目的:观察枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)对小鼠结直肠癌皮下移植瘤生长的抑制作用,并探讨其作用的可能机制。方法:建立CT26小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型,LBP给药12天,观察小鼠状态,测量移植瘤长短径绘制肿瘤生长曲线;肿瘤组织切片免疫组织化学方法检测CD31蛋白表达,观察肿瘤间质血管密度改变;大鼠动脉环实验观察LBP对血管形成的影响。体外实验RT-PCR检测LBP对血管生成抑制因子1 (BAI1)表达的影响。结果:肿瘤生长曲线发现LBP可抑制小鼠结直肠癌皮下移植瘤的生长,LBP给药组小鼠肿瘤体质量为0.31 ± 0.04 g明显小于对照组0.63 ± 0.06 g (P < 0.05),CD31染色显示LBP给药组肿瘤间质微血管密度为31.6 ± 2.45,小于肿瘤模型组42.3 ± 3.28,差异具统计学意义(P < 0.05);同时发现LBP对大鼠动脉环血管形成具有明显抑制作用,且呈浓度依赖性;RT-PCR检测发现LBP可上调BAI1 mRNA表达。结论:LBP具有抗小鼠结直肠癌肿瘤生长的作用,其机制可能与抑制肿瘤微血管形成、上调BAI1表达有关,其具体的作用机制有待进一步探究。 Objective: To investigate the effect and mechanism of Lycium barbarum polysaccharides (LBP) on the growth and angiogenesis of mice with colorectal cancer. Methods: Firstly, we observed LBP administration inhibition effect of tumor growth and drew the tumor growth curve based on the CT26 colorectal cancer mouse model we built. Then, CD31 expression of tumor tissue sections, detected by immunohistochemical, was to measure the tumor interstitial microvascular density. Secondly, rat aortic ring experiment was to confirm the effect of LBP on angiogenesis. In vitro RT-PCR was used to detect the effect of LBP on the expression of brain specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1). Result: The tumor growth curve found that LBP could inhibit the growth of mouse model of colorectal cancer tumor, the tumor weight of LBP group was (0.31 ± 0.04) g which was significantly less than that of the control group (0.63 ± 0.06) g (P < 0.05), CD31 staining showed that the tumor interstitial microvascular density (42.3 ± 3.28) of control group was more than that of LBP group (31.6 ± 2.45) (P < 0.05; LBP); the concentration of microvascular of LBP was less than that of control group, the obvious inhibitory angiogenesis effect was observed on rat aortic ring, which was related with the LBP concentration. In vitro LBP could increase the expression of BAI1 mRNA (brain tissue specific angiogenesis inhibitor 1). Conclusion: The inhibitory effect of LBP on the growth of colorectal cancer in mice may be related to the inhibition of angiogenesis and upregulation of BAI1 expression, but the specific mechanism needs further clarification.
周芷晴1,李媛媛2,徐志文3,茆文莉1,杜标炎1,何彦丽1*
1广州中医药大学基础医学院,广东 广州
2广州呼吸健康研究院,广东 广州
3广州市番禺区祈福英语实验学校,广东 广州
收稿日期:2019年7月3日;录用日期:2019年7月23日;发布日期:2019年7月30日
目的:观察枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)对小鼠结直肠癌皮下移植瘤生长的抑制作用,并探讨其作用的可能机制。方法:建立CT26小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型,LBP给药12天,观察小鼠状态,测量移植瘤长短径绘制肿瘤生长曲线;肿瘤组织切片免疫组织化学方法检测CD31蛋白表达,观察肿瘤间质血管密度改变;大鼠动脉环实验观察LBP对血管形成的影响。体外实验RT-PCR检测LBP对血管生成抑制因子1 (BAI1)表达的影响。结果:肿瘤生长曲线发现LBP可抑制小鼠结直肠癌皮下移植瘤的生长,LBP给药组小鼠肿瘤体质量为0.31 ± 0.04 g明显小于对照组0.63 ± 0.06 g (P < 0.05),CD31染色显示LBP给药组肿瘤间质微血管密度为31.6 ± 2.45,小于肿瘤模型组42.3 ± 3.28,差异具统计学意义(P < 0.05);同时发现LBP对大鼠动脉环血管形成具有明显抑制作用,且呈浓度依赖性;RT-PCR检测发现LBP可上调BAI1 mRNA表达。结论:LBP具有抗小鼠结直肠癌肿瘤生长的作用,其机制可能与抑制肿瘤微血管形成、上调BAI1表达有关,其具体的作用机制有待进一步探究。
关键词 :枸杞多糖,结直肠肿瘤,血管形成
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结直肠癌(CRC)是我国常见恶性肿瘤之一,其死亡率在全部恶性肿瘤中持续位居前5位,文献报道2015年男性新增患病人数21.57万,女性新增16.06万,男性死亡人数为11.11万,女性为8万 [
二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);超净工作台(苏州净化),白光拍摄显微镜(奥林巴斯日本)。
6~8周SD大鼠6只,雌性,体重(200 ± 20) g,购于广东省医学实验动物中心,许可证号:SCXK (粤) 2013-0002。
6~8周Balb/c小鼠16只,雄性,体重(20 ± 2) g,购于广东省医学实验动物中心,许可证号:SCXK (粤) 2013-0002。实验动物饲养于室温20℃~26℃,相对湿度40%~70%的环境中,昼夜明暗光照时间(12 h明/12 h暗)。
小鼠结直肠癌细胞CT26和人真皮微血管内皮细胞HDMEC由本实验室保种。
LBP (质量分数大于50%)购于中国西安开来生物工程有限公司,生产批号:K140828;CD31抗体购于Abcam公司,免疫组化抗兔二抗购于中国北京中杉金桥生物技术公司;PCR引物由中国英潍捷基公司合成,DAB购于美国CST公司;Matrigel购于美国BD公司,SYBR Green Mix和逆转录试剂盒购于Takara公司。
小鼠随机分为对照组和实验组,每组8只,将对数期生长的CT-26细胞按照每只小鼠2 × 105/0.2ml接种于小鼠左侧腋前皮下。4天后可看到肿瘤长出,开始给药,依据实验室之前研究基础 [
常规脱蜡–切片,PBS洗3次,每次5分钟,柠檬酸钠修复液(PH 6.0)高温高压热修复8分钟,自然冷却后放入3% H2O2甲醇溶液37℃浸泡30分钟,PBS洗3次,每次5分钟,加10% BSA封闭,加CD31一抗置于4℃过夜;将组织切片从封闭盒中取出继续孵育1小时,PBS洗3次,每次5分钟;滴加二抗置于室温孵育1小时,PBS洗3次,每次5分钟;DAB显色10秒,流水冲;苏木素复染30秒,流水冲。常规脱水,中性树胶封片,自然晾干。每次实验设立阳性和阴性对照 [
6~8周龄SD雄性大鼠,乙醚麻醉后脱臼处死;将大鼠浸泡于75%酒精中2分钟,打开胸腔,沿脊柱剪下大鼠胸主动脉;将血管置于大培养皿中,加入无菌PBS洗3遍,除去血液,剥离剔除血管周围结缔组织,将血管剪成1 mm高圆环;用4℃预冷中枪头加matrigel 100 μL入48孔板中,避免气泡产生,轻轻拍打使其分布均匀,放入37℃细胞培养箱中15分钟使matrigel凝固;将剪好的血管环放入凝固的matrigel中,使其位于中央,再加入matrigel 100 μL,避免气泡,放入37℃细胞培养箱中15分钟使matrigel凝固。根据预实验,选取LBP药物浓度为500 μg/mL及1000 μg/mL两个浓度,用EBM培养基配制,500 μL/孔,每天观察血管生长情况,8天后,向48孔板中加入4%多聚甲醛固定液,室温固定30分钟后拍照。
细胞培养,对数期生长的细胞汇合度达到90%,消化,计数,于1.0 × 105/孔铺六孔板。第二天,弃掉培养基,用EBM培养基配置500 μg/mL的LBP为给药组,对照组加入相同体积的EBM培养基,培养48小时。48小时后,弃掉培养基,PBS洗3次,弃掉PBS;RNA提取、逆转录严格按照试剂说明书进行,cDNA用DEPC稀释8倍后,按照试剂盒说明进行操作分析。
利用Primer5.0进行引物设计,BAI1引物序列如下:
Primer 15′-CAGAGGAGCAGGTGGACAGAGAAAG-3′
Primer 2 5′-TCAGGA GACAGTGGAAGCAGCG-3′。
肿瘤组织血管密度采用Image pro plus软件对结果进行处理,血管环周长用ipp软件计算。所有数据采用GraphPad Prism 5.0软件作图。数据以mean ± SD表示,两组间用两独立样本t检验方法,P < 0.05具有统计学差异。
LBP给药组CT26结直肠癌小鼠肿瘤体质量为(0.31 ± 0.04) g小于对照组(0.63 ± 0.06) g (P < 0.05) (见图1(A));绘制肿瘤生长体积曲线,发现枸杞多糖LBP可抑制小鼠肿瘤的生长(P < 0.05) (见图1(B))。
图1. LBP对小鼠结直肠癌肿瘤生长的影响*P < 0.05,**P < 0.01
CD31单抗免疫组织化学染色检测肿瘤组织中的血管密度,并在200×高倍视野(HP)下计数血管数目,发现LBP给药组血管数(31.6 ± 2.45)/HP明显少于对照组(42.3 ± 3.28)/HP (P < 0.05),表明LBP可抑制肿瘤血管的形成(见图2)。
图2. LBP对肿瘤血管形成的影响*P < 0.05
观察动脉环周围的新生成的血管数量发现,LBP给药剂量分别在500 μg/mL和1000 μg/mL时血管数明显少于对照组,表明LBP对大鼠动脉环血管形成具有抑制作用,且与浓度相关(见图3)。
图3. LBP对大鼠动脉环血管形成的影响
LBP 500 μg/mL及1000 μg/mL处理HDMEC细胞48 h,检测BAI1 mRNA水平的变化,发现与肿瘤模型组比较,LBP给药后BAI1表达上调,且具有统计学意义(P < 0.05) (见图4)。
图4. LBP处理HDMEC细胞48小时后,BAI1的表达*P < 0.05,**P < 0.01
恶性肿瘤侵袭与转移是肿瘤治疗失败的主要原因,血管形成为肿瘤细胞提供了丰富的氧及营养物质,为促进其转移等恶性生物学行为创造了条件 [
研究证实许多中药具有抗血管作用,例如 [
本课题前期实验结果表明LBP可抑制H22肝癌腹水移植瘤模型小鼠外周血VEGF的表达 [
脑组织特异性血管生成抑制因子1 (brain-specific angiogenesis inhibitor 1, BAI1)属于G蛋白偶联受体的B家族,是从人类脑组织中提取出来的一种抑癌基因。近年来研究证明人类肿瘤中BAI1表达水平与肿瘤的发生发展有着密切的关系,且具有抑制血管生成作用 [
国家自然科学基金项目(No.81873154),广州中医药大学“高水平大学建设”项目(No.A1-AFD018171Z11003)。
周芷晴,李媛媛,徐志文,茆文莉,杜标炎,何彦丽. 基于影响肿瘤间质血管生成探讨枸杞多糖抗小鼠结直肠癌作用及机制To Discuss the Effect and Mechanism of LBP on Colorectal Cancer in Mice Based on the Induction of Tumor Interstitial Vascular[J]. 中医学, 2019, 08(04): 293-299. https://doi.org/10.12677/TCM.2019.84049