南京师范大学泰州学院化学与生物工程学院，江苏 泰州

收稿日期：2024年3月4日；录用日期：2024年4月5日；发布日期：2024年4月16日

摘要

目的：运用网络药理学的方法探索甘露饮药方治疗复发性口腔溃疡(Recurrent Oral Ulcer, ROU)的活性成分及作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、BATMAN-TCM获取甘露饮药方单味中药有效成分及相关靶点，利用PubChem、NovoPro等数据库进行活性成分靶点预测并用UniProt数据库矫正靶点，利用人类基因数据库GeneCards筛选复发性口腔溃疡的疾病靶点，采用Venny 2.1工具将药物靶点和疾病靶点做交集，通过STRING数据库和Cytoscape 3.10.0软件绘制中药–成分–靶点网络以及蛋白相互作用(PPI)网络，使用Metascape数据库进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。结果：共筛选出166个活性成分，与疾病交集靶点278个。主要活性成分包括光甘草定、苏荠黄酮、黄芩新素、黄芩黄酮、去甲汉黄芩素、槲皮素、异鼠李素、山奈酚等；PPI靶点预测出的核心靶点共10个，包括STAT3，SRC，PIK3CA，PIK3R1，PIK3CD，AKT1，EGFR，HSP90AA1，ESR1，PTPN11；KEGG富集分析显示，与甘露饮治疗复发性口腔溃疡有关的通路包括化学致癌–受体激活通路、癌症中的蛋白聚糖、催乳素信号通路、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导、脂肪细胞因子信号通路等。结论：初步验证了甘露饮治疗复发性口腔溃疡药效基础，可为复发性口腔溃疡治疗提供理论基础。

关键词

复发性口腔溃疡，网络药理学，甘露饮，活性成分，作用机制

Exploring the Mechanism of Action of Ganluyin Prescription for Recurrent Oral Ulcers Based on Network Pharmacology

Chuqi Lin^*, Wenhan Zhang, Xian Peng, Yang Yan, Lin Zhou, Xue Zhou^#

School of Chemistry and Biological Engineering, Nanjing Normal University Taizhou College, Taizhou Jiangsu

Received: Mar. 4^th, 2024; accepted: Apr. 5^th, 2024; published: Apr. 16^th, 2024

ABSTRACT

Objective: To explore the active ingredients and mechanism of action of Ganluyin prescription in the treatment of recurrent oral ulcer (ROU) by using the method of network pharmacology. Methods: we obtained the active ingredients and related targets of the single Chinese herbal medicine of Ganluyin prescription through TCMSP and BATMAN-TCM databases, and predicted the active ingredient targets using PubChem database, NovoProdatabas and target correction using UniProt database. The human gene database GeneCards was used to screen the disease targets of recurrent oral ulcer. Venny 2.1 tool was used to intersect the drug targets and disease targets, and the STRING database and Cytoscape 3.10.0 software were used to draw the traditional Chinese medicine-ingredient-target network and the protein-protein interaction (PPI) network. The Metascape database was used to analyze the enrichment of the GO and KEGG pathways. Results: A total of 166 active ingredients were screened, 278 targets intersecting with diseases. The main active ingredients were glabridin, moslosooflavone, neobaicalein, panicolin, norwogonin, quercetin, isorhamnetin, and kaempferol, etc. A total of 10 core targets were predicted for PPI targets, including STAT3, SRC, PIK3CA, PIK3R1, PIK3CD, AKT1, EGFR, HSP90AA1, ESR1, PTPN11. The KEGG enrichment analysis showed that the related to Ganluyin prescription for the treatment of recurrent oral ulcer pathways including chemical carcinogenesis - receptor activation, proteoglycans in cancer, prolactin signaling pathway, epithelial cell signaling in helicobacter pylori infection, adipocytokine signaling pathway, etc. Conclusion: The preliminary validation of the pharmacodynamic basis of Ganluyin prescription for the treatment of recurrent oral ulcer can provide a theoretical basis for the treatment of recurrent oral ulcers.

Keywords:Recurrent Oral Ulcer, Network Pharmacology, Ganluyin Prescription, Active Ingredients, Mechanism of Action

Copyright © 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

复发性口腔溃疡(Recurrent Oral Ulcer, ROU)又称“复发性阿弗他溃疡”，ROU主要表现为口腔内部呈圆形、椭圆形的溃疡，好发于唇部、舌、颊黏膜等部位。目前ROU病因尚不明确，多数学者认为其主要与缺少维生素、免疫因子及心理应激等因素相关 [1] [2] 。ROU通常采用西药进行消炎、止痛及促进溃疡部位愈合，但效果并不显著，而中药制剂甘露饮对ROU有较好的治疗作用 [3] [4] 。

甘露饮出自《太平惠民和剂局方·卷六》，其中多种成分相辅相成、协同作用是其药理作用的重要基础，各种潜在活性成分的含量与临床治疗效果密切相关 [5] 。《普济方》卷二九九引《如宜方》记载甘露饮附方组成有：枇杷叶、石斛、甘草(炙)、生地黄、黄芩、麦门冬(去心)。其主治口舌生疮，牙宣心热。有研究发现，在ROU中，表皮生长因子受体(EGFR)蛋白及基因的改变使黏膜上皮的增殖和分化受到抑制，可能与口腔溃疡的发生有密切关系 [6] 。还有文献记载，ROU其发病风险和多种基因的多态性相关，涉及白细胞介素家族、炎性体、Toll样受体家族以及免疫球蛋白超家族等基因 [7] 。

网络药理学将一靶一药模式更新为新的“网络靶向多组分”模式。通过“化合物–靶点和靶点–网络”有助于评价中药的合理性与配伍 [8] 。但因甘露饮附方多成分，多功能，且其治疗复发性口腔溃疡机制及相关药理学研究较少，因此本实验从现代药理及分子生物学等角度探究其作用机制。

2. 材料与方法

2.1. 甘露饮中活性成分筛选及靶点预测

通过中药系统药理学技术平台TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)收集甘露饮药方中甘草(炙)、黄芩、枇杷叶的化学成分，基于化学成分药物代谢性质参数(ADME)，将口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18作为标准对化合物进行筛选，在BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/#/home)收集麦冬、石斛、生地黄的化学成分，并以Score cutoff > 20、P < 0.05为筛选条件 [9] [10] 。综合前两个数据库筛选的有效活性成分，使用Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/)以GL absorption为“high”，并且Druglikeness栏目中有两项及以上“yes”为筛选条件预测首选活性成分，再在Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)中设置属性为“Homo Sapiens”并以Probability > 0.1为筛选条件进行活性成分靶点预测，最后用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)矫正靶点 [11] [12] [13] [14] 。

2.2. 甘露饮治疗ROU靶点预测

以“recurrent oral ulcer”为关键词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中检索，并设定物种为“Homo Sapiens”获取关于复发性口腔溃疡疾病全部靶点在获得的ROU全部靶点信息中，对Relevance score进行两次中位数的筛选，最终筛选得到ROU疾病基因 [15] 。使用Venny在线作图工具(Venny 2.1.0) (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将复发性口腔溃疡作用靶点与甘露饮活性成分靶点取交集从而得到甘露饮治疗复发性口腔溃疡潜在靶点 [16] 。

2.3. 构建“中药–成分–靶点”的可视化网络图以及构建蛋白相互作用(PPI)网络并进行拓扑 网络分析

利用所获交集靶点制作Network以及Type文件，并将文件导入Cytoscape 3.10.0软件制作中药–成分–靶点网络图，调节参数，以圆形代表中药，红色六边形代表甘草与枇杷叶的共同靶点预测，其余六边形代表药物活性成分，菱形代表靶点，图中图形越大代表度值(degree)越大，连线越紧密。导出构建好的网络图并进行可视化分析。将筛选得到的甘露饮的治疗复发性口腔溃疡的潜在靶点基因导入STRING Version 12.0数据库(https://string-db.org/)，使用Multiple Protein，设置种属为“Homo Sapiens”以“蛋白互作评分 ≥ 0.9 (最高信任度)”为筛选条件，在Network display options栏目勾选“hide disconnected nodes in the network”，将得到的数据下载TSV格式文件，再利用Cytoscape 3.10.0，依据degree值颜色由深到浅，由大到小排序，进行拓扑网络分析筛选出核心靶点，并绘制PPI网络图 [17] 。

2.4. 基因本体(Gene Ontology, GO)富集与京都基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析

将PPI网络分析得到的核心靶点导入Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html)，设置MinOverlap为3，P-ValueCutoff为0.01，Min Enrichment为1.5进基因本体(GO)和京都基因与基因百科全书(KEGG)通路富集分析；将得到的数据进行处理，再利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)工具进行富集气泡图的绘制 [18] 。

3. 结果

3.1. 甘露饮药方活性成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库总共筛选出146个活性成分，其中甘草92个，黄芩36个，枇杷叶18个，共同活性成分2个；通过BATMAN-TCM数据库总共筛选出26个活性成分，其中麦冬18个，石斛5个，生地黄3个。综合两个数据库，共得到甘露饮药方活性成分166个，见表1。

表1. 甘露饮药方各味药活性成分基本信息

注：此表只列举了甘露饮药方各味药的部分活性成分

利用Pubchem数据库、SwissADME数据库、SwissTargetPrediction数据库得到6味药物靶点，包括，甘草4599个靶点、黄芩1760个靶点、枇杷叶457个靶点、麦冬305个靶点、石斛47个靶点、生地黄216个靶点，去除重复值后得到1094个靶点。

3.2. 复发性口腔溃疡疾病靶点的获取以及甘露饮治疗复发性口腔溃疡的靶点预测

通过GeneCards数据库筛选得到1343个复发性口腔溃疡基因靶点；使用Venny 2.1.0构建Venn图(见图1)，共得到药物与疾病交集靶点278个，见表2。

图1. 疾病与药物交集靶点Venn图

表2. 166个活性成分的278个潜在靶点

注：此表只列出了部分潜在靶点

3.3. “中药–成分–靶点”网络构建以及PPI网络分析

利用Cytoscape 3.10.0软件制作“中药–成分–靶点”网络，分析结果显示，总共405个节点，2889条边；节点大小与度值(degree)相关，依照degree值各单位药从大小排名为甘草、黄芩、麦冬、石斛、生地黄、枇杷叶，见图2。在所有化合物中，依据degree值排名前10的为GC42、GCC40、HQ20、HQ23、HQ21、HQ19、HQ3、A1、A2、A3，见表3。在所有靶点中排名前11位的为雌激素受体β (ESR2)、雌激素受体α (ESR1)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2 (ABCG2)、乙酰胆碱酯酶(ACHE)、表皮生长因子受体(EGFR)、三磷酸腺苷结合盒转运体(ABCB1)、碳酸酐酶2 (CA2)、细胞色素P450家族成员1B1 (CYP1B1)、FMS样络氨酸激酶3 (FLT3)、基质金属蛋白酶2 (MMP2)、间质上皮转化因子(MET)。预测这些关键化合物和靶点在甘露饮对复发性口腔溃疡的治疗调控网络中起着至关重要的作用。

图2. 中药–成分–靶点网络图

表3. 甘露饮药方中主要有效化合物基本信息

图3. PPI网络图

利用STRING Version 12.0数据库和Cytoscape 3.10.0软件，构建PPI网络图筛选出核心靶点，得到排名前10位的靶点分别为信号转导与转录激活因子3 (STAT3)、非受体酪氨酸激酶(SRC)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α (PIK3CA)、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1 (PIK3R1)、酰肌醇-3-激酶催化亚基(PIK3CD)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (AKT1)、表皮生长因子受体(EGFR)、热休克蛋白90AA1 (HSP90AA1)、雌激素受体1 (ESR1)非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶11 (PTPN11)，见表4。预测这些靶点在甘露饮治疗复发性口腔溃疡中可能具有重要作用，见图3。

表4. 甘露饮治疗ROU潜在靶点信息

3.4. 关键靶点GO富集分析和KEGG通路分析结果

利用微生信进行富集气泡图的绘制得到GO生物学过程BP (biological process)，结果参与的生物过程包括激素反应、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、防御反应调节、细胞迁移正调控、细胞因子产生的正向调节、蛋白激酶B信号的正向调节、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导、核蛋白的正向调控、miRNA转录的调节、葡萄糖输入的正向调节、肿瘤坏死因子的产生正向调节等。GO分子功能MF (molecular function)，包括激酶结合、一氧化氮合酶调节剂活性、蛋白磷酸酶结合、激酶激活剂活性、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子的结合活性、ATP酶结合、胰岛素受体结合等。GO细胞组分CC (cellular component)，包括细胞质核周区、细胞边缘、磷酯酰肌醇-3-激酶复合物等，见图4~6。

图4. GO-BP富集分析

图5. GO-MF富集分析

图6. GO-CC富集分析

KEGG调控通路结果包括化学致癌–受体激活通路、癌症中的蛋白聚糖、催乳素信号通路、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导、脂肪细胞因子信号通路等，见图7。

图7. KEGG富集分析

4. 讨论

目前临床治疗复发性口腔溃疡多采用补充维生素联合干扰素增强免疫力，溃疡严重者辅助激素贴膜外敷控制病情进展 [19] 。甘露饮是治疗复发性口腔溃疡的重要方法之一。《黄帝内经》中写道：脾通于口、脾主口、脾开窍于口、心通于舌。基于上述理论，中医认为口疮主要病位在脾，舌病回归五脏属心病，复发性口腔溃疡属心脾热盛 [20] 。本项目研究的甘露饮治疗复发性口腔溃疡的成分包括甘草、黄芩、枇杷叶、麦冬、石斛、生地黄。通过此次研究，从中药–成分–靶点网络图中可分析出甘露饮治疗复发性口腔溃疡的主要药理成分包括光甘草定、3,22-Dihydroxy-11-oxo-delta(12)-oleanene-27-alpha-methoxy carbonyl-29-oic acid、5,7,4'-Trihydroxy-8-methoxyflavone、苏荠黄酮、黄芩新素、黄芩黄酮、去甲汉黄芩素、槲皮素、异鼠李素、山奈酚。有研究表明，炎症反应各个阶段的许多分子受触发核因子(NF-κB)调节，包括TNF-α。山奈酚是一种四羟基黄铜，它具有抗癌，抗菌，抗氧化，抗炎等作用，其作用机制为山奈酚抑制IKKβ的激活，阻断IKBα的磷酸化，阻止NF-κB进入细胞核，从而降低炎症介质的释放 [21] 。异鼠李糖的消炎作用主要是抑制NF-κB途径。槲皮素通过调节谷胱甘肽(GSH)水平，以谷胱甘肽作为氢的受体，一旦氧自由基在体内产生，超氧化物歧化酶就会迅速捕捉O²⁻，转化为H₂O₂进一步转化为水，使其具有抗氧化作用 [22] 。有研究表明，在讨论槲皮素对大鼠肾缺血/再灌注(I/R)实验中证明了槲皮素治疗的谷胱甘肽水平明显增加，NF-κB等水平降低，具有抗炎方面的作用 [23] 。槲皮素还可影响信号传到通路，通过抑制巨噬细胞中的肿瘤坏死因子α (TNF-α)，从而抑制多种炎症通路 [24] 。由此可见，甘露饮对复发性口腔溃疡具有一定的改善作用。

在PPI网络中度值较高的基因靶点有STAT3，SRC，PIK3CA，PIK3R1，PIK3CD，AKT1，EGFR，HSP90AA1，ESR1，PTPN11。其中STAT3是参与各胚层发育(包括骨骼、牙齿发育)、免疫细胞分化发育、肿瘤等各种病理生理过程，是调节细胞增殖、分化、存活，以及自身免疫和炎症的关键因子 [25] 。有研究表面SRC和EGFR可以直接结合，从而相互磷酸化进而诱导细胞生存和迁移信号通路 [26] 。PIK3R1已被证实与胃肠道肿瘤、肝癌、卵巢癌、乳腺癌等的发生发展关系 [27] 。ESR1突变将将引起雌激素受体(ER)活性的提高和ER表达的上调 [28] 。HSP90AA1结合细菌脂多糖并介导LPS诱导的炎症反应，包括单核细胞分泌TNF。

GO-BP分析主要涉及激素反应、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、防御反应调节、细胞迁移正调控、细胞因子产生的正向调节、蛋白激酶B信号的正向调节、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导、核蛋白的正向调控、miRNA转录的调节、葡萄糖输入的正向调节、肿瘤坏死因子的产生正向调节等；GO-MF分析主要涉及激酶结合、一氧化氮合酶调节剂活性、蛋白磷酸酶结合、激酶激活剂活性、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子的结合活性、ATP酶结合、胰岛素受体结合等；GO-CC分析主要涉及细胞质核周区、细胞边缘、磷酯酰肌醇-3-激酶复合物；KEGG分析主要涉及化学致癌–受体激活通路、癌症中的蛋白聚糖、催乳素信号通路、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导、脂肪细胞因子信号通路等。由此可知，甘露饮治疗复发性口腔溃疡是多种成分作用于靶点，多通路的复杂过程，该研究为甘露饮治疗复发性口腔溃疡提供了依据及参考。

基金项目

江苏省自然科学基金面上项目“CG18262通过转录调控Imd通路与MAPK通路交互参与先天免疫稳态维持的分子机制”(项目编号：BK20211128)；江苏省大学生创新创业训练计划项目“基于网络药理学探索甘露饮药方成分治疗口腔溃疡的作用机制”(项目编号：202313843019Y)。

文章引用

林楚奇,张炆晗,彭 鲜,颜 杨,周 琳,周 学. 基于网络药理学探索甘露饮药方治疗复发性口腔溃疡的作用机制
Exploring the Mechanism of Action of Ganluyin Prescription for Recurrent Oral Ulcers Based on Network Pharmacology[J]. 生物医学, 2024, 14(02): 121-132. https://doi.org/10.12677/hjbm.2024.142014

参考文献