本文利用 EPC-500PE 型植物细胞反应器培养了长春花细胞,筛选到较优的参数组合为 150 r.p.m 搅拌速度和 0.5 mL/min 供气量。在合成培养过程中 , 长春花细胞的蔗糖消耗量约为初始添加浓度 ( 30 g/L ) 的 50% ,硝态氮的消耗量为初始添加浓度的 90% ,氨态氮的消耗量为初始添加浓度的 50% ,磷的消耗量为初始添加浓度的 70% 。长春碱含量在第 5 天达到峰值。 Catharanthus roseus cells were cultured using the EPC-500 PE bio-fermenter, and a stirring speed of 150 r/min and gas supply of 0.5 ml/min were determined to be the best cultivating conditions. During the cultivation process, the cells’ sucrose consumption was about 50% of the initial addition (30 g/L), while nitrate consumption, ammonia nitrogen consumption and phosphorus consumption were 90%, 50% and 70% of the initial addition, respectively. The content of vinblastine peaked at the fifth day.
在上世纪70年代,Zenk M.H.等[
尽管在长春花细胞生长过程中对于营养物质的需求的相关研究报告很多,但是很少有关于长春花细胞在合成长春碱过程中的营养物质消耗研究报告。特别是自学者开发出两段培养工艺之后,把植物细胞的生长与产物的合成分成两个不同阶段,甚至在两个不同的培养阶段使用不同的培养基。近年我们采用阻断阿玛碱合成途径的方法有效地促进了长春质碱的合成[
长春花细胞系是本实验室诱导并驯化培养2年的C03细胞系,实验采用固–液两步法。继代或细胞扩增培养基为改良的Murashige & Skoog(MS)固体培养基,添加0.5 mg/L BA(6-苄氨基嘌呤),0.5 mg/L NAA(萘乙酸),30 g/L蔗糖,5.5 g/L琼脂,pH调节为5.6~5.8。继代培养采用50 mL培养基/200 mL三角瓶,在121℃高压灭菌18分钟后冷却备用,每瓶接种6~7块大小均一且处于生长旺盛期的细胞团,接种量为鲜重1.5 ± 0.1 g/瓶。在25℃,避光条件下培养,每3周继代培养一次。
长春碱合成培养采取细胞悬浮培养方式,合成培养基采用1/2改良Murashige & Skoog(MS)培养基,添加0.5 mg/L BA,0.5 mg/L NAA,30 g/L蔗糖,100 mg/L色氨酸、50 mg/L丙酮酸钠、50 mg/L马钱子苷和30 mg/L氯化铈等代谢前体和诱导子,pH调节为5.8 ± 0.02。并装入EYELA日本东京理化公司5 L搅拌式植物细胞反应器(型号EPC-500PE),反应器系统包括反应器主体(Φ = 18 cm;h = 36 cm)、搅拌装置等(筐式搅拌桨Φ = 9 cm,h = 5 cm),系统接入了pH电极、DO(溶氧)电极和EC(电导率)电极,可以在线监测培养基的pH值、DO以及EC值。将装有培养液的反应器放入高压灭菌锅中,121℃灭菌40分钟,冷却后取出放置在超净工作台中,在无菌条件下利用0.42 μm孔径的无菌过滤膜再过滤加入0.6 mg/L维生素C、5 μg/L乙酰辅酶A、20 μg/L过氧化氢、0.5 μM/L苯丙三氮唑和8.4 mg/L萘普生等代谢调控因子。然后按照3升培养液重量比20%的接重量接种600克长春花细胞。设定培养温度为25℃,搅拌转速110或150 rpm,通气量为0.5 L/min。在培养过程中,利用计算机联机记录监控反应罐温度、溶氧、pH、搅拌速度等参数,每天按时采取50 mL培养液和细胞样品,用4000转/分的离心机离心5分钟,抽出上清液用于分析营养物质含量,做出消耗曲线。将沉淀细胞称重,冷冻干燥后称重,备用于检测生物碱含量。生物碱合成培养实验重复三次。
实验分两组进行,第一组实验将供气量设定在0.5 L/min,反应器搅拌速度设定在110 rpm和150 rpm两个组合,培养液体积为3 L,细胞接种量为20%,初始pH 5.8。
第二组实验取优化搅拌速度150 rpm,供气量分为0.25 L/min,0.5 L/min和1 L/min三个组合,培养液体积、初始pH和细胞接种量与第一组实验相同。
培养温度设定在25℃,培养周期为5天,5天后收获细胞,冷冻干燥后称重,备用于生物碱检测。反应器参数优化实验重复三次。
收集培养液,用3,5-硝基水杨酸显色法测定培养液中的总糖含量;采用GLU血糖试剂盒检测葡萄糖浓度(北京利德曼生物技术公司产);用酚二磺酸显色法检测硝态氮含量;用靛定酚蓝比色法测定培养液中的氨态氮含量,用磷钼蓝比色法分析培养液中的磷含量。
采用超声萃取与摇床萃取相结合的方式对长春花吲哚生物碱进行提取,先将收获的细胞冷冻干燥至恒重称重,然后充分研磨再从中精确称取200 mg样品置于25 mL磨口锥形瓶内,加入5 mL甲醇,摇匀,超声提取30 min后,移到摇床上放置抽提12 h(100 rpm,25℃)后取出,用4000转/分离心机离心获得上清液。将细胞残渣再次加入5 mL甲醇,重复上述抽提过程。最后合并二次萃取液,在旋转蒸发仪上蒸干获得浸膏,再用5 mL色谱级甲醇定容。并用0.45 μm微孔滤膜过滤到分析用小瓶中,待测。
本实验采用HPLC方法对长春花悬浮培养细胞中吲哚生物碱进行定量分析。
HPLC分析仪器:SHIMADZU-CLASS-10Avp型高效液相色谱,色谱柱:岛津公司Shim-pack C18反相柱PREP-ODS(H)KIT(4.6 × 250 mm,5 μm),流动相:A:3.1 g乙酸铵、5 mL甲酸、1 L水。B:甲醇,等梯度洗脱:A:B = 1:1,流动相流速:0.8 mL/min,紫外检测器检测波长:260 nm,柱箱温度:40℃。
长春质碱、文多灵、长春碱、它波宁标准品购于上海康爱生物制品有限公司,样品纯度大于98%。
搅拌速度和供气量是反应器培养过程中最重要的两个参数,调整供气量和搅拌速度能够改善细胞的悬浮状态,并直接影响到细胞的生长和次生代谢产物合成。图1表示了不同搅拌速度下长春花细胞的各种生物碱合成量。可以看到搅拌速度的变化对吲哚类生物碱的合成没有显著影响,但是在搅拌速度为110 rpm时所收获的平均细胞生物量(干重)为11 g,而搅拌速度为150 rpm时所收获的细胞(干重)为14.4 g。这说明150 rpm搅拌速度下的细胞生长状态较好。其原因是由于在该条件下培养液的溶氧水平相对较高,
图1. 搅拌速度对长春花细胞吲哚生物碱合成的影响
细胞能够获得更多溶氧的结果。在150 rpm条件下,长春质碱和长春碱的含量与110 rpm相比没有显著差异,它波宁的含量有所下降,但是药用价值更高的文多灵的含量却有所上升。因此在使用EPC-500PE型反应器培养长春花细胞时,如果选择生物量,150 rpm搅拌速度较有利,如果选择生物碱合成110 rpm较有利。由于在两种转速条件下目标产物长春碱的含量没有什么差异,结合生物量综合考虑,选用150 rpm较为有利。
在合成培养过程中,观察发现供气量为0.25 L/min时,细胞在培养前期出现明显的褐变现象,这可能是由于因供氧不足而造成部分细胞死亡。收获细胞时其平均干重只有10 g。当供气量为0.5 L/min时,细胞生长状况良好,收获时的细胞平均干重达到14 g。当供气量提高到1 L/min时,细胞悬浮状态良好,生长正常,收获细胞平均干重达到15 g。图2表示了反应器转速为150 rpm,供气量分别为0.25 L/min、0.5 L/min、1 L/min时各种生物碱的含量变化。从吲哚类生物碱的合成情况来看,供气量为0.25 L/min时各种吲哚生物碱的合成均受到了抑制。当供气量提高到0.5 L/min时,长春质碱、文多灵以及长春碱的合成得到了促进。而将供气量提高到1 L/min时,它波宁的含量大幅度提高,而长春质碱、文多灵和长春碱的含量却有所下降。它波宁是合成文多灵或长春碱的前体,由于高通气量影响了它波宁转化成文多灵或长春碱,所以它波宁被较多积累。实验结果表明,EPC-500PE型植物细胞反应器的转速在150 rpm与供气量为
图2. 不同供气量对长春花细胞生物碱合成的影响
0.5 L/min组合,比较有利于长春质碱、文多灵和长春碱的合成,在此条件下长春质碱的含量为1.32 mg/g,文多灵的含量为1.0 mg/g,长春碱的含量为0.2 mg/g。
在利用以上优化实验参数进行合成培养过程中,由于培养时间较短,细胞还处于迟滞生长期,因此长春花细胞的鲜重几乎没有增加,基本保持在一种缓慢生长甚至略有下降的趋势(图3)。当把固体培养基上生长旺盛的细胞转接到液体培养基时,由于渗透压环境的突然改变,细胞会因暂时发生脱水以及物质外泄而重量减少,之后缓慢生长。在实验结束时,细胞鲜重虽然回复到接种时的状态,但细胞的含水量相对较高。由于反应器搅拌桨的剪切力以及培养液溶氧相对较低的原因,少量细胞受到损伤,所以细胞的干重与
图3. 合成培养过程中的细胞生长曲线
接种时相比有所减少。
图4表示了长春花细胞在合成培养过程中,培养液中糖的剩余情况。也能明确反应出细胞对糖的吸收和消耗情况。可以看到,在接种细胞之前,培养液中已经出现了葡萄糖,这可能是由于培养液在高温灭菌过程中造成了部分蔗糖水解的结果。接种细胞之后,培养液中的蔗糖以及葡萄糖含量在培养初期均迅速下降,这是由于细胞在渗透压环境突然改变的情况下,快速吸收糖来维持渗透压平衡的结果。之后蔗糖的浓度基本稳定在初始添加量的50%左右。第一天培养液中的葡萄糖浓度达到最低点,之后快速上升,第5天达到峰值,之后开始下降。这可能是由于细胞将吸收到胞内的蔗糖在水解酶的作用下生成单糖,而细胞又不能全部利用这些葡萄糖而被释放到培养液中的结果。在第6天培养液中的葡萄糖含量有所下降,这与在第五天细胞开始生长而需要消耗更多的葡萄糖有关。碳源是细胞生长必不可少的营养物质,细胞吸收蔗糖后在酶的作用下水解成单糖,单糖中的一部分通过糖酵解和三羧酸循环等过程为细胞的新陈代谢提供能量的同时,还有部分代谢产物参与次生代谢。当然还有一部分葡萄糖以多聚体(C6H12O6)n的形式构成细胞壁以及其他储藏物质等。实验结果得知,在长春花细胞合成培养过程中,蔗糖的消耗量约占实验总添加量的50%左右。启示我们在长春花合成培养过程中,只添加15 g/L蔗糖就可以满足细胞的需求。但是,蔗糖不仅为细胞的生长以及次生代谢产物的
图4. 长春花细胞合成培养液中的糖浓度变化
合成提供碳源,在维持细胞内外渗透压平衡以及影响细胞新陈代谢的作用不可小觑。Knobloch和Berlin[
图5是长春花细胞合成培养过程中培养液的氮残留曲线,可以清楚地反应出长春花细胞对氮的吸收与消耗情况。可以看到,长春花细胞对于氮的吸收消耗非常快,接种细胞后第一天,就有近50%的氨态氮和近80%的硝态氮被吸收。从氨态氮和硝态氮的吸收比例来看,长春花细胞更偏好于利用硝态氮。从细胞快速吸收利用氮元素的现象可以反映出,在合成培养过程中,细胞的代谢活动非常旺盛,因为氮元素是合成吲哚生物碱的重要基础元素。此外,还可以从图5看到,在合成培养基中硝态氮的初始浓度大约是氨态氮的两倍,但是在培养结束时,剩余氨态氮的浓度为硝态氮的两倍,而且在培养第3天以后培养液中的氨态氮还有一个上升趋势,这可能是细胞把不能利用的氨态氮又释放到培养液中的结果。这与葡糖糖的消耗有些类似。接种细胞的第一天细胞快速吸收氮,之后消耗量非常少,其原因可能是在培养初期细胞处于饥饿状态,同时也因渗透压环境的突变而产生的快速吸收结果。根据实验结果得知,在长春花合成培养阶段,
图5. 长春花细胞合成培养液中的氮含量变化
细胞对于总氮的需求是初始培养基的70%,而硝态氮需求为初始浓度的90%,而氨态氮虽然在第三天被吸收了初始浓度的50%,但是之后又被释放出来而恢复到原有水平。Rho和Andre[
在培养液中,植物以或P2O5的形式吸收磷。从图6可以看到,长春花细胞对于磷的吸收与对氮的吸收情况非常相似,也就是在接种细胞后的第一天,大约有70%左右的磷被吸收,而且直到培养结束,培养液中磷的浓度一直维持在这一水平。表明长春花细胞只在合成培养初期对于磷的需求量较大。这也从另一侧面说明长春花细胞在旺盛代谢。从第二天之后,长春花细胞对磷的吸收几乎没有变化,其原因可能是由于细胞在饥饿与渗透压突变的情况下快速吸收了大量的磷之后贮藏在胞内,以逐步满足其新陈代谢的需要,该吸收现象应该是植物细胞的物质吸收特征。实验采用了1/2 MS培养基,磷含量已经减半,而长春花细胞在合成阶段只消耗了70%的磷,与Rho和Andre[
图6. 长春花细胞合成培养液中的磷含量变化
在以上实验的同时我们对细胞中吲哚类生物碱的含量也进行了检测。如图7所示,长春质碱和文多灵的合成趋势相近,从培养的第一天含量开始升高,在第三天有一个下降的过程,之后再继续升高,长春质碱在第6天达到峰值,文多灵在第5天达到峰值,之后其含量开始下降。它波宁的含量在第一天就达到了峰值,之后快速下降并一直维持在较低水平。这可能与它波宁是文多灵的合成前体被消耗有关。长春碱的合成量从第一天开始缓慢上升,在第五天达到峰值。此外,从实验结果还发现,在接种细胞时,细胞中的各种生物碱含量几乎为零。
长春质碱和文多灵是合成长春碱的前体化合物。其中长春质碱是由异胡豆苷通过另外一个分支途径合成。在细胞合成培养初期,首先是两个上游产物它波宁和长春质碱快速增加,与这两种物质的代谢过程相吻合。在它波宁被合成之后,文多灵才能开始合成。并且再与长春质碱通过过氧化酶的催化而合成长春碱。在第五天文多灵和长春碱的含量均达到最大值,而长春质碱的最大值延迟到第六天。这是由于长春质碱的合成量比较大,与文多灵的产量不相匹配,所以也影响了长春碱的合成。到了第7天,各种吲哚生物碱的含量开始下降,这可能与长春花细胞开始进入生长阶段有关。根据以上实验结果,考虑药用价值最高的生物碱是长春碱,所以采用固液两步法进行合成培养时于第5天收获细胞最有利。
本文首先优化了生物反应器培养长春花细胞的搅拌速度和供气量参数。在此基础上又研究了长春花细胞在合成培养阶段的营养物质消耗规律以及各种吲哚生物碱的合成过程。实验结果表明,用EPC-500PE型植物细胞反应器培养长春花细胞的较优参数组合为搅拌速度150 rpm/0.5 mL/min供气量。长春花细胞在合成培养过程中蔗糖的消耗量约为初始添加量(30 g/L)的50%;长春花细胞偏好硝态氮,1/2 MS培养基的硝态氮基本可以满足细胞的需求。细胞几乎不消耗氨态氮。细胞对磷的消耗量是1/2 MS培养基中初始添加量的70%。长春碱的含量在第5天达到峰值,是收获细胞的有利时机。
图7. 吲哚生物碱的合成曲线
感谢“十一五”国家科技支撑计划项目–植物细胞大规模培养及生物转化技术研究课题(2008BAI63B04)的经费支持。
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