机率。
天女木兰组培污染菌绝大多数为革兰氏阴性菌,该类细菌细胞壁中含较多脂类,因此在外植体样本处理时,用乙醇配合消毒剂使用,可能提高消毒剂作用效果,从而降低组培过程中的污染机率。另外,在培养基中可以考虑加入氨基糖苷类、利福霉素类和多黏菌素等对革兰氏阴性菌效果较好的抗生素,可进一步降低染菌机率。
天女木兰组培污染菌中除B8-45外,大多数在进化上较为接近,提示其污染的控制方法也大致相同。在实际中可参考革兰氏阴性菌的抑菌方法,可有效降低天女木兰组培染菌机率。
北华大学大学生创新创业训练计划项目(201711923241),吉林省科技发展计划项目(20180201006NY)。
郑小平,唐薇,尹靖琨,马一宁,陈露,杨影,王瑞俭,王欢. 天女木兰组培污染菌的鉴定及多样性分析Identification and Diversity Analysis of Contaminant Bacteria in Tissue Culture of Magnolia sieboldii[J]. 自然科学, 2019, 07(03): 153-158. https://doi.org/10.12677/OJNS.2019.73022