烟粉虱Bemisia tabaci是一种世界性分布的农业害虫。本文利用PCR扩增和DNA测序技术,研究了野生和实验室饲养的烟粉虱B型和Q型种群内共生菌的感染情况;并利用利福平对Q型烟粉虱实验室种群体内的共生菌进行了灭活处理,就处理前后烟粉虱的生物学特性变化进行比较。研究结果表明,所检测的的烟粉虱种群中均有初生共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum的感染,而次生共生菌Wolbachia和杀雄菌Arsenophonus在不同生境下的烟粉虱种群内,其感染率存在较大差异。利用1.0 mg/ml的利福平对饲养型的Q型烟粉虱成虫进行处理,48 h后处理样本体内Wolbachia的感染检测为阴性,而初生共生菌Candidatus和杀雄菌Arsenophonus仍为阳性。共生菌灭活处理后,烟粉虱成虫单雌产卵量明显下降,由36.9粒/头下降至26.4粒/头;F1代的发育历期延长,F1代种群中雄性比例有较大幅度增加,由对照种群中的45.28%上升至58.06%。本文研究表明,不同生境下,烟粉虱体内的共生菌类群存在差异,次生共生菌Wolbachia对烟粉虱的发育、繁殖及种群性比等方面有着明显的影响。 The sweetpotato whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is a globally distributed agricultural pest. The species and infection rates of different endosymbionts in field and laboratory populations of B. tabaci B and Q biotyes were detected by molecular methods. Meawhile, the endosymbionts in B. tabaci Q biotype lab population were inactivated with rifampicin, and then the biology of Wolbachia positive and negative popula-tions of B. tabaci Q biotype were compared. Rusults indicated that all the populations of B. tabaci were in-fected by the primary endosymbiont Candidatus Portiera aleyrodidarum, regardless biotype or population habitat of field or lab, while the infection of secondary endosymbionts Wolbachia and Arsenophonus were marked different in various B. tabaci populations related to biotype and habitat. Inactivated with 1.0mg/ml rifampicin for 48 h, the infection of Wolbachia in B. tabaci Q biotype was completely eliminated, but no ob-vious effect on the Candidatus and Arsenophonu in all the whitefly popualtions. Treated by rifampicin, the fecundity of female adults reduced and the developmental time of F1 offspring extended. Results also showed that the elimination of Wolbachia in B. tabaci led to the increase of male progeny proportion. In general, our current study showed that endosymbionts varied in different B. tabaci populations from various habitats and Wolbachia has significant effects on the biology of its whitefly hosts.
自然界中,节肢动物与细菌共生是一种普遍存在的现象,目前大约有75%以上的节肢动物体内含有共生菌[1,2]。根据共生菌的生物学特性与进化史, 可以将其分为2类,即初生共生菌(Primary endosymbiont)和次生共生菌(Secondary endosymbiont)[
相对于原生共生菌来讲,昆虫体内次生共生菌的种类丰富,已经报道的包括Wolbachia、Cardinium、Arsenophonus、Rickettsia和Spiroplasma等[
烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius),隶属半翅目(Hemiptera)、粉虱科(Aleyrodidae)、小粉虱属(Bemisia),若虫和成虫均能危害植物,通过其针状的刺吸式口器刺入植物的组织,吸食植物的汁液,影响植物的生长。同时,烟粉虱在植物叶片上分泌大量蜜露,很易滋生黑色煤污病菌导致煤污病发生,不但影响植物的光合作用[12,13],也会污染植物和果实、降低其外观和品质。更为重要的是,烟粉虱等粉虱种类是许多病毒病的重要传播媒介,尤以双生病毒组的病毒最甚,传毒种类多达110余种[
在众多次生共生菌中,Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内的一类共生细菌,它可以通过诱导宿主胞质不亲和、孤雌生殖、雌性化和雄性致死等来调控宿主的生殖方式,被认为与性别决定和物种形成等重要生物学问题密切相关[
为了进一步阐明这种现象,我们以野外与室内两种小生境下Q型和B型烟粉虱(分别属于Mediterrinean 和Middle East-Asia Minor 1隐种)为研究对象,对其体内的共生菌类群进行了检测,并以Q型烟粉虱为研究目标,比较了共生菌Wolbachia灭活前后,烟粉虱种群的生物学特性变化,以期增进人们对共生菌生理功能的了解与认识。
豇豆(Vigna unguiculata),钵载,待6~8片真叶时供试验使用。
烟粉虱Q型野生种群,2011年4月采集于广东省东莞市香蕉蔬菜所基地的辣椒作物上;饲养型种群为教育部生物防治工程研究中心继代保存种群,2006年采集于江苏省南通市辣椒作物上。烟粉虱B型野生种群,2011年4月采集于广东省江门市鹤山蔬菜基地的茄子上;饲养型种群为本研究中心继代保存种群,2005年采集于华南农业大学教学实习农场,寄主为茄子。
PCR产物纯化试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit;蛋白酶K;Ex-Taq polymerase,25 mmol/L Mgcl2,10 × PCR buffer,dNTPs(10 mmol/L),100 bp分子量标记等购自大连宝生物工程公司;苯酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠、利福平等化学试剂购自广州威佳科技有限公司。
2.2.1.1. 烟粉虱总DNA的提取
挑取单头野生型或饲养型烟粉虱,经双蒸水充分洗涤后置于0.5 mL离心管中,每管加入3 μL提取裂解液(1% SDS,1% Triton-x100,1 mM MgCl2;10 mM Tris-Cl pH7.4),充分研磨匀浆,并补足裂解液至30 μL,然后放入56℃恒温水浴锅中裂解2~3 h,最后95℃恒温水浴锅中10 min灭活蛋白酶K,置于–20℃冰箱中保存备用。
2.2.1.2. 烟粉虱体内共生菌种类及感染率的PCR检测
对于烟粉虱Q型、B型的野生与饲养种群,随机各自挑取20头成虫,单头提取其DNA,按照下列程序(表1)进行初生共生菌Protiera aleyrodidarum、次生共生菌Wolbachia supergroup A和B、杀雄菌的检测。各PCR产物经克隆酶切后送至测序公司进行序列测定,并在GenBank进行序列比对。记录不同烟粉虱种群中被各种共生菌感染的个体数量。
根据前期试验筛选结果,配制1.0 mg/ml的利福平溶液,随机选取羽化后2~4天的饲养型Q型烟粉虱成虫若干,利用设计的共生菌灭活饲喂装置(薛夏等,另文发表)对其进行次生共生菌灭活处理,分别于12 h和48 h后收集处理过的烟粉虱成虫,再次利用PCR对其进行共生菌检测,以确定利福平对Wolbachia和Arsenophonus杀雄菌等共生菌的灭活效果。
种植试验用豇豆苗,要求长势良好、清洁、无昆虫为害,长至6~8片真叶时用于实验。选取20株豇豆苗,每株选取两片大而伸展的真叶,对每片叶子分别进行标记。其中10株苗用于饲养型烟粉虱(lab population)生物学实验(即试验重复5组,每组4个叶片处理),标记为LP1-20;另外10株苗用于野生型烟粉虱(wild population)生物学实验,标记为WP1-20。试验时,在每片标记的豇豆叶片上套袋接入Q型WP或LP烟粉虱成虫,25对/片叶,待烟粉虱产卵24 h后,将接入的成虫赶走,记录WP和LP烟粉虱成虫的产卵量,每个叶片随机选留100粒卵用于后代各龄期的发育历期、存活率、成虫性比及寿命等生物学数据研究。收集经共生菌灭活处理的WP和LP烟粉虱成虫,重复上述实验,以比较Wolbachia灭活前后两个Q型烟粉虱种群在生物学特性上的变化。
表1. 三种共生菌检测的PCR引物及扩增程序
利用SAS软件(Version 6.12)的One-way ANOVA的方法(文中无相关分析),分析烟粉虱的产卵量、各龄期的发育历期、存活率、成虫性比及寿命等的差异;利用T检验、显著差数法比较分析不同烟粉虱种群、同一种群Wolbachia灭活前后生物学特性的差异。
利用PCR扩增及DNA测序技术,对烟粉虱B型、
Q型的野生种群和实验室种群体内三种共生菌的检测结果表明,无论是饲养型还是野生型的B型与Q型烟粉虱种群体内,都有初生共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum的存在(图1(a))。在野生型的B型、野生型及饲养型的Q型烟粉虱中,都有Wolbachia 共生菌的感染(图1(b)),而在饲养型的B型烟粉虱中未检测到有Wolbachia 共生菌存在(图1(c))。杀雄菌Arsenophonus的检测结果表明,野生型和饲养型的Q型烟粉虱种群与饲养型的B型烟粉虱种群体内都有杀雄菌Arsenophonus感染,而野生型的B型烟粉虱中未检测到有Arsenophonus存在(图1(d),(e)),另外,图1(d) 中两
图1. 不同烟粉虱种群体内三种共生菌的检测结果
个饲养型B型烟粉虱样本只有一个呈杀雄菌阳性感染)。
对不同烟粉虱种群体内三种共生菌的感染率检测结果表明,不论是野生还是饲养的烟粉虱种群,B和Q型种群体内初生共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum的感染率均为100%;对于杀雄菌Arsenophonus和Wolbachia的感染率,饲养型和野生型的Q型烟粉虱种群明显高于饲养型和野生型的的B型种群(表2)。而杀雄菌在野生型B型烟粉虱种群中、Wolbachia在饲养型B型烟粉虱种群中的感染率均为0。
PCR检测结果表明,利用1.0 mg/ml利福平溶液,对饲养型Q型烟粉虱饲喂12 h后,其体内仍然有Wolbachia共生菌的存在,而饲喂处理48 h后,Q型烟粉虱样本体内的Wolbachia感染为阴性,灭活效果理想(图2(a))。利用1.0 mg/ml利福平溶液对Q型烟粉虱体内杀雄菌的灭活检测结果显示,无论是12 h还是48 h的灭活处理,都不能除去烟粉虱样本体内的杀雄菌(图2(b))。
表2. 不同烟粉虱种群体内三种共生菌的感染率检测
图2. 利福平灭活处理后饲养型Q型烟粉虱体内Wolbachia和杀雄菌的检测结果
共生菌灭活前后,饲养型Q型烟粉虱种群生物学特性变化的研究结果表明,成虫经1.0 mg/ml利福平处理48h后,其后代在发育、存活、繁殖及性比等方面都有着明显的改变,包括:与未经Wolbachia灭活处理的烟粉虱种群相比,其世代发育历期显著延长(P = 0.0087),由20.4 d延长至23.3 d(图3(a));后代前五天单雌产卵量明显下降(P = 0.0016),由36.9粒/头下降至26.4粒/头(图3(b));同时,F1代种群中,雄性比例有较大幅度增加,由对照种群中的45.28%上升至58.06%(图3(c)),对照组与处理组相比达到显著差异水平(P = 0.0033);在世代存活率方面,灭活Wolbachia后,Q型烟粉虱后代的世代存活率有所上升,由44.32%升至78.53%(图3(d)),差异同样达到显著水平(P = 0.0010)。
由野生型和饲养型烟粉虱种群感染的共生菌种类检测结果可知,无论从量还是从种类上,两个种群感染的共生菌都存在着较大的差异。研究结果表明:1) 不同生境下,Q和B型烟粉虱种群的初生共生菌感染率均为100%,该结果符合初生共生菌和寄主之间的协同进化特征。然而不同烟粉虱种群内次生共生菌的感染就存在差异,例如,饲养型Q型和B型种群的Wolbachia A群组(Supergroup A)感染率分别为100%和50%,B群组(Supergroup B)的感染率分别为在饲养型Q型种群中为100%,而在饲养型B型种群未检测到感染;杀雄菌的感染率则分别为80%和50%。2) 在同一生境下,Q型种群的次生共生菌感染率明显高于B型种群,对于杀雄菌,B型种群未检测到感染,而Q型种群则检出率达到65%。我们的研究表明,烟粉虱种群所感染的共生菌是可以受到其生境的影响
图3. 共生菌灭活前后不同烟粉虱种群生物学特性比较
而发生差异的。已有研究表明,蚜虫种群的共生菌的种类会因室内长期饲养而改变[
在本研究中,实验室生境下的烟粉虱种群的发育历期出现延长,雄性比率高于野生型烟粉虱种群;在成虫的寿命方面,野生型烟粉虱明显长于实验室饲养的烟粉虱;用1.0 mg/ml的利福平处理48 h后的烟粉虱种群特征出现了明显变化:烟粉虱种群抵抗寄生天敌的机制明显减弱,双斑蚜小蜂对其的寄生率上升一倍以上(薛夏等,另文发表),另外出现了F1代成虫体长减小,寿命缩短,雄性比上升的现象。我们的实验结果再次证实,内共生菌Wolbahica会对寄主产生生理上的干扰作用[
不同生境的烟粉虱种群对于各种共生菌,不论从种类上还是数量上都存在较大差异,结合对不同烟粉虱自然种群和人为诱导后的烟粉虱种群的生物学特性变化研究结果推测,不同生境下不同烟粉虱种群的入侵、传播病毒能力以及自身防御能力的强弱差别都可能与其所感染的共生菌有很大的联系。对于一个昆虫种群来说,不同生态环境中的天敌种群密度,食物作物的丰度以及生态环境本身的参数(温度;湿度;光照)都会对其种群的发育和进化造成影响,也正是因为不同地理环境的长期作用加速了一个种群的不同生物型的产生,以及它们之间的生殖隔离和生物学特性的差异进化[
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