为了解重庆大鲵嗜水气单胞菌对几种动物的致病性和对美蛙组织脏器的损害以及对常用药物的敏感性,从患病死亡大鲵体分离鉴定两株菌TG-2,TG-5,用16srRNA测序,并使用BIOFOSUN-GN-48鉴定板条测定生化特性;接种鲫鱼、小鼠和美蛙及药敏试验,结果显示2株菌均为嗜水气单胞菌。TG-5能使鲫鱼死亡70%,蛙死亡40%,小白鼠死亡100%。TG-2能使鲫鱼死亡80%,蛙死亡70%,小白鼠死亡100%;组织病理观察显示,蛙肝组织坏死严重,肝细胞质溶解,出现空泡变性,细胞核碎裂,肝索分布紊乱,肝血窦扩张,肾间质血管充血、出血,肾小囊腔扩张,上皮细胞肿大,空泡变性,肾小管腔内有蛋白物渗出;21种药物药敏试验结果表明,TG-2对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、米诺环素、头孢他啶、多粘菌素B高度敏感,TG-5对多粘菌素B、头孢他啶、敏感。其他且呈现出较强耐药性。 In order to understand the pathogenicity of Aeromonas hydrophila from giant salamander in Chongqing to several animals and damage to organs of the American frog tissue and sensitivity to commonly used drugs, two strains of TG-2, TG-5 were isolated and identified from dead giant salamander. Biochemical characteristics were determined by 16srRNA sequencing and BIOFOSUN-GN-48. Squid, mouse and frog were inoculated, and drug susceptibility test was made. The results showed that all of the 2 strains were Aeromonas hydrophila. TG-5 killed 70% of cru-cian carp, 40% of frogs and 100% of white mice. TG-2 killed 80% of crucian carp, 70% of frogs and 100% of white mice. Histopathological observation showed that the frog’s liver tissue was severely necrotic; hepatocytoplasmic lysis and vacuolar degeneration occurred; cell nucleus fragmented; distribution of hepatic cord was disordered; hepatic sinus dilated; hyperemia was found in the kidney mesenchyme; renal capsule dilated; epithelial cells were enlarged; vacuolar degeneration was observed; and there was a protein exudation in the renal tubules. The results of 21 drug sensitivity tests showed that TG-2 was highly sensitive to cefoperazone, ceftriaxone, ceftazidime, minocycline, ceftazidime, and polymyxin B. TG-5 was sensitive to polymyxin B, ceftazidime, and ceftazidime. Others showed strong resistance.
余秋寒,李娴妍,蔡浪花,沙莎
西南大学动物科学学院,重庆
收稿日期:2019年5月21日;录用日期:2019年6月3日;发布日期:2019年6月10日
为了解重庆大鲵嗜水气单胞菌对几种动物的致病性和对美蛙组织脏器的损害以及对常用药物的敏感性,从患病死亡大鲵体分离鉴定两株菌TG-2,TG-5,用16srRNA测序,并使用BIOFOSUN-GN-48鉴定板条测定生化特性;接种鲫鱼、小鼠和美蛙及药敏试验,结果显示2株菌均为嗜水气单胞菌。TG-5能使鲫鱼死亡70%,蛙死亡40%,小白鼠死亡100%。TG-2能使鲫鱼死亡80%,蛙死亡70%,小白鼠死亡100%;组织病理观察显示,蛙肝组织坏死严重,肝细胞质溶解,出现空泡变性,细胞核碎裂,肝索分布紊乱,肝血窦扩张,肾间质血管充血、出血,肾小囊腔扩张,上皮细胞肿大,空泡变性,肾小管腔内有蛋白物渗出;21种药物药敏试验结果表明,TG-2对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、米诺环素、头孢他啶、多粘菌素B高度敏感,TG-5对多粘菌素B、头孢他啶、敏感。其他且呈现出较强耐药性。
关键词 :嗜水气单胞菌,分离鉴定,病理切片,药敏试验
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http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
中国大鲵(Andrias davidianus)属脊椎动物两栖纲,有尾目,隐鳃鲵科,鲵属,野生中国大鲵是我国特有的珍稀两栖动物,列为国家二级保护动物,还在科研、教学及物种进化研究等方面有着重要的科学意义。而人工养殖大鲵具有极高的营养及药用价值 [
本次研究着重从重庆某大鲵养殖基地爆发大鲵腐皮病病原着手,通过从病死大鲵患病部位分离细菌,纯化,对其进行表型、分子鉴定,药敏试验,鲫鱼、美蛙、小鼠致病试验和美蛙病理切片制作观察。了解病原体对几种动物的致病性和病原体对药物的敏感性,并从病原体感染美蛙的病理组织观察研究大鲵源致病菌对美蛙组织的侵害与大鲵组织的病理变化是否相同,探讨美蛙作为两栖类水生动物用于大鲵病原菌感染研究的可行性。研究结果以期对大鲵的科学养殖、合理用药提供科学依据,对重庆地区大鲵养殖业的健康持续发展和大鲵细菌病实验室研究存在着重要意义。
病鲵:重庆某养殖场送检患腐皮病大鲵。健康鲫鱼:重庆荣昌双河某鱼苗养殖中心80尾,平均体长15 cm/尾;健康美蛙:重庆某养殖场40尾,平均体重160 g/尾。小白鼠:购自西南大学荣昌校区动物科提供昆明系小鼠20只,平均体重18 g/只。
麦康凯琼脂、克氏双糖铁琼脂、胰蛋白胨、酵母提取物等购自北京奥博星生物技术有限公司;裂解上清液、Premix Taq (Ex Taq Version 2.0)、Forward Primer (1 × 10−8 mmol/μL)、Reverse Primer (1 × 10−8 mmol/μL)、dH2O,购自上海生工生物技术服务有限公司;药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司;BIOFOSUN自动生化鉴定仪器(上海复星医学科技发展有限公司)/(地点:重庆市璧山区动物疾病预防控制中心)。
从病死大鲵、肝、脾、胰、肾、肌肉病灶等分离接种至LB培养基平板上,28℃培养24 h~48 h。取优势菌纯化,记录并编号TG1、TG2…TGn,保存备用。纯化菌进行革兰氏染色、氧化酶试验、麦康凯培养、溶血试验、过氧化氢试验、克氏双糖等培养特性检测。
将健康鲫鱼置于大塑料桶中暂养4天,按分离菌数分组,分为试验组、生理盐水对照组、空白对照组,每组10尾。将分离菌分别接种于LB肉汤中,28℃培养24 h,麦氏比浊,将菌液稀释至6×108 cfu/ml,分别对试验组鲫鱼胸鳍肌肉注射接种0.2 ml/尾 [
用PCR扩增16SrRNA和BIOFOSUN生化系统鉴定对分离的可致鲫死亡的致病菌TG-2、TG-5进行鉴定。采用TAKARA公司50 μl反应体系,将TG-2、TG-5菌培养好的单独菌落勾入50 μl的裂解液,提取基因模板,加入引物,在PCR仪中扩增,琼脂糖明胶中电泳。确保基因组提出后将产物送往上海生工生物技术有限公司,对PCR产物进行测序。在NCBI上将测序后的待测菌序列与数据库上的所有序列进行比对,再使用DNASTAR中的Megalign进行进化树的构建,从而鉴定出菌的种类。按操作要求将TG-2、TG-5菌液加入BIOFOSUN-GN-48生化系统鉴定板条,28℃培养24 h,BIOFOSUN微生物鉴定药敏分析仪读取板条,分析报告结果。
用K-B纸片法 [
将致病菌接种于LB肉汤中28℃培养24 h,按麦氏比浊管将菌液稀释至2.4 × 109 cfu/ml [
将致病菌接种于LB肉汤中28℃培养24 h,按照麦氏比浊管将菌液稀释至1.5 × 109 cfu/ml [
从患病死亡大鲵病灶肌、肝、脾、胰、肾部分离出优势生长株菌,进一步对其进行革兰氏染色、氧化酶试验、麦康凯培养、溶血试验、过氧化氢试验、克氏双糖铁试验等生化及生理学特征检测,获得6株菌。将其编号为TG-1、TG-2、TG-3、TG-4、TG-5、TG-6 (表1)。
项目 | 菌株 | |||||
---|---|---|---|---|---|---|
TG-1 | TG-2 | TG-3 | TG-4 | TG-5 | TG-6 | |
革兰染色 | − | − | − | − | − | − |
氧化酶 | + | + | + | + | + | − |
麦康凯 | + | + | + | + | + | + |
溶血 | − | β | − | − | α | − |
过氧化氢 | + | + | + | + | + | + |
克氏双糖铁 | K/A(−) | K/A(+) | K/A(−) | K/K(−) | K/A(−) | K/K(−) |
表1. 病原菌的培养特性
注:K/A为分解葡萄糖,不分解乳糖,K/K为不分解葡萄糖与乳糖,(+)为产气,(−)为不产气。
TG-5菌株组死亡鲫鱼体表出血,眼球充血突出,剖检可见血性腹水,肝胰脏颜色变浅,肠道粘膜层充血发红。TG-2菌株组死亡鱼体出血严重,眼球充血突出,鳞片部分掉落。剖检可见大量血性腹水,血水偏黑色,肝胰脏出血,肠道粘膜层充血发红,肌肉组织稍有溃烂。其他几株菌的试验组及对照组无死亡,结果显示TG-2与TG-5菌为致病菌(表2)。
将TG-2、TG-5菌株基因组进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳后显示目的条带大小约为1500 bp (见图1),经上海生工生物工程技术服务有限公司测序,得到大小为1453 pb、1448 pb的序列。将检获得的测序列在NCBI上比对和数据分析。TG-2与TG-5的序列覆盖度最高为99%,TG-2与TG-5的99%的序列的相似度为99%。将NCBI上TG-2与TG-5比对的基因序列在DNASTAR的Megalign进行同源性比对(见图2)。若16SrRNA全长的同源性 ≥ 99%,为同种细菌。若在97%~98.9%,一般为同属不同种。若 < 95%,则为不同属 [
TG-2与TG-5的最高同源性菌均为KC202278.1号菌,达98.9%、98.5%。TG-2和TG-5的同源性略有不同,其进化树不在一个分支上。综合数据分析为:TG2与TG5均为变形菌门(Proteobacteria),变形菌纲(Proteobacteria),气单胞菌目(Aeromonas),气单胞菌科(Aeromonadaceae),气单胞菌属(Aeromonas)中的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。
组别 | 剂量(ml) | 菌株 | 感染尾数 | 每天死亡情况(d) | 死亡率 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | 2 | 3 | 4 | 5-10 | |||||
试验组 | 0.2 | TG-1 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% |
TG-2 | 10 | 6 | 4 | 0 | 0 | 0 | 80% | ||
TG-3 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% | ||
TG-4 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% | ||
TG-5 | 10 | 5 | 3 | 0 | 0 | 0 | 70% | ||
TG-6 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% | ||
对照组 | 0.2 | 生理盐水 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% |
空白组 | 0 | 无 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% |
表2. 鲫鱼致病性试验结果
图1. TG-2、TG-5菌株的16SrRNA PCR扩增结果
图2. TG-2、TG-5的16SrRNA基因序列系统发育树
致病菌TG-2、TG-5均为革兰阴性需氧菌,所以采用BIOFOSUN革兰阴性需氧菌鉴定板,将其培养了24 h后使用BIOFOSUN微生物鉴定药敏分析仪读取板条(见表3、表4、表5)。根据BIOFOSUN-GN48鉴定板说明书 [
底物 | 判定 | 底物 | 判定 |
---|---|---|---|
水 | − | 蚁酸 | + |
土温80 | + | α-羟基丁酸 | − |
N-乙酰基-D-半乳糖胺 | V+ | β-羟基丁酸 | − |
树胶醛糖 | V+ | γ-羟基丁酸 | − |
D-阿糖醇 | − | P-羟基苯乙酸 | − |
D-纤维二糖 | − | D,L-乳酸 | + |
D-果糖 | + | 丙二酸 | − |
D-半乳糖 | V+ | 砂糖酸 | − |
α-D-葡萄糖 | + | 酮戊二酸 | + |
甘油 | + | L-丙氨酸 | + |
α-D-乳糖 | − | L-丙氨酰-氨基乙酸 | + |
麦芽糖 | + | L-天冬酰胺酸 | + |
D-甘露醇 | + | L-谷氨酸 | + |
D-蜜二糖 | − | L-组氨酸 | + |
β-甲基-D-葡糖苷 | V+ | 羟基-L-脯氨酸 | V− |
D-阿洛酮糖 | + | L-亮氨酸 | − |
D-棉子糖 | − | L-焦谷氨酸 | − |
D -山梨醇- | I | D-丝氨酸 | V+ |
蔗糖 | + | γ-氨基丁酸 | − |
松二糖 | − | 肌苷 | + |
丙酮酸甲基脂 | + | 胸腺嘧啶脱氧核苷 | + |
琥珀酸单脂 | I | 腐胺 | + |
顺式乌头酸 | − | D,L-α-甘油磷酸盐 | + |
柠檬酸 | − | α-D-葡萄糖-1-磷酸盐 | + |
表3. TG-2 BIOFOSUN GN-48鉴定结果
注:“+”为阳性,“−”为阴性,“V+”为不相称阳性,“V−”为不相称阴性,“I”为中界。
底物 | 判定 | 底物 | 判定 |
---|---|---|---|
水 | − | 蚁酸 | − |
土温80 | V− | α-羟基丁酸 | − |
N-乙酰基-D-半乳糖胺 | + | β-羟基丁酸 | − |
树胶醛糖 | + | γ-羟基丁酸 | − |
D-阿糖醇 | − | P-羟基苯乙酸 | − |
---|---|---|---|
D-纤维二糖 | − | D,L-乳酸 | + |
D-果糖 | + | 丙二酸 | − |
D-半乳糖 | + | 砂糖酸 | − |
α-D-葡萄糖 | + | 酮戊二酸 | − |
甘油 | + | L-丙氨酸 | V− |
α-D-乳糖 | − | L-丙氨酰-氨基乙酸 | − |
麦芽糖 | + | L-天冬酰胺酸 | + |
D-甘露醇 | + | L-谷氨酸 | + |
D-蜜二糖 | − | L-组氨酸 | + |
β-甲基-D-葡糖苷 | + | 羟基-L-脯氨酸 | − |
D-阿洛酮糖 | + | L-亮氨酸 | − |
D-棉子糖 | − | L-焦谷氨酸 | − |
D -山梨醇- | − | D-丝氨酸 | + |
蔗糖 | + | γ-氨基丁酸 | − |
松二糖 | − | 肌苷 | + |
丙酮酸甲基脂 | V− | 胸腺嘧啶脱氧核苷 | V− |
琥珀酸单脂 | V− | 腐胺 | − |
顺式乌头酸 | − | D,L-α-甘油磷酸盐 | + |
柠檬酸 | − | α-D-葡萄糖-1-磷酸盐 | + |
表4. TG-5 BIOFOSUN GN-48鉴定结果
注:“+”为阳性,“−”为阴性,“V+”为不相称阳性,“V−”为不相称阴性,“I”为中界。
菌株 | 种类 | 概率 | 相似指数 | 距离指数 |
---|---|---|---|---|
TG-2 | 类嗜水气单胞菌DNA第二组 | 61% | 0.520 | 2.131 |
嗜水气单胞菌DNA第一组 | 39% | 0.334 | 2.278 | |
豚鼠气单胞菌DNA第四组 | 0% | 0.000 | 5.396 | |
TG-5 | 嗜水气单胞菌DNA第一组 | 79% | 0.606 | 3.518 |
中间气单胞菌DNA第5B组 | 16% | 0.117 | 4.061 | |
类嗜水气单胞菌DNA第二组 | 2% | 0.013 | 4.796 |
表5. TG-2、TG-5生化鉴定结果
TG-2的相似指数为0.520,TG-5的相似指数为0.606。两者的指数都大于0.5;因此,TG-2为嗜水气单胞菌DNA第二组,TG-5为嗜水气单胞菌DNA第一组;将48种生化反应对照《伯杰氏系统细菌学手册》气单胞菌种属(Aeromonas),其结果为TG-2嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila),TG-5为嗜水气单胞菌无气亚种(Aeromonas hydrophila subsp. anaerogenes)。
药敏试验结果表明头孢他啶,多粘菌素B对两种菌敏感,其中头孢他啶敏感性最高。TG-2对头孢哌酮,头孢曲松的敏感性也较强(见表6)。
药物名称 | TG-2 | TG-5 | ||
---|---|---|---|---|
平均抑菌圈直径/mm | 抑菌强度 | 平均抑菌圈直径/mm | 抑菌强度 | |
多粘菌素B | 12.83 | S | 13.83 | S |
复方新诺明 | 0 | R | 0 | R |
万古霉素 | 0 | R | 0 | R |
头孢唑林 | 0 | R | 0 | R |
哌拉西林 | 23.3 | S | 10 | R |
诺氟沙星 | 0 | R | 0 | R |
米诺环素 | 19.67 | S | 17.67 | I |
羧芐西林 | 0 | R | 0 | R |
氨芐西林 | 0 | R | 0 | R |
多西环素 | 14.67 | I | 0 | R |
四环素 | 14.67 | I | 0 | R |
新霉素 | 20.67 | S | 20.5 | R |
卡那霉素 | 22.5 | S | 0 | R |
庆大霉素 | 21.83 | S | 15.17 | R |
丁胺卡那 | 25.5 | S | 16 | R |
苯唑西林 | 0 | R | 0 | R |
头孢氨苄 | 0 | R | 0 | R |
头孢哌酮 | 32.83 | S | 8 | R |
头孢他啶 | 32.83 | S | 25.67 | S |
头孢曲松 | 34.67 | S | 0 | R |
头孢呋辛 | 25.67 | S | 0 | R |
表6. 药物敏感性试验结果
注:R表示耐药,I表示中介,S表示敏感。
TG-2组小鼠出现轻微腹胀,肠道充气,壁薄,轻微充血,肝脏肿大出血,有的肝脏部分泛白,肾脏肿大,胃壁较硬。TG-5组小鼠与TG-2组的病理变化相似(见表7)。
试验组发病蛙皮肤出现不同程度的溃烂,腹部与四肢呈大片红色,肛门和四肢部位明显。TG-2菌株组解剖后腹腔有大量淡黄色腹水,暴露于空气中呈胶冻样,肝脏肿大出血,有的表面有灰白色点状病灶,脾肿大,肾充血肿胀。TG-5菌株组解剖后肝脏肿大表面红黄相间,胃充血,脾肿大,肾边缘泛白(见表8)。
组别 | 剂量(ml) | 菌株 | 感染只数 | 每天死亡情况(d) | 死亡率 | |||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6-14 | |||||
试验组 | 0.2 | TG-2 | 5 | 2 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100% |
TG-5 | 5 | 2 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 100% | ||
对照组 | 0.2 | 生理盐水 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% |
空白组 | 0 | 无 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% |
表7. 小鼠致病试验结果
组别 | 剂量(ml) | 菌株 | 感染只数 | 每天死亡情况(d) | 死亡率 | |||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6-14 | |||||
试验组 | 0.2 | TG-2 | 10 | 0 | 1 | 4 | 1 | 1 | 0 | 70% |
TG-5 | 10 | 1 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 40% | ||
对照组 | 0.2 | 生理盐水 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% |
空白组 | 无 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0% |
表8. 美蛙致病试验结果
接种TG-2与TG-5菌发病致死蛙的各脏器组织病理变化明显,但两株菌致死蛙病理症状之间无明显差异。通过对美蛙肝正常与病理组织切片的比较观察,可见(见图3):镜检肝细胞绝大部分坏死消失,肝细胞肿大,胞质溶解,空泡变性,肝细胞核浓缩、碎裂,肝细胞索分布紊乱、断裂,肝血窦扩张、融合,间质被炎性细胞浸润,肝脏中有大量的淤血、出血和坏死灶。对美蛙肾脏正常与病理组织切片的比较观察,可见(见图4):肾小囊腔扩张中间含有血浆和蛋白渗出物,上皮细胞肿大,广泛性的颗粒、空泡变性,胞核浓缩、碎裂。肾间质血管淤血、出血,炎性细胞浸润。肾小管管腔中不同程度存在渗出物和红细胞等物质。
气单胞菌属(Aeromonas)包括:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)、维隆气单胞菌(Aeromonas veronii)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、中间气单胞菌(Aeromonas media)等共14个气单胞菌表型和16个基因种 [
图3. 患病美蛙肝脏病理组织学特征(HE染色)。(a)、(b) 健康肝脏组织;(c) 肝脏淤血、出血,肝索排列紊乱;(d) 肝细胞肿大,空泡变性,胞质溶解,核浓缩、碎裂,肝血窦扩张
图4. 患病美蛙肾脏病理组织学特征(HE染色)。(a)、(b) 健康肾脏组织;(c) 肾间质血管淤血、出血,肾小管官腔内含蛋白渗出物;(d) 肾小囊腔扩大,内含蛋白渗出物,肾小管上皮细胞空泡变性,核浓缩、碎裂
由于不同菌株间的生理生化性状、血清型、基因型的差异,其致病性在表达毒力因子上也存在差异 [
由于蛙与大鲵都为两栖动物,两者在生理结构生活特性等方面近似,大鲵为国家保护动物,资源非常珍贵,养殖大鲵因价格等因素限制了致病菌研究。本课题意图将美蛙作为大鲵的病原菌感染的实验动物模型进行探索,并通过感染死亡蛙的病理组织观察了解蛙和大鲵异同。感染后的美蛙临床病理症状显示皮肤溃疡,腹部与四肢出现大量红色出血点,腹水增多,泄殖孔出血,脾脏肿大,肝脏肿大有黄色斑纹或白色坏死灶,肾肿大出血。宋婷婷 [
由TG-2与TG-5对21种抗生素敏感性的测定结果表明,两株菌的耐药性较高,特别是TG-5对试验所使用的21种抗生素中18种耐药。TG-2与TG-5两种菌对头孢他啶、多粘菌素B敏感,TG-2对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、米诺环素、多粘菌素B高度敏感。四环素类中多西环素、四环素,磺胺类中复方新诺明和喹诺酮类中诺氟沙星广谱,β-内酰胺类中半合成青霉素哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林等对革兰阴性杆菌有较强抑菌作用,但TG-2与TG-5菌的实验结果均为耐药,说明该养殖场的病死大鲵体内病原菌对哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林等药物产生了耐药。氨基糖苷类中新霉素、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那对需氧革兰阴性杆菌作用强,而一代头孢对阴性菌效果弱,二、三代头孢较一代对阴性菌作用强,所以TG-2对氨基糖苷类和β-内酰胺类中二、三代头孢敏感。从肖丹 [
国家科技支撑计划项目:黑龙江等流域冷水鱼健康养殖关键技术继承与示范(2012BAD25B10: 2012BAD25B10-1),开州农委采购项目:大鲵病害防控研究技术服务(2015ZFCG150)。
余秋寒,李娴妍,蔡浪花,沙 莎. 病死大鲵嗜水气单胞菌分离鉴定和感染美蛙组织病理观察及药敏分析 Isolation and Identification of Aeromonas hydrophila from Dead Giant Salamander and Histopathological Observation of Infected Frog and Drug Sensitivity Analysis[J]. 微生物前沿, 2019, 08(02): 68-79. https://doi.org/10.12677/AMB.2019.82009