首先提取B73玉米(Zea mays)的基因组DNA,以此为模板利用PCR的方法克隆Zea mays salt-inducible protein kinase(STY2)基因上游1675 bp,将其命名为STY。从网站PlantCARE上的启动子预测工具在线对克隆到的启动子进行分析,结果表明:STY启动子中含有多种调控元件,典型的调控元件有:TATA-box,CAAT-box等等。另外还有2个盐诱导顺式作用元件GT1-motif和一些冷、干旱胁迫诱导有关的顺式作用元件,以及功能未知的元件。然后将克隆到的基因与植物双元表达载体pCAMBIA1301连接,并将其转入根癌农杆菌EHA105中,然后利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS组织化学染色验证STY的诱导功能。研究表明:STY启动子片段具有启动活性,为解决东北地区农业生产中严重的多元逆境胁迫问题开辟了有效途径。 The upstream nucleotide sequence of maize salt-inducible protein kinase, named STY, was isolated from the genomic DNA of maize by PCR. Promoter sequence analysis by PlantCARE showed that it had some typical cis-elements, including TATA box and CAAT box. In addition, there were two salt responsive elements GT1-motif, various phytohormone responsive elements and stress responsive elements in the promoter sequence. The fusion gene of STY promoter and GUS were constructed and named pCAM-STY. The vector was trans-formed into Agrobacterium tumefaciens. The vector containing STY promoter was transferred into tobacco by Agrobacterium tumefaciens mediated method, function of STY promoter was analyzed by identifying activation of GUS using histochemistry staining. The results indicated that the promoter activated expression of GUS re-port gene, It laid the foundation to resolve the serious multi-stress problems of agriculture in northeast of China.
玉米(Zea mays)是全世界总产量最高的粮食作物,由于长期受低温、干旱、盐渍等多元逆境胁迫的干扰和伤害,形成了一些特有的抗逆机制。植物的生长发育受基因调控,启动子是调控基因表达的关键元件之一[1,2]。目前基因工程中存在的首要问题是外源基因的表达水平、表达部位等问题,而启动子在决定基因表达方面起关键作用。
东北地区现有的盐渍土地大约占耕地面积的5%[
在植物中胁迫诱导基因的表达调控主要是通过转录因子与其启动子序列相互作用而实现。因此,胁迫诱导型启动子在植物抵御逆境胁迫反应中的作用越来越受到人们的重视。选择适宜的启动子来驱动目的基因在转基因植物中表达,已成为植物基因工程研究的热点问题之一。针对不同的目的基因,人们选用不同的启动子,从而使靶基因在特定组织或条件下选择性表达,以利于转基因植物的正常生长发育[4,5]。对植物在盐逆境下表达的耐盐基因启动子研究表明,不同耐盐基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件,并受相同的作用因子的调控。这为我们提供了另外一条研究植物耐盐机制的途径。
本研究从玉米B73中克隆得到了盐诱导型启动子(STY),构建了表达载体,转化农杆菌,并对其活性进行了初步验证,为以后开展利用转基因技术改良玉米抗逆品质研究奠定基础。
1) 材料
供试玉米品种为“B73”,由本实验室保存。
2) 菌株
植物表达载体pCAMBIA1301质粒、大肠杆菌(E. coli)DH5α、根癌农杆菌(A. tumefaciens)EHA105均为本实验室保存。
3) 试剂
克隆载体pMD18-T Vector、Ex Taq和T4 DNA Ligase以及限制性内切酶均购自大连宝生物公司;引物的合成、测序由上海生物工程技术有限公司完成;PCR产物回收采用多功能DNA纯化回收试剂盒,购自北京百泰克生物技术有限公司;酚、氯仿等有机溶剂以及其它试剂均为进口或国内分析纯;硫酸卡那霉素(Kan)、氨苄表霉素(Amp)、利福平(Rif)等抗生素均购自北京鼎国生物技术公司。
在NCBI网站上查找“inducible promoter”,将搜索到的启动子在玉米基因组数据库 (http://www.maizegdb.org)中通过序列比对找出该启动子在玉米基因组中的上游序列,通过启动子在线预测网站PLACE (http://www.dna.af2frc.go.jp/PLACE/signal.Scan.html)和PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/wetools/plantcare/html)对序列进行分析,由此来确定目的基因。
利用Primer5.0对STY启动子序列设计引物,然后由上海生物有限公司合成。具体为上游引物STY-F:5′-CGGAATTCGGTGTTACAAATAGGTTCTTGG-3′(下划线为EcoR I酶切位点),下游引物为STY-R: 5′-CATGCCATGGATGATACAGGTGGAGTAC-3′(下划线为Nco I酶切位点)。采用CTAB法[
将测序后的阳性克隆质粒、植物表达载体pCAMBIA1301质粒用限制性内切酶EcoR I和Nco I分别进行酶切,37℃过夜,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,回收目的片段以及载体大片段。将含有EcoR I和Nco I酶切位点粘性末端的目的片段、pCAMBIA1301载体大片段进行连接,将构建好的质粒pCAM-STY用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105。
先将无菌烟草切成大约0.5 cm × 0.5 cm小块,将小块烟草平放于预分化培养基中,25℃,放入组培室培养1~2 d。将预培养过的烟草叶片放入菌液中,抽真空5~10 min左右取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后把叶片放于MS培养基上,25℃暗培养3 d。经过共培养的叶片转移到含有选择压的分化培养基中(含有潮霉素的MS培养基),置于组培室中培养。每10 d更换一次培养基,直到长出抗性芽。
对转化的烟草进行筛选。将获得的转基因的烟草叶片进行GUS染色[
提取玉米B73幼苗叶片总DNA,然后以此为模板,根据目的基因上游启动子序列设计特异性引物,对其进行PCR扩增。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果发现,在1675 bp的位置上有一个特异性条带,该条带测序结果与预期相一致,并命名为STY。将该条带回收纯化后,与pMD18-T载体相连,经过PCR(图1)及质粒酶切鉴定,获得阳性重组质粒,命名为pMD18-STY。将阳性重组质粒酶切后回收目的片段,测序结果与预期相一致,证明已经克隆到目的片段STY。
通过在线对获得的STY启动子序列进行分析,结果表明:STY启动子中含有多种调控元件(图2),典型的调控元件有:TATA-box,它是RNA聚合酶Ⅱ结合的位点[8,9];CAAT-box,与转录起始频率有关[
将植物双元表达载体pCAMBIA1301和pMD18- STY分别用EcoRⅠ和NcoⅠ双酶切后,将目的片段与酶切后的pCAMBIA1301载体大片段用T4 DNA ligase进行连接,得到植物表达载体。将构建好的植物表达载体转化大肠杆菌DH5α,对重组阳性质粒进行菌液PCR验证(图3)和双酶切(图4)验证,都获得预期大小为1675 bp的目的片段,证明该植物表达载体构建正确,命名为pCAMBIA1301-STY。
将构建好的植物表达载体pCAMBIA1301-STY质粒转入热激农杆菌感受态中,挑取阳性菌落振荡培养,用菌液进行PCR验证,结果表明,扩增出了1675 bp的目的条带;对菌液提取质粒后,转入大肠杆菌感受态细胞中,同样挑取阳性菌落振荡培养,提取质粒进行酶切验证,也得到了1675 bp的目的条带。以上结果表明,已经成功地将真核表达载体转入了农杆菌,以便后期的活性及功能验证。
图1. STY启动子的PCR扩增。1、2:PCR扩增,Marker自上到下1849 bp、1470 bp、1090 bp、738 bp、424 bp
图2. STY启动子序列及分析
图3. pCAMBIA1301-STY质粒PCR验证。1~4:PCR扩增,Marker自上到下大小为:1849 bp、1470 bp、1090 bp、738 bp、424 bp、280 bp
图4. pCAMBIA1301-STY质粒酶切证。1:重组质粒;2:重组质粒EcoRⅠ、NcoⅠ酶切,Marker自上到下大小为:1849 bp、1470 bp、1090 bp、738 bp、424 bp、280 bp
将STY侵染过的玉米胚经过盐诱导后放入GUS染色液中做瞬时表达,观察玉米胚,发现染成蓝色(图5)将转化的烟草叶片放入GUS染色液中,37℃染色过夜,放置脱色液中50度水浴1小时后观察烟草叶片被X-Gluc溶液染成蓝色(图6),说明启动子STY能启动GUS表达,具有启动活性。
农作物在生产中经常受到非生物胁迫因子的胁迫如盐碱化、洪涝、干旱、低温等,严重影响农作物的产量。在这些非生物胁迫中,土壤盐碱化、干旱、低温是主要的胁迫因子,制约着农作物的生长发育、影响农作物的质量和产量。盐胁迫和干旱使植物缺乏水分,导致植物细胞的渗透势有所降低,产生大量活性氧进而迫害植物。因此,研究组织逆境诱导型启动子意义重大。目前在植物的遗传转化中使用广泛的启动子有花椰菜花叶病毒(CaMV)的35 S启动子、水稻肌动蛋白基因(Actin1)的启动子和玉米泛素基因(ubiquitin)的启动子[
在适宜的条件下,外源基因通过基因枪轰击法转话后数小时就可以检测到其产物的表达,并在1~2 d内达到最高峰,然后又慢慢地降低至完全消失,这种外源基因可以在短时间内得以表达的情况称之为瞬
图5. 瞬时表达的玉米胚的GUS染色结果:(a) 35 S启动子(阳性对照);(b) 未诱导的STY启动子(阴性对照);(c) 经过盐诱导的STY
图6. 转基因烟草叶片GUS染色结果:(a) 未侵染烟草叶片;(b) pCAM-STY烟草叶片
时表达。这种分析方法是检测一个启动子是否拥有启动活性最常用的方法。运用GUS的瞬间表达系统对于一些转录因子的相互作用和特异启动子对于基因的调控特性可以很好的进行检测[15,16]。Kawagoe等[
玉米是我国主要的粮食作物,在农业生产中占据重要地位,同时对逆境比较敏感,其抗逆启动子的研究较为广泛且相对来说比较成熟,因此我们选择从玉米中分离并克隆逆境诱导启动子,验证其活性并找出功能区域。本研究通过常规PCR方法从玉米中分离了高盐诱导型STY启动子,序列分析表明该启动子区存在大量的植物逆境应答元件,如响应干旱失水应答元件MYB/MYC,盐诱导顺式作用元件GT1-motif和一些冷、干旱胁迫诱导有关的顺式作用元件;在STY启动子序列中出现的这些与逆境应答相关的顺式作用元件预示着该基因可能在植物的逆境应答中发挥重要作用。通过叶盘转化法转化烟草,GUS染色初步表明STY具有一定的启动活性,要找到具有特定调控功能的区域(逆境诱导)还应该构建缺失表达载体,用同样的方法进行GUS表达分析,所以还有待于进一步完善,从而为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。
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