循环无细胞DNA是一种无细胞状态的胞外DNA,广泛存在于人体体液中。近年来,对循环无细胞DNA的研究逐渐受到人们的重视,越来越多的研究将循环无细胞DNA与临床疾病的关系联系起来。现将近年来有关循环无细胞DNA检测的研究及循环无细胞DNA在肝病中的研究进展作一综述。 Circulating-free cell DNA (cfDNA) is a class of extrocellular DNA without cellular structure, presenting ex-tensively in human body fluids. Recently, cfDNA has gradully received more attention, and extensive studies have in-dicated the relationship between cfDNA and clinical diseases. Here, we review the researches about detection of cfDNA and the research progress about cfDNA in liver disease in recent years.
游离循环核酸(free circulating nucleic acids)是一种存在于动植物和人体体液中的细胞外游离状态的核酸,包括循环无细胞DNA(circulating-free cell DNA, cfDNA)和循环无细胞RNA(circulating-free cell RNA, cfRNA)。其中,cfDNA是一种无细胞状态的胞外DNA,广泛存在于人体的血清和血浆等体液中。近年来,对cfDNA的研究逐渐受到人们的重视,越来越多的研究将cfDNA与临床疾病的关系联系起来。现将近年来cfDNA在肝病中的研究进展作一综述。
1948年,法国科学家Mandel和Metais发表了人血浆中存在细胞外核酸的惊人发现,由于当时的技术限制,一直未引起注意[1]。几十年后,研究植物冠瘿肿瘤的Anker和Stroun发现,这些植物肿瘤的继发转移是通过循环无细胞核酸而不是完整的细胞,其随后的研究表明,从癌症病人血浆或血清中分离出的cfDNA隐藏一些肿瘤相关改变。1977年Leon等用放免法发现肿瘤患者血清cfDNA主要来源于肿瘤细胞,浓度水平达(180 ± 38) ng/ml[
最近,对cfDNA的研究逐渐受到人们的重视,越来越多的研究将cfDNA与临床疾病的关系联系起来。CA125-cfDNA可以在卵巢癌尤其卵巢粘液性囊癌诊断和监测中作为血清CA125的一个有效的补充[
肿瘤特异性cfDNA改变包括cfDNA大小的改变,癌基因的突变、微卫星的改变以及抑癌基因启动子高甲基化等。
cfDNA来源于凋亡和坏死的细胞,凋亡时由于程序酶解的结果,自凋亡细胞释放的cfDNA大小在185~200 bp。因此,可以用较长cfDNA和较短cfDNA的多少来推测来源。Wang等[
微卫星是一段重复的DNA序列,大小2~6 bp,因为DNA的不同有不同的可变长度,适当的引物可以使其放大DNA片段,从而可以用作染色体微卫星标志物,并且这种标志物有一个嵌合体,可以用于肿瘤的分析描述。关于肿瘤病人cf-DNA中微卫星的改变,已经有许多研究报告发表,包括头颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌等病人。在头颈癌病人研究中,1/3显示血清中有一个以上的微卫星标志物与原发肿瘤相符。但是,von Knobloch等[
抑癌基因启动子高甲基化是抑癌基因失活的一个重要机制。常用于检测是否发生甲基化的基因有谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)、O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)和P16等。P16基因启动子的甲基化检测,在肺癌和肝癌中较常见。Goessl等将血浆GSTP1甲基化应用于前列腺癌的诊断,发现72%患者的血浆中可检测到,而良性对照者的组织及血浆中均为阴性。在其他恶性肿瘤中,GSTP1甲基化发生率远低于前列腺癌,认为GSTP1甲基化对于诊断前列腺癌特异性较好[
血清中的核酸(DNA或RNA)水平可以准确的反映病原体的复制能力。现有的定量血清中cfDNA的方法主要有两类,一是以聚合酶链反应(PCR)为基础,如竞争PCR、荧光定量PCR等,另一类是以核酸杂交为基础,如斑点杂交试验、纸层析杂交试验和树状DNA(branched DNA, bDNA)杂交试验等。这些技术均不能做到敏感性、特异性、精确性和稳定性兼顾[13-15]。
PCR技术发展的最为迅速,最早的是RT-PCR,目前,国内外应用较多的是实时荧光定量PCR,检测敏感性和特异性不断提高,且实现了全自动定量检测,宜于临床推广。但是,由于血清中cfDNA含量极少,从中提取游离DNA受到限制,提取DNA的浓度和纯度不容易达到理想的效果。
纸层析杂交试验[
bDNA杂交技术是新近发展起来的一项新技术,可在组织和细胞水平上对特异性基因进行亚细胞定位和一定水平的定量分析,具有很高的灵敏性和特异性,不仅可以用于DNA或RNA的检测,也可以用于检测细胞内基因的表达水平,应用前景非常广阔。bDNA杂交技术与PCR技术相比,它只放大杂交信号,不扩增靶序列,因而不存在假阳性[17-19]。该技术最初用于病毒核酸的检测,如人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)RNA、乙肝病毒(HBV)DNA、巨细胞病毒(CMV)DNA等,进一步应用于细胞内mRNA表达水平的检测和定量。目前,一种类似酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)的检测手段,选择敏感度和特异性较好的重复序列Alu,为在亚临床期及时发现肿瘤及其复发或转移提供可能,该技术示意图见图1。Alu家族[
图1. bDNA技术示意图
图2. Alu序列结构图
Alu I识别并切割(AG↓CT),这就是Alu家族名称的由来。Alu序列的两翼存在长度为7~20 bp的正向重复序列。Alu元件由两个单体组成,右单体比左单体多31 bp,每个单体保留了一个RNA聚合酶Ⅲ的启动子,然而只有左单体中的启动子才有活性。在两单体之间有一个A富含区,同时在Alu序列的3’翼还有一个长约200 bp的poly (A)尾,在Alu序列中存在大量Cp G岛。Alu家族占到了人类基因组的5%~10%,以不同的密度分散于整个基因组中,每个拷贝的平均间隔只有4 kb,而实际上可能更加密集,基因组全部基因的四分之三都和Alu有关。Alu序列作为人类基因组应用广泛:第一例癌基因就是利用Alu序列作为标记物从人肿瘤DNA转化的啮齿类细胞系中分离得到的;Alu探针与人细胞基因组DNA上的Alu序列杂交,通过观测探针的荧光量来判断人细胞的存在与否及存在的数量[
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,尽管近年来HCC的临床治疗取得了很大的进展,部分患者得到了较早的诊断并获得了及时的治疗,但总体的预后情况仍不是十分理想。能够引起肝细胞癌的病因有很多,其中最重要的一个病因就是乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)或丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)的慢性感染。肝炎病毒感染的病原诊断和抗病毒疗效判断主要依赖血清特异性抗原抗体和肝炎病毒DNA的检测。
研究显示肿瘤病人的外周血中cfDNA的含量明显增加,伴有转移的肿瘤病人更是高于早期病人,且在cfDNA中可检测到与原发肿瘤细胞相一致的分子遗传学特征。因此,对外周血cfDNA用于HCC的研究逐渐受到人们的重视,越来越多的研究将重点转移到外周血cfDNA与HCC的关系上来。
乙型肝炎是我国最常见的高发病率和高死亡率的传染性肝病,慢性乙型肝炎患者如果得不到及时的诊断和治疗,有可能进一步发展成为肝硬化,甚至进一步发展为肝癌,导致患者死亡。目前,有关cfDNA在肝脏疾病中的相关研究报道不多见,特别在国内研究报道甚少。肝癌、肝硬化及活动性肝炎患者血浆cfDNA水平高于健康人,伴肝内转移灶或脉管癌栓的HCC患者血浆cfDNA浓度明显高于不伴有肝内转移灶或脉管癌栓的HCC患者血浆cfDNA浓度,且血浆cfDNA浓度与肝癌患者肿瘤大小、TNM分期、2年无肿瘤生存率、1年和2年总体生存率密切相关[
丙型肝炎是一种主要经血液传播的肝脏疾病,丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC),是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。Tokuhisa Y.[
检测血清cfDNA(定量和定性)简便易行、创伤小,尤其可作为对于手术后无法作组织取样的肿瘤患者的实时监测手段。但是,目前仍存在不少未解决的问题:比如患者肝功能异常、免疫状态等对cfDNA的影响;如何提高精确定量分析cfDNA的敏感性和特异性,以期建立能够用于临床的明确的诊断标准和随访指标;目前检测血清cfDNA主要依靠PCR技术,易产生假阳性,又由于肿瘤的异质性,即同一肿瘤可表达不同的DN水平,会产生假阴性。因而不断引用新技术,改进检测思路,提高灵敏度和特异性。血清cfDNA除在临床诊断应用方面的研究外,有关其来源、性质、动力学等方面仍有很多问题值得探讨。游离核酸对抗体可能产生的作用,清除机制,是否参与疾病的发生、发展,是否参与肿瘤的复发和转移等也都有待进一步研究。
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