所用菌株是从长期保存的出芽短梗霉菌种经复壮、筛选后得到的一株多糖产量相对高、色素水平相对低的菌株,通过摇瓶发酵确定最佳培养条件,并解决了短梗霉发酵的一些问题,例如:菌丝结团,pH下降过快影响多糖的产量等,使其多糖转化率提高了10%~20%,色素含量明显减少,后通过Biostat@B5L发酵罐发酵培养,确定了最适发酵条件,通气量为1.5 vvm,转速为500 rpm,发酵液颜色在乳白到淡黄之间,无需脱色处理,即可得到白色粗糖产品,多糖产量达到35 g/L,转化率达到65%左右,较好的平衡了多糖量和色素量的关系。 Pullulans polysaccride, produced from Aureobasidium pullulans, is a kind of extracellular polysaccride. In the current study, in order to change the permeability of cell membrane and solve the problem of linked group of fungi mycelium, the method adding tween-80 and different Ca2+ resources was established. The utilized strain with relatively high polysaccride yield and low pigment level was obtained after the rejuvenation and riddling of long-preserved Aureobasidium pullulans strain. The transformation ratio of polysaccride was increased by 10% - 20% and the pigment content was greatly reduced. By adopting Biostat@B5L fermentor according to the optimum formula, and find the opti-mum aerate speed is 1.5 vvm, and the rate of circle is 500 rpm and culture temperature is 28˚C ± 1.5˚C, and initial pH is 6.5, so a high conversion rate of 65% (35 g/L polysaccride yield)was obtained from the light colour medium. The fer-menting liquor is between milk white and light yellow, and the white primary product can be gained without decolora-tion step.
短梗霉多糖是由出芽短梗霉经次级代谢产生的一种胞外多糖,出芽短梗霉又称出芽侧茁霉(Aureobasidium pullulans或Pullularia pullulans)属半知菌纲真菌,是短梗霉属中唯一的一个种,由于遗传上的不稳定性,形成许多变种。其细胞形态多样化,包括芽生孢子、酵母状细胞、膨胀细胞、菌丝体、厚垣孢子和其他形态各异的中间细胞形态,其不同细胞形态具有不同的胞外多糖合成能力,研究表明酵母状细胞是产多糖能力最强的一种细胞形态[
目前,仅日本有少量工业化生产,因此研究如何工业化生产短梗霉多糖不仅有重要的经济效益,更具有消灭“白色污染”,坚持可持续发展的重要社会效益。出芽短梗霉在发酵过程中伴有深绿色和黑色的色素产生,对短梗霉多糖的提取和纯化造成困难,降低其品质,因此在发酵过程中要控制色素的产生,同时还要提高多糖的转化率,在实际研究过程中往往不能二者兼备[
实验初始菌种来源于烟台大学,后经本研究组前期实验筛选得到的编号为C714的一支复壮活化后菌种作为本实验研究菌株。
用于菌种斜面保存和平板筛选
蔗糖:50.0,K2HPO4:0.2,酵母膏:3.0 琼脂粉:15.0,加50%豆芽汁200 ml,自然pH(测试在6.5左右)。
蔗糖:50.0,K2HPO4:5.0,酵母膏:3.0,MgSO4·7H2O:0.2,(NH4)2SO4:0.6 g,NaCl:0.05 pH为6.0。
蔗糖:50.0,K2HPO4:5.0,酵母膏:3.0,MgSO4·7H2O:0.4,(NH4)2SO4:0.6,NaCl:1.0,CaCO3:0.5,吐温-80:2 ml pH为6.5。
采用平板筛选和液体发酵结合进行,经反复筛选确认其中C714菌株最理想,实验数据略。
取1环新鲜斜面菌种接种于种子瓶(500 ml锥型瓶,装液50 ml),29℃,180 rpm,摇床培养36小时。
取90 ml种子液接种于5 L发酵罐中,装液体积为3 L,发酵温度控制在28℃ ± 1℃,其他条件待定。
取0.5 ml发酵液,10倍稀释后离心(3500 rpm,20 min)除菌体。取上清液1 ml,加2 ml无水乙醇,摇匀静置后离心(同上)得到沉淀即为粗多糖。
取10 ml发酵液,离心后倒掉上清,80℃烘干。
取1 ml经稀释的样品以蒽酮法测定。
取发酵液离心除菌体后上清液1 ml,经稀释后以蒽酮法测定。
1 ml发酵液去除粗多糖后剩余液体,经稀释后以蒽酮法测定。
采用旋转式粘度计测量发酵液不同时期的粘度。
长期保存的菌种会发生退化和变异,菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程。首先,在细胞群体中出现个别发生负变的菌株,这时如不及时发现并采取有效的措施,而一味地移种传代,则群体中这种负变个体的比例逐渐增大,最后占据了优势,整个群体发生严重的退化。所以,开始时,所谓“纯”的菌株,实际上其中已包含着一定程度的不纯因素;同样,到了后来,整个菌种虽已“退化”,但也是不纯的,即其中还会有少数尚未退化的个体存在。因此需要进行活化和复壮,活化是将低温保藏的菌株通过缓慢升温和转接,得到新鲜的菌株;复壮则是将菌种中未发生退化和变异的菌种筛选出来,或者说将发生有益变异的菌株筛选出来[
在短梗霉菌株的固体培养基选择上,采用三种固体培养基作比较(此三种固体培养基都为文献记载适合于霉菌培养)。培养方法:从原始菌株斜面的最里面,取一接种环菌种,培养温度均为29℃,试管斜面培养,结果如表1。
由此可以看出,短梗霉菌的固体培养基选择豆芽汁和马铃薯培养基(PDA培养基)都可以,综合考虑培养基颜色和菌落生长快慢程度,PDA培养基颜色为乳白色,而豆芽汁培养基为黄色,且杂质比PDA培养基多,因此选择马铃薯培养基(PDA培养基)更合适。
先对每个培养基中的组成成分进行单因素实验,以确定其最适区间,之后通过考察一些特殊的添加物,达到改善发酵性能,其中用碳酸钙取代氯化钙,对发酵液pH值起到一个缓冲作用,提高了多糖的转化率,而吐温-80的运用更是解决了菌丝结团的问题,进而使发酵液颜色变浅,青霉素的运用没有明显效果。
试验中蔗糖、硫酸铵、酵母膏和磷酸氢二钾对短梗霉发酵都具有显著性影响,通过方差分析和一系列的验证实验确定了短梗霉发酵的最适配比:蔗糖(50.0 g/L)、K2HPO4(5.0 g/L)、(NH4)2SO4(0.6 g/L)、酵母膏(3.0 g/L)、CaCO3(0.5 g/L),可使多糖转化率达到70%,发酵液中多糖浓度达到35 g/L,发酵液颜色接近淡乳黄色。
在发酵条件方面,考察了初始pH值、种龄、接种量和装液量对短梗霉发酵产多糖的影响,由结论可知,最适初始pH值在6.5,种龄为24 h,接种量为3%,装液量为300 ml锥型瓶装30 ml发酵液(以上实验数据略)。
发酵技术在生物制药、饲料、酒精、酵母生产、酶类生产、蛋白质衍生物、碳氢化合物、食品、活性
表1. 三种固体培养基比较
污泥处理等过程中应用非常广泛[
按照上阶段实验取得的成果,应用到发酵罐中,选用条件通气量:1.0 vvm;转速:300 rpm,其中每隔12 h进行一次取样和记录数据,所取样品均放置在灭菌后的样品瓶并于–20℃冷冻保存,实验结束后统一进行多糖产量测定(注:前期试验已验证,样品冷冻保存一个月内测量结果没有明显改变,此种多糖性状很稳定)。
在实验过程中会产生大量泡沫,是发酵中的一个难题,采用硅酮消泡剂,可以取得较好效果,实验过程中需要密切关注发酵液的变化,及时补充消泡剂,一般在发酵24 h后泡沫开始大量出现,通气量和搅拌速度增大都会使泡沫大量产生,因此需要适度控制。由之前实验结果得知,菌体细胞数量在发酵过程中一直增加,多糖从24 h后,开始大量产生,到120 h达到最大值,残糖量从一开始就急剧下降,达到最大多糖产量后开始趋于平缓,发酵液粘度随着多糖的增加也逐渐增加,120 h后开始下降,这是短梗霉多糖酶降解短梗霉多糖所致,但在后期又有一个回升,可能是多糖的二次产生。但在此次实验中,多糖产量仅为23~24 g/L左右,产量低,多次发酵结果都基本相同,远没有达到摇瓶发酵的结果。出芽短梗霉菌在发酵生产多糖时,对溶氧的需求很高,但当多糖产量增加时,发酵液粘稠度极高,达到0.9 Pa.S以上,溶氧迅速下降接近0,基本测不到溶氧的数据,因此通气量和搅拌速度不够会导致产量偏低[8,9]。因此,采用最大通气和搅拌条件如下,进行下一步实验。选用条件通气量:1.5 vvm;转速:500 rpm的实验结果见表2和图1,从图1可以看出发酵时间120 h,多糖产品浓度最大时发酵液粘度最大,之后多糖浓度缓慢下降,菌体质量增加速度加快,发酵过程中发酵液的pH变化如图2,前36 h,发酵液pH值急剧降低,之后缓慢回升,这与前期摇瓶发酵研究结果一致,只有这样的pH变化过程,多糖才可以高产,出芽短梗霉指数生长期,整体发酵液pH值下降且呈现酸性,但在成熟期pH的缓慢回升有助于多糖的生产,前期试验研究发现此时通过人为改变pH值变化趋势,并不能提高多糖产量,反而起到反效果。所以试验证明在发酵液中用碳酸钙取代氯化钙,对发酵液pH值起到一个缓冲作用,提高了多糖转化率。
表2. 5L发酵罐发酵参数和实验指标
粘度测量:1~10号,转速V6,1号转子;11~15号,转速V12,2号转子。
图1. 5L发酵罐中短梗霉多糖的发酵过程
图2. 5L发酵中pH的变化
由实验结果可以看出,多糖产量可以达到35 g/L左右,接近摇瓶的产量,有一定差距,但是发酵罐的通气量和搅拌速度不能再增加,一方面泡沫控制有难度,需要改进发酵罐的类型,加大通气量和搅拌速度进行继续实验,另一方面,发酵液粘度极大,基本呈现半固体状态,搅拌动力不足,此种发酵罐不能满足要求。从图中还可以看出,残糖量减少很快,几乎充分利用了底物中的还原糖,到144 h之后,菌体干重开始缓慢减少,说明菌体开始自溶,同时粘度有二次增加,多糖也有增加,根据前人文献推断可能是菌体自溶导致菌体内的多糖随之释放到发酵液当中[10,11],其他实验现象同上。
CaCO3取代CaCl2提高了多糖产量,初步认为是碳酸根离子对发酵液pH的缓冲作用,并且可以缓慢释放钙离子,起到很好的提供钙缘并同时微调发酵液pH值的作用,所以单纯用钙离子并没有达到相同效果,在前期试验中也试图在发酵过程中人为改变发酵液pH值包括采用恒定pH值和在初期pH值迅速降低时增加pH,但并不会提高产量,相反调节不当会导致产量明显降低。吐温-80的使用,避免了菌丝结团,对产量的提高不是很明显,但在达到最高多糖产量时的色素产量明显减少,发酵液颜色浅,后续提纯无须脱色步骤,这一点尤其在大规模生产和实际应用中有重要意义。通过5L发酵罐发酵,取得了较好的结果。实现了提高多糖产量的同时降低色素水平,对今后的工业生产有一定的借鉴意义。
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[