红花既是传统药用植物,也是一种新型油料经济作物。本研究利用SRAP技术对来源于不同地区的11个红花品种进行了条带分析。建立了红花种内SRAP-DNA的PCR扩增体系并进行了优化,进一步将最佳反应体系由25 μL减至10 μL,体系包括:Taq酶浓度0.04 u/μL,dNTP浓度为0.2 mM,正反引物浓度为0.3 mM,Mg2+浓度为2.0 mM,DNA模板为20 ng。为检测该优化体系的稳定性,选用了35对引物组合对11个分布于我国不同区域的红花品种进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳,筛选出25对具有多态性条带的引物组合,获得了308条清晰的条带,其中109条具有多态性,比率为35%,说明用SRAP分子标记对于红花种内不同品种资源系统评估是完全可行的。红花SRAP反应体系的建立为深入评价红花的遗传多样性、分子辅助育种等研究奠定了基础。<br/>Safflower is a traditional medicinal plant, and also a new kind of oil economic crops. In this paper, the SRAP technology was used to analysis 11 safflower varieties. A SRAP-DNA PCR amplification system was established and optimized. The reaction mixture system was decreased from 25 μL to 10 μL, which contained: Taq DNA polymerase 0.04 u/μL, dNTP 0.20 mM, primers0.3 mM, MgCl2 2.0 mM, genomic DNA template 20 ng. In order to test the stability of SRAP-PCR system, the PCR amplification and polyacrylamide gel electrophoresis were used to analyse 11 safflower varieties with 35 primer pairs. 25 pairs of primers combination with polymorphism bands and 308 clear bands were obtained, 35 percent (109/308) bands were polymorphic. Therefore, the SRAP molecular marker system for safflower variety assessment was reliable. This research had put the foundation for genetic diversity research and molecular marker-assisted breeding of safflower.
红花(Carthamus tinctorius L.)为菊科红花属1~2年生植物,又名红蓝花、草红花、杜红花、刺红花等,具食用、药用、染料和饲料等广泛用途,喜温暖干燥气候,有较强的抗旱、抗寒、耐盐能力,不耐涝。原产埃及,现多栽培于中亚、西南亚及地中海地区。我国红花栽培历史悠久,早在汉代就有关于红花栽培和药用的记载[
SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)是Li等(2001)[
本研究采用的红花材料种植于中南民族大学温室,红花材料产地见表1。苗期采取嫩叶,洗净并用吸水纸吸干,直接用于DNA提取或−80℃冰箱保存。
Taq酶与buffer均购自Fermentas公司,dNTP购自罗氏公司,引物为北京六合华大基因武汉分公司合成。
采用CTAB微量法提取红花全基因组DNA。具体步骤如下:取红花嫩叶1.0 g,液氮研磨成粉末转入1.5 mL离心管中;加入12%CTAB,65℃水浴1 h;加入等体积氯仿/异戊醇(24/1),振荡混匀20 min;在室温下用8000 rpm的速度离心20 min,取上清;再次加入等体积氯仿/异戊醇(24/1)抽提,振荡20 min,室温下8000 rpm离心20 min,取上清液;加入2/3体积异丙醇,混匀,室温下8000 rpm离心10 min,去上清;用500 μL 75%乙醇冲洗沉淀,8000 rpm室温10 min,去上清,充分干燥;加入200 μL TE溶解,−20℃保存
表1. 红花种名与产地
备用。
引物序列合成见表2。
根据Li和Qμiros[
扩增反应总体系设计为10 μL,其中设计Taq酶浓度(0.2 u、0.4 u、0.6 u),dNTP浓度(0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM),引物浓度(0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM)三因素三水平共27次的梯度实验(见表3),Mg2+浓度(0.5 mM、0.8 mM、1.1 mM、1.4 mM、1.7 mM、2.0 mM、2.3 mM、2.6 mM、2.9 mM、3.2 mM)单因素十个水平的梯度实验。
本研究采用CTAB微量法提取红花基因组DNA,
表2. SRAP引物序列
表3. Taq酶、dNTPs和引物浓度
提取的产物足以满足SRAP反应的要求。参考已报道文献[
根据表3进行Taq酶、dNTPs、引物三因素浓度反应,扩增产物经琼脂糖检测。据图1结果表明,Taq酶浓度对扩增产物清晰度影响较大,当Taq酶浓度为0.02 u/μL时扩增产物条带较弱。引物浓度在0.3~0.4 mM范围内,并未产生引物二聚体,浓度大小对产物条带影响不大。dNTPs作为合成产物的原料需要足量来满足扩增反应的要求,因此取dNTPs浓度为0.2 mM。
因此根据产物稳定性及经济性原则,选择图1第13号泳道,确定Taq酶浓度为:0.04 u/μL,dNTP浓度为:0.2 mM,引物浓度为:0.3 mM。
本研究对Mg2+浓度进行了十个水平的梯度实验,并将扩增产物进行琼脂糖凝胶检测。从图2中可以看出当Mg2+浓度在0.5 mM时条带微弱,而在浓度 > 2.6 mM时条带会减弱。在1.5 mM~2.6 mM的范围内,扩增无明显差异,因此将Mg2+浓度取2.0 mM。
利用优化后的体系,对11个红花品种进行SRAP
图1. Taq酶、dNTP、引物三因素浓度对反应的影响
图2. Mg2+对SRAP-PCR反应的影响
反应,扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。图3结果显示,优化体系扩增的效果比较理想,谱带清晰,多态性较好,主带明显。重复试验,进行稳定性检测。重复性较好,表明该体系适用于红花DNA-SRAP反应。运用本体系,选用35对引物组合进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳,筛选出25对具有多态性条带的引物组合,获得了308条清晰的条带,其中109条具有多态性,比率为35%(结果未列出)。
在SRAP反应中想获得稳定、清晰的扩增产物,则对模板的质量与纯度要求很高。DNA的提取过程中要尽量去除蛋白质、RNA、多糖、色素和一些小分子物质[
本研究先进行Taq酶、dNTP、引物三个因素浓度的优化,再对Mg2+浓度进行确定,最终确定最为优化的反应体系为:Taq酶浓度0.04 μ/μl,dNTP浓度0.2
图3. 利用优化的体系对不同品种红花进行PAGE分析(引物Me4/Em6)
mM,引物浓度0.3 mM,Mg2+ 2.0 mM,DNA模板量20 ng,体系总体积10 μl。在本实验中,由图1可以看出,Taq酶浓度对反应影响较高,当酶浓度过低时,条带较弱。此前也有研究者使用25 μl体系[
此前的报道[
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