探讨第四代喹诺酮类药物加替沙星与稀土离子铽离子形成的配合物的荧光特性。应用荧光分光光度计测定药物加替沙星与稀土离子铽离子形成的配合物的荧光强度,通过加入表面活性剂、加入共发光离子La3+、改变溶液的pH等增敏方法选择最佳条件。镧对该体系具有较强的荧光增强效应,最佳的pH值为7.5,选用0.1 mol·L–1 NH4Cl-HCl效果最佳,加替沙星的最佳浓度为1.0 × 10–6 mol·L–1。对荧光新体系的荧光增强作用的机理进行了初步探讨,最终建立了Tb3+-La3+-GFLX-SDS新体系,上述研究对于稀土元素分析、生物和药物分析都具有潜在的应用价值,为稀土和喹诺酮类药物配合物的相关研究提供了一定的理论和实验基础,可以用于测定人工合成样品和制剂的含量,该方法选择性好,灵敏度高,结果令人满意。<br/> To study fluorescence of the forth generation of quinolones gatifloxacin and the rare earth ion complexes. Apply fluorescence spectrophotometry detects the fluorescence intensity of gatifloxacin and the rare earth ion com-plexes. Through the surface active agent, change pH and the emitting ions were added to enhance the fluorescence in-tensity to achieve the establishment of a high sensitivity, high selectivity of the fluorescent system. Tb3+-GFLX-SDS system can be strongly emitted by La3+, the best pH 7.5, GFLX 1.0 × 10–6 mol·L–1, 0.1 mol·L–1 NH4Cl-HCl. The fluo-rescence enhancement mechanism was discussed. Tb3+-La3+-GFLX-SDS new system was established. Rare earth ele-ment analysis for the study, biological and pharmaceutical analysis has potential applications for rare earth complexes of a quinolone-related research provide a theoretical and experimental basis. A test method based on this co-lumines- cence system was applied to the determination of the medicine content with satisfactory results.
喹诺酮类药物的出现,创造了合成抗生素的新时代[
荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。包括直接荧光分析法和间接荧光分析法。它的特点是快速、简便、灵敏度高、选择性好,近几年在传统的荧光分光光度法的基础上,一些新的技术、方法的建立和应用,在很多领域得到了广泛应用。主要是为了避免血、尿样品中内源性荧光物质的干扰[5-17]。多种喹诺酮类药物可以用稀土离子作为荧光探针法来测定,并且有多篇文献报道[18-20]。在测定司帕沙星的新方法中杜黎明等[
GFLX储备液(l.0 × 10–3 mol·L–1):精密称取已干燥至恒重的GFLX标准品0.0322 g,逐滴加入0.1 mol·L–1盐酸溶液使其溶解,定容至100ml容量瓶。
Tb3+储备液(1.0 × 10–2 mol·L–1):精密称取TbCl3·6H2O 0.3798 g,加水溶解,定容至100 ml容量瓶中,使用时逐级稀释。
La3+储备液(2.0 × 10–3 mol·L–1):精密称取LaCl3·6H2O 0.0706 g,加水溶解,定容至100 ml容量瓶中,使用时逐级稀释。
SDS储备液 (4.0 × 10–3 mol·L–1):精密称取SDS 0.1140 g,加水溶解,转移至100 ml容量瓶中,加水稀释到刻度。
SDBS储备液(3.0 × 10–3 mol·L–1):精密称取SDBS 0.1083 g,加水溶解,转移至100 ml容量瓶中,加水稀释到刻度。
β-CD溶液(l.0 × 10–3 mol·L–1):精密称取β-CD 0.1141 g,加适量水溶解,转移至100 ml容量瓶中,加水稀释至刻度。
CTMAB溶液(5.0 × 10–3 mol·L–1):精密称取CTMAB 0.1813 g,加水溶解,转移至100 ml容量瓶中,加水稀释到刻度。
GA溶液(l%):精密称取GA 1.0000 g,加适量水溶解至100 ml容量瓶中,加水稀释到刻度。
NH4Cl-HCl缓冲液(0.1 mol·L–1,pH 6.0):称取NH4Cl 0.5339 g加水溶解至100 ml容量瓶中,用盐酸调节PH至6.0。
NH4Ac-HAc缓冲液(0.1 mol·L–1):称取NH4Ac 0.7721 g加水溶解至100 ml容量瓶中,使用时用HAc调至所需要的pH值。
KH2PO4-NaOH缓冲液(0.1 mol·L–1):称取KH2PO4 1.3616 g加水溶解至100 ml容量瓶中,使用时调至所需要的pH值。
Tris-HCl缓冲液(0.1 mol·L–1):称取Tris 1. 2338 g,加适量水溶解至100 ml容量瓶中,使用时调至所需要的PH值。
NaAc-HAc缓冲液(0.1 mol·L–1):称取NaAc·3 H2O 1.3604 g加水溶解至100 ml容量瓶中,使用时调至所需要的pH值。
所用试剂除标明含量者均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。
于25 ml比色管中依次加入1.0 × 10–4 mol·L–1 Tb3+溶液,2.0 × 10–4 mol·L–1 La3+溶液,6.0 × 10–4 mol·L–1 GFLX溶液,4.0 × 10–3 mol·L–1 SDS溶液,NH4Cl-HCl缓冲液(0.1 mol·L–1, pH 6.0),加水稀释10 ml后摇匀,室温放置15 min,用1 cm荧光池,在激发波长330 nm,发射波长545 nm条件下测定荧光强度,激发光谱的狭缝宽度为10 nm,发射光谱的狭缝宽度为5 nm。
Tb3+(1),GFLX(2),GFLX-Tb3+(3),GFLX-Tb3+- SDS(4),Tb3+ -La3+-GFLX-SDS(5)体系的发射光谱如图1所示。Tb3+ -La3+-GFLX-SDS体系的激发峰在330 nm处,选330 nm为本体系的激发波长。发射光谱中1和2分别为Tb3+溶液和GFLX溶液的荧光峰,两者在545 nm处的荧光强度很弱,均不能检测到Tb3+的特征荧光。曲线3为GFLX-Tb3+配合物的荧光光谱,在图谱上能看到到此二元体系在545 nm处的荧光峰,但是荧光强度不强。曲线4为GFLX-Tb3+-SDS体系的荧光光谱,通过加入一定量的SDS表面活性剂后,SDS在水溶液中形成胶束,有效的保护了处于激发单重态的稀土离子少受或不受溶剂分子的碰撞,减少了能量损失,使Tb3+的特征荧光有了明显增强。而曲线5为Tb3+-La3+-GFLX-SDS配合物在激发波长330 nm激发下,于493 nm,545 nm,586 nm和623 nm处出现的
图1. 发射光谱:1. Tb3+, 2. GFLX, 3. GFLX-Tb3+, 4. GFLX-Tb3+-SDS, 5. Tb3+-La3+-GFLX-SDS Tb3+特征荧光峰,分别对应于Tb3+的5D4-7F6,5D4-7F5,5D4-7F4和5D4-7F3电子跃迁。其中以545 nm处荧光强度最大,故选择545 nm为发射波长。与曲线3相比,La3+ 的加入使体系的发光强度增大5倍。
GFLX属于第四代喹诺酮类药物,由于GFLX结构中含有羧基,其酸效应可能会影响GFLX-Tb配合物的配位平衡,而稀土元素在pH高的环境中可能形成稀土氢氧化物而破坏配位平衡,并以沉淀的形式析出,因此控制体系pH值对配合物稳定性是至关重要的。
本文在pH 4.0~10.0范围内测定了Tb3+-La3+- GFLX-SDS体系的荧光强度,其结果见图2。实验结果表明pH在6.0~7.0范围内体系荧光最强,故选择6.5作为最佳PH值。实验表明,不同的缓冲溶液对体系的荧光强度也有很大的影响,固定pH值为6.5试验了以下5种缓冲溶液对体系荧光强度的影响,NH4Ac-HAc缓冲液,Tris-HCl缓冲液,NaAc-HAc缓冲液,NH4Cl-HCl缓冲液,KH2PO4-NaOH缓冲液,实验结果表明0.01 mol·L–1 Tris-HCl效果最佳,用量为1.0 ml。
本文考察了共发光离子La3+浓度对体系的影响,实验结果如图3所示。当La3+离子浓度较小时,其荧
图2. pH对体系荧光强度的影响
光强度随其浓度的增加而增加。当La3+离子浓度为2.0 × 10–5 mol·L–1时体系的荧光强度达到最大;而La3+浓度再增加时,荧光强度就开始下降。因此,本实验中选择La3+浓度为2.0 × 10–3 mol·L–1作进一步研究。
不同的表面活性剂对Tb3+ -La3+-GFLX-SDS体系荧光强度的影响不同,本文对以下5种表面活性剂对体系荧光强度的影响进行了考察,结果见表1。实验结果发现,非离子表面活性剂(GA,β-CD)和阳离子表面活性剂(CTMAB)的增敏能力不大,而阴离子表面活性剂SDS与SDBS的增敏效果较好,其中又以SDS效果最佳,所以本文选择SDS作为增敏的表面活性剂。SDS的浓度对体系荧光强度的影响见图4,结果表明SDS的浓度在3.0 × 10–4~5.0 × 10–4 mol·L–1范围内体系的荧光强度能保持最大,所以本实验中选择SDS的浓度为4.0 × 10–4 mol·L–1。
本文考察了10种不同的试剂加入顺序对体系荧光强度的影响,结果见表2。实验结果表明,依次加
图3. La3+浓度对体系荧光强度的影响
表1. 不同表面活性剂的对体系荧光强度的影响
图4. SDS浓度对体系荧光强度的影响
表2. 加入顺序对体系荧光强度的影响
入Tb3+溶液,La3+溶液,GFLX溶液,SDBS溶液,NH4Cl-HCl缓冲液(0.1 mol∙L–1,pH 6.0),为最佳加入顺序。在最佳实验条件下,体系配好后即产生荧光,5 min后荧光强度达最大,且在2 h内基本不变,随时1间延长体系荧光强度呈下降趋势。故实验溶液荧光强度的测定应选在配制完成后15 min,此时灵敏度最大,准确度最高。
在最佳实验条件下,固定加替沙星浓度为1.0 × 10–6 mol·L–1,对体内常见Cu2+,Fe3+等离子的影响进行了研究。在相对误差为±10%范围内,干扰物质的最大容许浓度如表3所示。实验表明,大部分的离子对本实验影响较小。
在最佳实验条件下,建立了GFLX的浓度与荧光强度之间的工作曲线,其结果表明,GFLX在2.0 × 10–8~1.0 × 10–6 mol·L–1范围内与荧光强度呈良好的线性关系。相关系数r2为0.9901,线性方程: If = 570.99 CGFLX + 293.14.检出限1.0 × 10–9 mol·L–1。
本方法亦应用于加替沙星胶囊的含量测定。取诺加替沙星星胶囊10粒经称重、研细、称取、溶解、过滤、转移后,采用标准曲线法进行测定。该产品标示量为100 mg/粒,测得量为98.6 mg/粒,回收率为98.6%,RSD = 1.2% (n = 5)。
本文用新建立的GFLX-Tb3+-SDBS荧光体系和紫外分光光度法分别对加替沙星注射液中GFLX的含量进行测定,其结果见表4,结果表明两种方法测得的含量差别不大。加替沙星:批号H20050846,规格100 mg/50ml,结果表明荧光法简便准确。
稀土离子荧光探针方法在得到广泛应用的同时对它的灵敏度、选择性以及体系稳定性的要求也越来越高,目前主要通过1) 表面活性剂加入;2) 在稀土二元配合物中,另一个配位体的引进,即协同配体(或第二配体);3) 稀土共发光效应三个方面来改善。共发光效应也叫协同发光效应[
表3. 干扰物质的最大允许浓度
表4. 加替沙星的含量
协同发光机理,灵敏度和体系的稳定性极大提高[24,25]。本文在加替沙星和铽的荧光体系下,通过表面活性剂加入,使得该体系的荧光强度得到了明显的提高,增强了约5倍。并详细研究了Tb3+-La3+-GFLX-SDS体系的荧光光谱特性和对本体系具有一定影响作用因素的确定。通过上面一系列的实验,最终建立了Tb3+- La3+-GFLX-SDS新体系,并且用此方法测定加替沙星。该方法操作简便,不需要对样品进行复杂的预处理,灵敏度高,选择性好,适用于注射剂中加替沙星的含量测定,结果表明荧光法简便准确。
在此感谢黑龙江省科技厅科研项目(B201015),佳木斯大学研究生创新科研项目专项资金(YJSCX2012- 037JD),佳木斯大学重大培育科研项目(LZP2011- 003),2012年佳木斯大学“大学生创新创业训练计划”校级项目(2012xjo55,A-37),黑龙江省中医药管理局科研项目(ZHY12-Z195)及黑龙江省教育厅科研项目(11551482)对本文研究工作的大力支持。
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