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Open Journal of Fisheries Research
Vol. 09  No. 01 ( 2022 ), Article ID: 48994 , 12 pages
10.12677/OJFR.2022.91001

黄沙鳖β-防御素基因家族的鉴定及 生物信息学分析

杨廷雅1，魏华1，蒙兰丽2，吴志刚1，谭雯予1，杨祖鹏1，唐潇毅1，廖幸1，莫昱铭1， 梁静真1*

1广西大学动物科学技术学院，广西水生动物病害诊断实验室，广西 南宁

2田东县水产技术推广站，广西 百色

收稿日期：2022年1月28日；录用日期：2022年2月11日；发布日期：2022年2月25日

摘要

β-防御素是一种富含半胱氨酸的小分子阳离子抗菌肽，在生物机体天然免疫中发挥重要的作用。本研究基于黄沙鳖转录组数据库和PCR验证鉴定了黄沙鳖β-防御素基因(Hs-BDs)家族，并对其进行蛋白理化性质、蛋白结构和进化关系等生物信息学分析。实验结果表明，共鉴定出18个具有完整蛋白编码区的Hs-BDs家族成员，这些Hs-BDs编码蛋白的氨基酸残基数量在59~94之间，蛋白分子量介于6759.13~10731.32 Da，等电点在8.82~10.45之间。系统进化树分析可将18个Hs-BDs家族成员分为4个亚类(Class I~IV)。随机选择部分Hs-BDs进行蛋白结构分析，这些Hs-BDs前体蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-折叠片和无规则卷曲3种结构组成；成熟蛋白三级结构预测结果显示6个保守的半胱氨酸残基分别以Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6的方式连接形成3个分子内二硫键。本文结果可为进一步研究黄沙鳖β-防御素基因家族的详细功能以及抗菌肽的研发提供基础数据。

关键词

黄沙鳖，β-防御素基因家族，序列分析，生物信息学

Identification and Bioinformatics Analysis of β-Defensin Gene Family in Huangsha Soft-Shelled Turtle

Tingya Yang1, Hua Wei1, Lanli Meng2, Zhigang Wu1, Wenyu Tan1, Zupeng Yang1, Xiaoyi Tang1, Xing Liao1, Yuming Mo1, Jingzhen Liang1*

1Guangxi Aquatic Animal Disease Diagnosis Lab, College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning Guangxi

2Tiandong Station of Aquaculture Technology Extension, Baise Guangxi

Received: Jan. 28th, 2022; accepted: Feb. 11th, 2022; published: Feb. 25th, 2022

ABSTRACT

β-defensin is a small cationic antimicrobial peptide rich in cysteine, which plays an important role in innate immunity of the living organism. In this study, the β-defensin genes of Huangsha soft-shelled turtle (Hs-BDs) family were identified based on transcriptome database of Huangsha soft-shelled turtle and PCR validation, and the physicochemical properties of protein, protein structure and evolutionary relationship were also analyzed. The results showed that a total of 18 members of Hs-BDs family with complete coding regions were identified. The number of amino acid residues of these Hs-BDs proteins ranged from 59 to 94, the molecular weight ranged from 6759.13 to 10,731.32 Da, and the isoelectric point ranged from 8.82 to 10.45. The 18 members of Hs-BDs family were divided into four subgroups (Class I~IV) according to the phylogenetic tree analysis. Some Hs-BDs were randomly selected for protein structure analysis and the results showed that the secondary structures of Hs-BDs preprotein are mainly composed of α-helix, β-sheet and random coil. Six conserved cysteine residues were linked to form three intramolecular disulfide bonds in the form of Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 and Cys3-Cys6, respectively. The results of this study can provide basic data for further research on the detailed functions of β-defensin gene family and the development of antimicrobial peptides.

Keywords:Huangsha Soft-Shelled Turtle, β-Defensin Gene Family, Sequence Analysis, Bioinformatics

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

β-防御素是一种富含半胱氨酸(6~8个Cys残基)的小分子(3~5 kDa)阳离子短肽 [1]，是生物体天然免疫的重要组成部分。β-防御素具有广谱的抗微生物活性，无论在细胞内或细胞外，都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物 [2]，例如大菱鲆(Scophthalmus maximus) β-防御素SmBD [3] 对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、链球菌(Streptococcus)和大肠杆菌(Escherichia coli)均具抗菌活性，鸡β-防御素AvBD-1、AvBD-4、AvBD9、AvBD-10能抑制真菌生长繁殖，对白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)和黄曲霉(Aspergillus flavus)表现出不同浓度的抑菌活性 [4] [5]；重组小鼠β-防御素3 (rMBD3)对甲型流感病毒感染小鼠有保护作用；鸭β-防御素16 (AVD16)重组蛋白具有抗鸭肝炎病毒的活性等。β-防御素还能通过诱导细胞因子的释放和介导未成熟树突状细胞协同刺激分子的表达上调，促进未成熟树突状细胞的成熟，进而活化T细胞，触发特异性免疫应答，还能杀灭一些诸如HIV、疱疹病毒、水泡型口炎病毒等的被膜病毒 [6] [7] [8] [9]。β-防御素能与多个趋化受体结合，诱导促炎因子的表达，通过阻止脂多糖诱发的炎症来起到抗炎的作用 [9]，部分β-防御素还可以促进伤口的愈合，参与生物机体的生长和发育进程 [10]。迄今为止，国内外在β-防御素方面进行了大量的研究，β-防御素在基因工程和医药领域呈现广泛的应用前景 [11]。

β-防御素的研究逐渐成为生物分子领域研究的热点，其研究体系逐渐完整，然而爬行动物β-防御素的研究起步相对较晚。首个爬行动物的β-防御素TBD-1发现于欧洲池塘龟(Emysorbicularis)的白细胞中。后来分别在鳄蜥(Shinisaurus crocodilurus)、响尾蛇(Crotalus durissus terrificus)、乌龟(Mauremys reevesii)、鳄鱼(Crocodylus siamensis)、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)、刺鳖(Apalone spinifera) [12] 中也发现了结构类似β-defensin的阳离子小肽。中华鳖(Trionyx Sinensis) β-防御素Ps-BD2重组蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 08032706、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 08042313和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) 09021325抑菌效果较好，并且其最小抑菌浓度(MIC)低于氨苄青霉素 [13]。黄沙鳖β-防御素基因Hs-BD1 [14] 在温和气单胞菌(Aeromonas sobria)攻毒后，其基因相对表达量也有显著的上调，表明其可能在抗菌过程中发挥一定的作用。

黄沙鳖属于脊索动物门爬行纲中的无孔亚纲，是中华鳖的地方品种 [15]，主要分布在广西左江、右江和广东的西江流域，是西江水系的特有鳖种 [16]。黄沙鳖体色金黄，裙边宽厚，肌肉紧实，肉质鲜美，富含多种维生素和人体必需的氨基酸，其中维生素生A、谷氨酸、门冬氨酸和赖氨酸等含量较高，具有较高的营养价值和经济效益 [17]。近些年来，由于养殖户过度追求经济效益，不断扩大黄沙鳖养殖规模和养殖密度，导致黄沙鳖细菌性疾病大量爆发，加上抗生素的滥用导致部分病原菌产生了耐药性，影响药物治疗效果，甚至产生食品质量与安全的问题，对广西黄沙鳖养殖业的健康发展构成了严重的威胁 [18] [19] [20]。

目前，许飘尹等 [14] 已成功克隆了首个黄沙鳖β-防御素基因Hs-BD1，但黄沙鳖β-防御素基因家族的其他成员特征尚未有系统研究。鉴于此，本文基于黄沙鳖转录组数据库鉴定黄沙鳖β-防御素基因家族成员，并对其进行蛋白理化性质、蛋白结构和进化关系等生物信息学分析，可为进一步深入研究这些基因的详细功能以及抗菌肽的研发提供基础。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

健康黄沙鳖购于广西南宁市雷康黄沙鳖养殖场，平均体质量为150 ± 20 g，规格均一，转移至广西大学水产养殖基地检疫养殖一个月无异样后，采取随机抽样的方式选取3只生长状况良好的黄沙鳖进行实验。在无菌室取心、肝、脑、脾、肾、肺、肠、肌肉、表皮组织保存于Sample Protector for RNA/DNA (Takara，大连)并放置于−80℃备用。

2.2. RNA的提取和cDNA的合成

使用RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒(Aidlab，北京)提取黄沙鳖总RNA，以超微量分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，检验总RNA是否符合反转录条件。使用反转录试剂盒Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara，大连)，将总RNA反转录为cDNA，随后放置于−80℃超低温冰箱冷冻保存备用。

2.3. 黄沙鳖β-防御素基因序列的获取和验证

委托上海元莘生物有限公司进行黄沙鳖转录组测序，获得完整的转录组数据。以已发表的中华鳖β-防御素 [21] 以及NCBI上已公布的相近物种β-防御素基因序列为参考，从黄沙鳖全长转录组数据基因注释文件中筛选β-防御素基因，在在线预测软件NCBI ORF Finder查看预测的基因是否包含整个完整蛋白编码(CDS)区，并获得对应的蛋白序列。

基于从黄沙鳖转录组中筛选出β-防御素基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物(表1)，以黄沙鳖9个组织混合cDNA为模板，进行PCR扩增验证。将扩增产物连接至pMD18-T (Takara，大连)载体，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，对阳性克隆子进行测序。

Table 1. Primer sequences of PCR reaction

表1. PCR反应引物序列

2.4. 黄沙鳖β-防御素基因序列的生物信息学分析

使用ProtParam服务器(https://web.expasy.org/protparam/)在线预测Hs-BDs分子量和等电点(pI)，等性质，使用生物分析软件DNAMAN对Hs-BDs基因进行氨基酸序列比对，利用DNA Star软件中的Megalign比较β-防御素基因的相似性。在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库下载其他物种β-防御素序列。采用DNAStar软件进行蛋白分析并使用Clustal X和MEGA5.0软件构建系统发育树。

前体蛋白二级结构使用PSIPRED服务器(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测，Hs-BDs成熟蛋白三维结构由Robetta服务器(http://robetta.bakerlab.org)预测并使用PyMOL软件对该服务器预测的三维分子模型进行显示，标记α螺旋，β折叠和特殊的二硫键。

3. 实验结果与分析

3.1. 黄沙鳖β-防御素(Hs-BDs)基因家族的鉴定

在黄沙鳖转录组中数据基因注释文件中筛选25个疑似β-防御素基因序列，依次命名为Hs-BD1~Hs-BD25。经PCR验证后，获得18个具有完整蛋白编码区的黄沙鳖β-防御素Hs-BDs，即Hs-BD1 (已发表 [14] )、Hs-BD2 (NCBI登录号：MW981708)、Hs-BD3~Hs-BD10、Hs-BD13~Hs-BD15、Hs-BD17~Hs-BD19、Hs-BD23和Hs-BD25。Hs-BDsORF框长度在177 bp~219 bp之间，其中Hs-BD15的ORF框编码氨基酸数量最少，仅有59个；Hs-BD19的ORF框编码氨基酸数量最多，高达73个。

3.2. Hs-BDs家族成员理化性质

Hs-BDs家族成员分子量和等电点等理化性质预测结果如表2所示。结果显示Hs-BDs编码蛋白平均氨基酸残基数量为66；分子质量在6759.13~10,731.32 Da之间，分子质量平均值为7698.22 Da，等电点在8.82~10.45之间；且Hs-BDs氨基酸净电荷量均为正数。亲水性平均系数除Hs-BD1、Hs-BD6、Hs-BD19为负值外，其余家族成员的亲水性平均系数均为正值，即Hs-BD1、Hs-BD6、Hs-BD19为亲水性蛋白，其余Hs-BDs家族成员编码蛋白均为疏水性蛋白。

Table 2. Physicochemical properties of Hs-BDs preprotein

表2. Hs-BDs前体蛋白理化性质

3.3. Hs-BDs氨基酸序列比对结果

将18个黄沙鳖β-防御素基因序列与其他龟鳖目β-防御素(表3)进行序列比对，结果如图1所示。可见这些龟鳖目β-防御素前体蛋白均包含较为保守的信号肽、以及相似度较低的前肽和成熟肽部分。虽然这18个基因编码蛋白的氨基酸种类和数量各不相同，但是它们均具有由6个半胱氨酸残基组成的固定结构(C-X6-C-X3~4-C-X6~8-C-X4-6-CC-X0~10)，该结构符合β-防御素典型特征，表明所获得的18个基因属于β-防御素基因家族。

Table 3. Relevant information of β-defensin gene of turtlesin sequence alignment

表3. 序列比对中龟鳖类β-防御素基因的相关信息

Figure 1. Amino acid sequence alignment between Hs-BDs and β -defensin in other turtles

图1. Hs-BDs与其他龟鳖类β-防御素氨基酸序列比对

3.4. Hs-BDs同源性比较和系统发育树

同源性比较结果，Hs-BDs家族不同成员的推导氨基酸序列相互之间的同源性差异较大，介于11.9% (如Hs-BD15与Hs-BD25)至97.0% (如Hs-BD2与Hs-BD17)之间，推测同源性差异大的Hs-BDs成员可能在某些功能方面会有较大差异；Hs-BD19与中华鳖beta-defensin 8-like (XP_006127561.1)的同源性高达97.9%，推测这2基因的编码蛋白功能和生物活性可能会有较高的相似性。

通过MEGA5对龟鳖目β-防御素家族成员的系统进化关系进行比较，并构建系统进化树，结果如图2所示，可见这些龟鳖目β-防御素家族成员可分成2大分支、4个亚类(Class I~IV)，相同亚类的β-防御素成员之间具有较高的相似性。在亚类I中，Hs-BD15与中华鳖(XP 025038922)和角鳖β-防御素(CCA62932.11-60)亲缘关系较近，与中华鳖Gallinacin-3-like (XP 025038922.120-77)同源性高达99%。在亚类II中，Hs-BD18、Hs-BD19与中华鳖(XP_006127561)和拟鳄龟(KAG6934142)的β-防御素亲缘关系较近，Hs-BD19与中华鳖β-防御素8 (XP 006127561、XP 006127561.11-62、XP 006127561.11-62)同源性均为81%。在亚类III中，Hs-BD1、Hs-BD2、Hs-BD13和Hs-BD17与中华鳖β-防御素9 (XP 025042692.1、XP 025042692.11-64、XP 025042692.11-64)亲缘关系较近。在亚类IV中，Hs-BD3、Hs-BD5、Hs-BD4、Hs-BD6和三趾箱龟(XP_026517292.11-67)聚为一分支，Hs-BD3~Hs-BD10、Hs-BD25和拟鳄龟(KAG6934147.11-64)聚为另一分支。

3.5. 部分Hs-BDs前体蛋白二级结构预测结果

参考系统进化树的分析结果，从4个亚类中随机挑选6个家族成员Hs-BD2 (Class III)、Hs-BD5 (Class IV)、Hs-BD7 (Class IV)、Hs-BD15 (Class I)、Hs-BD18 (Class II)、Hs-BD19 (Class II)进行二级结构预测(图3)。可见，Hs-BD2、Hs-BD5、Hs-BD7、Hs-BD15、Hs-BD18、Hs-BD19前体蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-折叠片和无规则卷曲3种结果组成，其中，α-螺旋结构占比分别为31.82%、29.23%、22.78%、27.12%、35.62%、17.02%；β-折叠片结构占比分别为10.61%、20.00%、8.86%、18.64%、12.33%、9.57%。Hs-BDs前体蛋白的α-螺旋结构主要分布于多肽链的氨基端(N端)，而β-折叠片结构多分布于羧基端(C端)。

3.6. 部分Hs-BDs成熟蛋白三级结构预测结果

部分Hs-BDs成熟蛋白三级结构预测结果如图4所示。Hs-BD7和Hs-BD19成熟蛋白只含有β-折叠片和无规则卷曲2种结构，Hs-BD2、Hs-BD5、Hs-BD15和Hs-BD18的成熟蛋白则具有α-螺旋、β-折叠片和无规则卷曲结构3种结构。除Hs-BD7成熟肽区三级结构不含α-螺旋结构、与二级结构预测结果稍有不同之外，其余5个基因家族成员的二级和三级结构预测结果相符。6个被测的Hs-BDs成熟蛋白均具有反向平行的β-折叠片结构，6个保守的半胱氨酸残基均以Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6的方式连接形成3个分子内二硫键，进一步证明Hs-BDs属于β-防御素家族。

Figure 2. Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Hs-BDs

图2. 基于Hs-BDs氨基酸序列构建系统发育树

Figure 3. Prediction of secondary structure of some Hs-BDs preprotein

图3. 部分Hs-BDs前体蛋白二级结构预测

注：红色标记α-螺旋结构，黄色标记β-折叠片结构，绿色标记无规则卷曲结构，天蓝色标记二硫键结构。

Figure 4. Tertiary structure prediction of some Hs-BDs mature proteins

图4. 部分Hs-BDs成熟蛋白三级结构预测

4. 讨论

已有文献表明，β-防御素是研究最深入、广泛的一类防御素 [22]，不同生物的β-防御素编码氨基酸的数量各不相同，如人的β-防御素编码氨基酸数量为36~65个、中华鳖36~94个、马鹿64个、绵羊35~50个、小鼠38~42个 [23]、鱼类39~45个，它们的共同特点是具有6个高度保守的半胱氨酸残基 [24]。本文经PCR验证后，获得18个黄沙鳖β-防御素基因，其编码氨基酸的数目在59~73个之间，相对分子质量平均值为7698.22 Da，等电点平均值为9.5，净电荷量平均值为7.1，经过序列比对分析后确定这些Hs-BDs均具有由高度保守的半胱氨酸残基组成的结构(C-X6-C-X3~4-C-X6~8-C-X4-6-CC-X0~10)，与前人的研究结果相似。已报道的黄沙鳖β-防御素Hs-BD1 [14] 为亲水性蛋白，本研究中不仅发现了另外几种β-防御素亲水性蛋白，还发现了一些β-防御素疏水性蛋白，如Hs-BD2、Hs-BD7和Hs-BD23等均为疏水性蛋白；Hs-BD1的成熟肽由41个氨基酸组成，本研究中黄沙鳖Hs-BDs成熟肽氨基酸最少有35个(Hs-BD14)，最多有44个(Hs-BD7)。可以预测本研究中新获得的Hs-BDs可能在某些蛋白活性方面与Hs-BD1不同，需要更进一步后续验证。

通过分析不同龟鳖目β-防御素氨基酸序列的相似性和进化关系，可以看出相同亚类的Hs-BDs其相互之间相似性较高，来自不同亚类的Hs-BDs其相互之间的相似性较低，如同为亚类III的Hs-BD2与Hs-BD17其氨基酸序列的同源性达97.0%，但来自亚类I的Hs-BD15与亚类IV的Hs-BD25其氨基酸序列的同源性仅为11.9%。推测不同的β-防御素成员在生理作用上可能具有一定的差异性。

Hs-BDs家族成员基本理化性质预测结果显示，Hs-BDs都是含有正电荷的阳离子短肽，有研究表明，β-防御素多肽净正电荷量越高，其抗菌活性越强，对盐离子的耐受能力亦越强，在一定范围内成正比。带正电荷的β-防御素分子或其多聚体可与细菌质膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用，显著地增加生物膜的通透性 [25]，可以起到破坏细胞膜的化学作用，这也是β-防御素具有抑菌活性的一个重要原理，推测本文获得的Hs-BDs均具一定的抑菌活性。

蛋白二级结构预测结果表明被测的Hs-BDs家族成员均具有β-防御素的典型二级结构，即包括α-螺旋，β-折叠片和无规则卷曲。α-螺旋和β-折叠片结构具有一定的刚性，一起构成β-防御素整体构象的基本骨架，对于一些蛋白质的整体构象起着支撑作用 [26]，Hs-BD2、Hs-BD5、Hs-BD7和Hs-BD18前体蛋白的螺旋–无规则卷曲–螺旋结构特点对保持抗菌活性具有特殊的重要性 [2]。β-折叠片结构自身相互集聚，构成稳定结构，能保证多肽生物活性的稳定 [27]，本文三级结构预测结果显示，6个被测的Hs-BDs成熟蛋白均具有反向平行的β-折叠片结构，这对维持β-防御素结构的稳定性起重要作用。综上，Hs-BDs多肽的空间结构的构成具有一定稳定性，在保证自身结构稳定的同时，也可以保证β-防御素多肽发挥稳定的蛋白活性，在生产上具有较高的应用潜力。

5. 结论

本文基于黄沙鳖转录组数据库和PCR验证，共鉴定到18个具有完整蛋白编码区的Hs-BDs家族成员，分属于4个亚类，其理化性质、序列结构和蛋白结构各有异同。以本文提供的相关信息为基础，后续通过转基因过表达或基因沉默等手段可以进一步探究这些基因在黄沙鳖抗病原以及参与机体的激素调节、免疫调节、降低炎症反应等过程中的作用机理，亦可为黄沙鳖β-防御素作为抗生素替代物的研发提供基础数据。

基金项目

广西自然科学基金项目(2018GXNSFAA138167)、广西农业农村厅水产养殖病害测报项目(桂财预函[2019] 105号)。

文章引用

杨廷雅,魏 华,蒙兰丽,吴志刚,谭雯予,杨祖鹏,唐潇毅,廖 幸,莫昱铭,梁静真. 黄沙鳖β-防御素基因家族的鉴定及生物信息学分析
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    28. NOTES

    *通讯作者。

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