北京林业大学林学院，北京

收稿日期：2024年4月3日；录用日期：2024年4月30日；发布日期：2024年5月7日

摘要

本研究以乌饭树叶片为材料，筛选诱导叶片再生不定芽的植物生长调节剂种类和浓度，建立了乌饭树再生体系。此外，确定了用于筛选转基因材料的抗生素浓度、侵染乌饭树叶片的根癌农杆菌菌液浓度和侵染时间，建立了乌饭树遗传转化体系。结果表明：(1) 乌饭树叶片不定芽再生的最佳培养基配方为：WPM + 0.5 mg/L TDZ + 4 mg/L ZT；(2) 乌饭树叶片预培养5 d，筛选用抗生素潮霉素浓度为5 mg/L，农杆菌抑制剂头孢霉素浓度为350 mg/L，共培养6 d，农杆菌浓度为0.8，侵染时间为60 min时，遗传转化效率最高。上述结果为在乌饭树中进行基因功能验证和分子育种提供了理论基础和技术支撑。

关键词

乌饭树，叶片再生体系，农杆菌，遗传转化

The Establishment of Regeneration and Genetic Transformation System for Vaccinium bracteatum Thunb

Chen Li, Qingnan Wu, Qingqing Wang, Lingyun Zhang, Xuejing Qin^*

The College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing

Received: Apr. 3^rd, 2024; accepted: Apr. 30^th, 2024; published: May 7^th, 2024

ABSTRACT

In this study, leaves of Vaccinium bracteatum Thunb were used as materials to screen the types and concentrations of plant growth regulators inducing adventitious bud regeneration, thus establishing the regeneration system of Vaccinium bracteatum Thunb. Additionally, optimal concentrations of antibiotics for screening transgenic materials, as well as concentrations and duration of Agrobacterium tumefaciens infection on Vaccinium bracteatum Thunb leaves, were determined to establish a genetic transformation system. The results revealed that: (1) the formula of adventitious bud regeneration medium of Vaccinium bracteatum Thunb leaves was 0.5 mg/L TDZ + 4 mg/L ZT; (2) the pre-culture time of Vaccinium bracteatum Thunb leaves was 5 days, the optimal concentration of the antibiotic hygromycin for screening was 5 mg/L, the optimal concentration of the Agrobacterium inhibitor cephalosporin was 350 mg/L, the co-culture time was 6 days, the concentration of Agrobacterium was 0.8, and the infection time was 60 minutes, at which the infection efficiency was the highest. These findings provide a theoretical basis and technical support for gene function verification and molecular breeding in Vaccinium bracteatum Thunb.

Keywords:Vaccinium bracteatum Thunb, Leaf Regeneration System, Agrobacterium, Genetic Transformation

Copyright © 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

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1. 引言

乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb)属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium L.)植物，主要分布于我国台湾、华东、华中和华南的山区，是一种重要的经济林木和生态保护树种 [1] ，乌饭树野生资源丰富，兼具生态、社会和经济效益。有研究表明，乌饭树果实中含较强的抗氧化性物质花色素苷和酚类物质，具备抗癌防癌等功效，保健价值极高 [2] 。目前，由于乌饭树多生长在次生林中，易受到人为活动的破坏，且其花朵较小且花期短暂，果实容易受到昆虫和鸟类的侵害，乌饭树的分布和数量正面临日益减少的威胁 [3] 。

近年来，随着分子生物学和基因组学的飞速发展，遗传转化已成为植物育种领域的重要研究手段 [4] 。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法是最常见的植物遗传转化方法之一，具备高效、低成本的特点 [5] ，可以定向导入和表达外源基因，这不仅有助于突破传统育种的耗时长、效率低的问题，还可以为乌饭树的分子育种和基因功能研究提供技术支持 [6] 。植物遗传转化技术在多种农作物和园艺植物中应用广泛 [7] [8] [9] ，且其他越橘属植物中的遗传转化体系也先后被报道 [10] [11] ，目前，国内外关于乌饭树的研究集中在其生物学特性和营养价值 [12] [13] ，其再生和遗传转化体系建立的报道较少。有研究通过探究不同消毒方式、不同植物生长调节剂浓度对乌饭树叶片愈伤组织的诱导效果的影响，建立了野生乌饭树叶片愈伤组织诱导体系 [14] ；利用乌饭树嫩枝作为外植体，初步建立了乌饭树组织培养体系 [15] ，但乌饭树遗传转化的最适条件尚不清楚。

本研究以乌饭树组培苗叶片为材料，探究不同植物生长调节剂及其浓度对乌饭树叶片诱导不定芽再生的影响，以及农杆菌浓度、侵染时间、筛选抗生素浓度、预培养和共培养时间等因素对根癌农杆菌EHA105介导的乌饭树遗传转化体系的影响，获得转基因的乌饭树植株，为乌饭树的遗传改良提供参考。

2. 材料与方法

2.1. 试验材料

乌饭树组培苗和植物表达载体pCAMBIA1300-GFP为本实验室留存；大肠杆菌菌株Trans1-T1购自北京全式金生物技术股份有限公司；农杆菌菌株EHA105购自上海唯地生物有限公司。

2.2. 试验方法

2.2.1. 乌饭树组培苗的扩繁

在无菌条件下，选取健康无病害的乌饭树茎段脱毒后，剪成1~2 cm带有一个腋芽的短茎段，将形态学下端插入WPM固体培养基中(Ph = 5.5)，每个培养瓶接种3~4根茎段。培养瓶置于16 h光照/8 h黑暗的正常光照条件下进行培养，温度25℃，继代扩繁周期为8周。

2.2.2. 乌饭叶片不定芽再生

选取60 d左右苗龄、长势良好且健壮的乌饭树组培苗，剪取健康嫩绿的叶片，剪去叶尖，垂直于主叶脉剪两刀造伤，叶背朝上平铺在培养基上。将乌饭树叶片接种到含有不同植物生长调节剂的培养基中(表1)，每个处理接种3个培养皿，每个培养皿中放置10个外植体，试验重复3次。培养条件为25℃，黑暗处理7 d后置于光照时间为16 h/8 h，光照强度为350 μmol/m²/s。先初步筛选的植物生长调节剂种类(表1)，再进一步筛选植物生长调节剂浓度(表2)。

表1. 乌饭树叶片再生不定芽培养基

表2. 乌饭树叶片再生不定芽培养基优化

2.2.3. 乌饭树遗传转化体系的建立

① 外植体的抗生素和抑菌剂的敏感性试验

本试验对乌饭树遗传转化中所需的抗生素卡那霉素和潮霉素、以及抑菌剂头孢霉素的浓度进行梯度筛选，确定抗生素的适宜浓度，将乌饭树叶片造伤处理后放置在含有响应抗生素的培养基上(表3)，观察外植体生长情况。每种处理30个外植体，重复3次，15 d更换一次培养基。

表3. 乌饭树叶片对卡那霉素、潮霉素和头孢霉素选择压梯度试验

② 农杆菌活化与制备

吸取根癌农杆菌EHA105菌液在固体YEB板(含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平)上平板化线，28℃培养1~2 d，挑取单菌落加入含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的液体YEB培养基中在摇床中培养(28˚C, 200 r/min)，直至颜色为透亮的果粒橙色即状态最佳。之后倒入50 ml含有50 mg/L卡那霉素和25 mg/L利福平的液体YEB液体中(添加50 mg/L的AS)再放入28℃ 200 r/min的摇床中12 h左右，OD₆₀₀值为1.2~1.8，放入离心机(28℃、5000 r/min、10 min)，将上层液体倒掉，再加入重悬液(20 g/L蔗糖，50 mg/L AS，注意避光保存)稀释，OD₆₀₀值至0.8~1.0，配置好的重悬液放入28℃培养箱黑暗培养1 h。

③ 外植体的预培养

按上述造伤方式，本试验剪取乌饭树叶片放置在最适合不定芽生长的培养基上，在25℃、黑暗条件下培养0、5、10 d，观察并记录转化后60 d外植体生长状态以及不定芽萌发情况。该处理接种叶片30个外植体，实验重复3次。

④ 外植体的侵染和共培养

按2.2.2造伤方式，将乌饭叶片在不定芽再生培养基上黑暗预培养0、5、10 d后，置于OD₆₀₀值为0.8的侵染液中，28℃、120 r/min分别侵染30、60、90 min。吸干菌液后将外植体平铺于共培养培养基上(表4)，25℃，黑暗共培养3、6、12 d (表5)。该处理每次接种叶片30个外植体，实验重复3次。观察并记录转后60 d叶片和腋芽生长状态以及不定芽的再生状态。

表4. 基本培养基

表5. 农杆菌侵染时间和共培养时间筛选试验

⑤ 外植体的脱菌处理和筛选培养

在共培养结束后，对叶片进行脱菌处理，先使用含有500 mg/L头孢霉素的无菌水振荡清洗3次，每次5 min。然后再将叶片转移至无菌水中，振荡清洗3次，每次5 min。吸干水分后将叶片叶背朝上平铺到叶片筛选培养基上，每15 d更换一次筛选培养基，60 d后观察培养生长情况。

⑥ PCR扩增鉴定

农杆菌侵染叶片长出的幼苗作为外植体，每个叶片上取一株幼芽放入液氮中，研磨成粉，使用高效植物基因组DNA提取试剂盒(擎科生物TSINGKE，TSP102-50)，具体步骤按照试剂盒说明书来操作，提取DNA。

设计扩增引物，pCAMBIA1300-F：5'-CCAACCACGTCTTCAAAGCA-3'，pCAMBIA1300-R：5'-CGTTTACGTCGCCGTCCA-3'，扩增条带长度为278，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，进行PCR片段扩增，反应体系(25 μl)为Taq PCR mix 12.5 μl、Froward Primer 1 μl、Reverse Primer 1 μl、DNA 1 μl、ddH₂O 9.5 μl。反应程序设定为：85℃预变性3 min，95℃变形15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃后延伸5 min。反应结束后，用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳进行检测，用紫外凝胶成像仪进行拍照。

⑦ 实验结果与数据分析

叶片再生不定芽诱导效率 = 分化出不定芽的外植体数/接种外植体的总数 × 100%；增值倍数 = 总不定芽数/接种外植体总数 × 100%；抗性出芽率 = 长出抗性芽的叶片个数/侵染叶片总数 × 100%；抗性增值系数 = 抗性芽总数/抗性芽的叶片个数 × 100%；抗性芽GFP阳性率 = 表达GFP的不定芽个数/抗性芽总数 × 100%；叶片存活率 = 存活的叶片数量/接种的叶片外植体数量 × 100%。所有的试验均采用完全随机的方法，重复3次，分别采用Excel Office 2021和SPSS Statistics 27进行数据统计和显著分析，同一列间进行差异分析，不同字母代表两组数据存在p < 0.05的显著差异，定量数据将用平均数 ± 标准差(SD)表示。

3. 结果与分析

3.1. 植物生长调节剂对诱导乌饭树叶片再生不定芽的影响

乌饭树叶片接种到5 mg/L 2ip + 2mg/L ZT培养基时(表6)，叶片褐化，无不定芽产生；当叶片接种到4 mg/L的ZT时，叶片部分褐化，无不定芽产生；在基础培养基中添加1 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA时，乌饭树叶片卷曲，并在造伤部位长出大量愈伤组织，愈伤组织呈淡黄色，生长较缓慢。当培养基中添加了2 mg/L TDZ + 2 mg/L ZT时，乌饭树叶片卷曲，并在造伤部位再生不定芽。上述结果表明，培养基中添加2 mg/L TDZ + 2 mg/L ZT这两种植物生长调节剂时，可以促进乌饭树叶片不定芽的再生(图1)。

在TDZ和ZT这两种植物生长调剂的基础上进行浓度的优化，进一步设计了4种培养基配方(表7)，当TDZ浓度为0.5 mg/L时，随着ZT浓度由2 mg/L到4 mg/L，乌饭树叶片不定芽再生率由74.44%升高到79.99%，ZT浓度为4 mg/L时比2 mg/L产生的不定芽生长更加旺盛(图2)，不定芽的节间距离相对较大，增值系数也由5.21升高到5.41；当添加TDZ的浓度为1 mg/L时，乌饭树叶片的褐化率提高，叶片卷曲，在造伤处长出愈伤组织，愈伤组织呈现淡黄色。上述结果表明，最适合乌饭树叶片再生不定芽最佳配方为WPM + 0.5 mg/L TDZ＋4 mg/L ZT (图2B)。

图1. 不同培养基激素组合诱导乌饭树叶片不定芽

图2. 优化后的不同培养基激素组合诱导乌饭树叶片不定芽

表6. 不同植物生长调节剂诱导乌饭树叶片不定芽的效果

表7. 优化TDZ和ZT组合对乌饭树叶片再生不定芽的效果

3.2. 乌饭树遗传转化体系建立

3.2.1. 抗生素对乌饭树叶片再生的影响

乌饭树叶片对卡那霉素、潮霉素、头孢霉素耐受性进行浓度梯度设置，基础再生培养基为WMP + 0.5 mg/LTDZ + 4 mg/LZT。

卡那霉素的浓度梯度设置为0、5、10、15、20 mg/L，如图3所示，乌饭树叶片放置在含有5 mg/L卡那霉素上时，乌饭树叶片部分保持翠绿，部分叶片长出不定芽，但不定芽长势较弱，培养基中的卡那霉素浓度增加到10 mg/L以上时，叶片开始出现失绿黄化，无不定芽产生，浓度到15 mg/L以上，叶片达到100%褐化率，因此，卡那霉素耐受性浓度应该选择5 mg/L (表8)。

潮霉素的浓度梯度设置为的0、5、10、15、20 mg/L，如图5所示，乌饭树叶片在潮霉素浓度与叶片再生不定芽的诱导率成反比，培养基中的潮霉素浓度由5 mg/L增加到20 mg/L时，乌饭树叶片生长的受抑制程度逐渐增加，存活率从31%下降到0%；当潮霉素的浓度为10 mg/L时，叶片褐化率达到100%，无法再产生不定芽，因此乌饭树叶片对潮霉素的耐受度浓度应选择5 mg/L (表8)。

统计乌饭树叶片对头孢霉素耐受性以及在侵染后复染天数，头孢霉素的浓度梯度设置为0、150、250、350、500 mg/L，结果表明，头孢霉素的浓度为150、250、350 mg/L时叶片均可以产生不定芽，说明乌饭树对头孢霉素不敏感，如表8所示，对侵染后的叶片进行观察，随着头孢霉浓度由150 mg/L逐渐增加到500 mg/L时，叶片出现复染的天数也由9 d增加至50 d，头孢霉素浓度由350 mg/L增至500 mg/L时，叶片存活率由100%下降至80%，因此乌饭树叶片的头孢霉素筛选浓度应为350 mg/L (表9)。

图3. 乌饭树叶片对卡那霉素、潮霉素、头孢霉素选择压梯度实验

表8. 乌饭树叶片对卡那霉素和潮霉素选择压梯度试验

表9. 乌饭树叶片对头孢霉素选择压梯度试验

3.2.2. 乌饭树叶片预培养

有研究表明，对叶片进行预培养可以有效增加植物材料转化效率 [16] 。因此，本研究对乌饭树叶片进行了不同时间的预培养，并对不定芽再生率和遗传转化效率进行了检测，结果表明，预培养0 d的乌饭树叶片，不定芽再生率较低，仅为23.33%，且阳性率仅为33.14%；当预培养时间为5 d时，乌饭树叶片卷曲并长出少量愈伤组织，不定芽再生率达到52.22%，且阳性率到达100%；此外，预培养10 d的乌饭树叶片比预培养5 d的叶片再生不定芽率略低为44.44%，且预培养10 d的叶片阳性率比预培养5 d的低，只有49.04%。因此，乌饭树叶片预培养的最佳时间为5 d (表10)。

表10. 乌饭树叶片预培养试验数据统计

3.2.3. 农杆菌侵染时间对叶片再生存活率的影响

侵染时间对转化效率有重要影响，农杆菌侵染时间过短则不能完全附着在受体组织上，从而降低转化效率，农杆菌侵染时间过长，则会对受体材料造成伤害，严重会导致死亡 [17] 。因此，本研究对乌饭树遗传转化中根癌农杆菌侵染时间进行梯度设置，将根癌农杆菌侵染时间设置为0、30、60、90 min，如表11所示，当共培养时间设置为3 d，侵染时间为30 min时，叶片的存活率为23.85%；侵染时间为60 min时，叶片存活率会小幅度提高至26.73%；当侵染时间延长至90 min时，叶片存活率又下降至22.46%。当共培养时间设置为6 d，侵染时间设置为30 min，叶片的存活率为36.86%；侵染时间为60 min时，叶片存活率达到48.96%，但是随着侵染时间的延长至90 min时，叶片的存活率又下降至28.78%。当共培养时间设置在9 d时，随着侵染时间的增长，叶片的存活率也是先升高再降低，存活率由19.35%升高到20.43%又下降至17.83%，可以得出结论，当共培养时间相同，侵染时间设置为30、60、90 min，叶片的存活率先上升后下降，所以最适合乌饭树侵染时间为60 min。侵染时间为60 min，共培养3 d时，乌饭树叶片的存活率为26.73%；共培养6 d时，叶片存活率上升为48.96%；共培养9 d时，叶片的存活率下降至20.43%，因此乌饭树最佳共培养的时间为6 d，得出结论，乌饭树叶片的最佳侵染时间为60 min，最佳共培养时间为6 d，此时乌饭树叶片依然能够存活，存活率达到48.96%，叶片与培养基接触的位置有少量农杆菌出现，叶片造伤部位已经充分和农杆菌接触。

表11. 侵染时间和共培养时间对乌饭树叶片存活率的影响

3.2.4. 转基因乌饭树叶片的鉴定

将含有表达载体pCAMBIA1300-GFP的根癌农杆菌对乌饭树叶片进行遗传转化试验，乌饭树叶片经过5 d的预培养，60 min的侵染时间，6 d的黑暗共培养，转移至光下培养60 d，乌饭树叶片不定芽长势良好(图4)，幼芽翠绿健康，将伸长处理后的抗性芽提取DNA，筛选出可能转化成功的转基因植株，进行PCR鉴定。结果表明，1~8号株系均出现目标条带，而野生型并未出现条带(图5)，从200个外植体中获得42个潜在的转基因芽，转化率在21%。

图4. 乌饭树经农杆菌侵染后长出抗性芽

图5. 琼脂糖凝胶电泳鉴定GFP阳性植株

4. 讨论

4.1. 植物生长调节剂对乌饭树叶片再生体系的影响

建立乌饭树叶片不定芽再生体系是建立高效遗转化体系的基础。植物生长调节剂在诱导植物再生过程中发挥重要作用 [18] ，细胞分裂素能够有效促进不定芽的产生，在河北杨叶片诱导不定芽再生体系的建立中添加TDZ会促进不定芽再生 [19] ，在元宝枫组织培养中研究发现添加6-BA、TDZ等细胞分裂素会促进不定芽的诱导 [20] ，TDZ是一种高效的植物组织培养细胞分裂素 [21] ，本试验选择ZT、TDZ等细胞分裂素添加到培养基中，初步设计了四种培养基配方(表1)，筛选最适合乌饭树叶片再生的植物生长调节剂种类，初步得出2 mg/L TDZ + 2 mg/L ZT诱导效率最高，在添加TDZ和ZT的基础上进行浓度梯度筛选，优化了设计了4种浓度配方(表2)，从而确定了0.4 mg/L TDZ + 4 mg/L ZT时，乌饭树叶片诱导效率最高且幼芽健壮。有研究表明，TDZ可以抑制植物体内源性细胞分裂素酶的产生，从而提高不定芽诱导的数量，低浓度的TDZ对不定芽的再生有促进作用 [22] 。本研究发现当TDZ浓度由0.5 mg/L增加到2 mg/L时，乌饭树叶片不定芽的再生受到抑制，这一结论与滇杨组织再生 [23] 和河北杨叶片诱导不定芽再生体系的建立中研究结果一致。

4.2. 不同因素对根癌农杆菌介导的乌饭树遗传转化效率的影响

影响根癌农杆菌介导的遗传转化的因素有很多，其中最主要的因素有抗生素的浓度、根癌农杆菌侵染浓度以及时间、植物外植体的预培养时间、根癌农杆菌与植物外植体的共培养时间等 [24] 。

抗生素对阳性植株的筛选和抑制农杆菌生长有重要作用 [25] ，本研究分析和比较了乌饭树叶片对卡那霉素、潮霉素、头孢霉素三种抗生素的敏感性，发现随着这三种抗生素浓度的增加，乌饭树叶片受到抑制，当卡那霉素浓度超过10 mg/L时，叶片出现黄化死亡现象；当潮霉素浓度超过10 mg/L时，叶片逐渐出现失绿死亡现象。合适的抑菌剂种类和浓度可有效抑制共培养后农杆菌过度污染情况，保证转化后的植株正常生长，头孢霉素可以有效的抑制农杆菌过度生长，本试验发现头孢霉素浓度为350 mg/L时可以有效果抑制农杆菌过度生长且对植株正常生长无显著的抑制效果，头孢霉素达到500 mg/L时，虽然可以有效抑制农杆菌生长，但是会对受体材料造成伤害导致死亡，实验结果与不同抗生素对卷叶贝母鳞片叶诱导生长的影响保持一致，随着抗生素浓度的提高，会对受体材料产生伤害 [26] 。

农杆菌浓侵染时间和共培养时间对转化效率有重要影响 [27] [28] 。农杆菌侵染时间过短，农杆菌就不能完全附着在受体组织上，从而无法实现有效转化，侵染时间过长农杆菌会起到毒害作用，对受体材料造成伤害，严重会导致死亡 [29] 。本试验研究发现，当共培养时间相同，侵染时间从30 min增加到90 min时，受体材料的存活率表现出先上升再下降的趋势，因此根癌农杆菌介导的乌饭树遗传转化最佳侵染时间为60 min。为了使农杆菌与外植体充分接触和外源基因的高效插入，农杆菌侵染后进行黑暗共培养，共培养时间过短，会导致插入植物外源基因数量减少，共培养时间过长，会导致残留在外植体上的农杆菌过度生长，从而对植物细胞造成伤害 [30] 。与前人研究结果一致，本试验设置侵染时间相同，共培养时间由6 d增加至到9 d时，附着在叶片上的根癌农杆菌出现过度繁殖现象，外植体存活率降低。

外植体经过预培养，能够促进细胞分裂，外源基因更容易整合到受体中，从而提高遗传转化的效率 [30] 。本研究发现，在黑暗条件下进行预培养，可以增加潮霉素阳性芽的数量，预培养5 d时，叶片卷曲，侵染效果较好，不定芽再生率达到52.22%，预培养0 d的乌饭树叶片易出现褐化死亡现象，当预培养为10 d时，不定芽再生率高于预培养0 d的处理，阳性率只有49.04%。预培养时间过长可能会导致外植体伤口迅速愈合，不利于外源基因的导入，从而降低了遗传转化的效率；另外，预培养时间过长也可能使外植体产生抗性，同样不利于外源基因的导入和整合 [31] 。因此，为了保持高效的遗传转化率，需要适当控制预培养的时间。

5. 结论

本研究以乌饭树叶片为外植体，建立了乌饭树再生体系，乌饭树叶片再生不定芽最佳培养基配方为WPM + 0.5 mg/L TDZ +4 mg/L ZT。建立了根癌农杆菌介导的乌饭树遗传转化体系，最适的转化条件为：选择预培养5 d的乌饭树叶片为材料、根癌农杆菌的浓度为0.8和侵染时间为60 min、黑暗共培养6 d，筛选培养基组合为：WPM + 0.5 mg/L TDZ + 4 mg/L ZT + 5 mg/L Hyg + 350 mg/L Cef。

文章引用

李 晨,吴清楠,汪晴晴,张凌云,覃雪晶. 乌饭树再生及遗传转化体系的建立
The Establishment of Regeneration and Genetic Transformation System for Vaccinium bracteatum Thunb[J]. 农业科学, 2024, 14(05): 523-534. https://doi.org/10.12677/hjas.2024.145066

参考文献