Traditional Chinese Medicine
Vol. 11  No. 02 ( 2022 ), Article ID: 49120 , 12 pages
10.12677/TCM.2022.112027

蒙药蓝盆花HPLC指纹图谱及主要成分的 含量测定研究

文花1,青虎1,刘燕2,拉喜那木吉拉2,白玉霞2*

1库伦旗蒙医医院,内蒙古 通辽

2内蒙古民族大学蒙医药学院,内蒙古 通辽

收稿日期:2022年1月4日;录用日期:2022年2月22日;发布日期:2022年3月3日

摘要

目的:对不同产地蒙药材蓝盆花(含蒙古国)进行质量比较研究,为该药质量标准制定提供科学依据,确保临床疗效及复方制剂用药安全提供依据。方法:采用HPLC进行测定,色谱柱为Welchrom-C18 (4.6 mm × 300, 5 µm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水,梯度洗脱,流速为1 mL/min,检测波长为254 nm,柱温40℃,进样量为10 µl,运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版色谱软件对指纹图谱进行相似度评价。结果:建立了不同产地蓝盆花的HPLC指纹图谱,确定了22个共有峰,指认了9个共有峰,计算了相似度,相似度在0.907~0.996。结论:建立了蒙药蓝盆花药材的HPLC特征指纹图谱,该指纹图谱测定方法精密度、稳定性和重复性良好。

关键词

蒙药蓝盆花,HPLC,指纹图谱,质量控制,獐芽菜苷,异槲皮苷,咖啡酸,绿原酸,木犀草苷,芹菜素,木犀草素,大波斯菊苷,异绿原酸A

HPLC Fingerprint and Determination of Main Components of Mongolian Medicine of the Flos of Scabiosa comosa Fisch

Hua Wen1, Hu Qing1, Yan Liu2, Laxinamujila2, Yuxia Bai2*

1Kulun Banner Mongolian Medicine Hospital, Tongliao Inner Mongolia

2College of Mongolian Medicine, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao Inner Mongolia

Received: Jan. 4th, 2022; accepted: Feb. 22nd, 2022; published: Mar. 3rd, 2022

ABSTRACT

Objective: HPLC method was used to study the fingerprint of Mongolian medicine of the Flos of Scabiosa comosa Fisch in different collection areas, and the content of effective components was determined. The quality of Mongolian medicine blue potted flower was evaluated by the similarity evaluation system of spectral fingerprint. Methods: HPLC was used for determination. The chromatographic column was Welchrom-c18 (4.6 mm × 300, 5 µm), the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid water, gradient elution was adopted, the flow rate was 1 mL/min, the detection wavelength was 254 nm, the column temperature was 40℃, and the injection volume was 10 µΙ. Results: HPLC fingerprints of Mongolian medicine of the Flos of Scabiosa comosa Fisch from different habitats were established, 22 common peaks and 9 common peaks were identified, and the similarity was calculated, ranging from 0.907~0.996. Conclusion: The HPLC fingerprint of Mongolian medicine of the Flos of Scabiosa comosa Fisch was further established, and the established method was accurate, stable and reproducible.

Keywords:Mongolian Medicine of the Flos of Scabiosa comosa Fisch, HPLC, Fingerprints, The Quality Control, Swertia Glycoside, Isoquercitrin, Caffeic Acid, Chlorogenic Acid, Galuteolin, Apigenin, Luteolin, Apigenin 7-Glucoside, Isochlorogenic Acid A

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1. 引言

蒙药蓝盆花为川续断科植物窄叶蓝盆花Scabiosa comosa Fisch.ex Roem. et Schult和华北蓝盆花Scabiosa tschilliensis Grunning的干燥花序。夏季花欲开放时,分批采摘,阴干 [1]。蒙药名套森–套日莫 [2],异名为乌赫日音–叔鲁苏–乌布斯 [3],被《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)收载。具有甘、涩、燥、钝、重、腻,凉等性味;清热、清“协日”之功能;用于肺热、肝热、咽喉热等 [4]。主产于内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、河北等省区 [5]。用于肝火头痛、发烧、肺热咳嗽、黄疸等病 [6]。该蒙药主要含有黄酮类、三萜类等化学成分;具有解热、抗炎、镇痛、抗氧化、降血压、抑制血小板聚集、保护肾缺血再灌注损伤、提高机体免疫功能、抑制α-葡萄糖苷酶活性等作用 [7]。

2. 仪器与试药

2.1. 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津),色谱柱为Welchrom C18 (4.6 mm × 300, 5 µm),SQP型10万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司),KQ5200DB型超声波清洗器(江苏省昆山市淀山湖镇)。

2.2. 试剂

色谱乙腈(Fisher Scientific公司);色谱甲醇(Fisher Scientific公司);甲醇(分析纯);乙醇(分析纯);磷酸(分析纯)。

2.3. 药材

24批蒙药蓝盆花样品信息见表1,经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为川续断科植物窄叶蓝盆花Scabiosa comosa Fisch. ex Roem. et Schult和华北蓝盆花Scabiosa tschilliensis Grunning的干燥花序,绿原酸对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:17306-46-6)獐芽菜苷对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:14215-86-2),咖啡酸对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:21967-41-9),异槲皮苷对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:635-65-4),芹菜素对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:520-36-5),木犀草素对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:491-70-3),大波斯菊苷对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:578-74-5),木犀草苷对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:5373-11-5),异绿原酸A对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:89919-62-0),所有对照品质量分数均大于98%。

Table 1. Information of the Flos of Scabiosa comosa Fisch

表1. 样品采集信息

3. 方法与结果

3.1. 色谱条件

色谱柱:Welchrom-C18 (4.6 mm × 300, 5 µm);流动相:乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)梯度洗脱,0~25 min,5%~8% B;25~50 min,8%~15% B;50~75 min,15%~19% B;75~100 min,19%~24% B;100~110 min,24%~7% B;110~115 min,7%~4% B;115~120 min,4% B;流速为1.0 mL/min,柱温40℃,进样量10 μL,检测波长254 nm。

3.2. 溶液配制

3.2.1. 对照品溶液

精密称取绿原酸,咖啡酸,獐芽菜苷对照品适量置同一个5 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度,得到混合对照品溶液,称取异槲皮苷,木犀草苷,异绿原酸A对照品适量,置同一个5 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度,得到混合对照品溶液,称取大波斯菊苷,木犀草素,芹菜素对照品适量置同一个5 m容量瓶中加甲醇定容至刻度,得到混合对照品溶液。

3.2.2. 供试品溶液

精密称取蒙古山萝卜花药材粉末1 g置于50 mL具塞锥形瓶中,加20 mL甲醇溶解,加热回流提取60 min,放冷,过滤即得到供试品溶液。

3.3. 方法学考察

3.3.1. 精密度试验

取蓝盆花药材(Lph7),按“2.2.2”项目下方法配制供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱峰。各共有峰相对保留时间RSD在0.92%~1.22%,相对峰面积RSD在0.35%~2.54%。将同一供试品溶液连续进样6次得到色谱图进行相似度分析,结果显示,相似度大于0.98表示仪器精密度良好,符合指纹图谱的技术要求。

3.3.2. 稳定性试验

取蓝盆花药材(Lph7),按“2.2.2”项目下方法配制供试品溶液,分别在2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样,记录色谱峰。各共有峰相对保留时间RSD在0.70%~1.16%,相对峰面积RSD在 0.45%~1.95%。将得到的色谱图导入分析软件进行相似度分析,结果显示其相似度大于0.98,表示供试品溶液在24 h内稳定性良好,符合指纹图谱的技术要求。

3.3.3. 重复性试验

取蓝盆花药材(Lph7),按“2.2.2”项目下方法配制供试品溶液6份,按“2.1”项目下色谱条件进样,记录色谱峰。各共有峰相对保留时间RSD在0.65%~1.15%,相对峰面积RSD 0.41%~2.36%。将得到的色谱图导入分析软件进行相似度分析,结果显示其相似度大于0.98,表示方法重复性良好,符合指纹图谱的技术要求。

3.4. 结果与分析

3.4.1. 蓝盆花指纹图谱的建立与分析

取24批次蓝盆花药材按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样,记录色谱峰,得到24批次蓝盆花药材的高相液相色谱图。取混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样,得到混合对照品高相液相色谱图(图1)。将24批次蓝盆花药材的高相液相色谱图导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版设S11为参照图谱,采用中位数法,时间窗为0.5,计算24批药材与对照指纹图谱相似度,得到24批药材在254 nm波长下的指纹图谱(图2)。样品图(图3),确定22个共有峰。

1) 已确认22个共有峰,通过与对照品溶液色谱图的比对,其中确定9个共有峰,分别绿原酸,咖啡酸,獐芽菜苷,异槲皮苷,木犀草苷,异绿原酸A,大波斯菊苷,芹菜素,木犀草素。

2) 对24批次蓝盆花药材的高相液相色谱图进行分析,以11号峰为参照峰,以参照峰的保留时间和峰面积为1.00,分别计算各共有峰的相对保留时间(表2)和相对峰面积(表3)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版对指纹图谱数据进行分析,计算24批次蓝盆花药材与对照指纹图谱之间的相似度(表4),24批蓝盆花药材与对照指纹图谱之间的相似度在0.907~0.996,24批蓝盆花药材总体相似度较高,说明本实验使用的24批蒙古山萝卜花药材质量较为稳定。

Figure 1. HPLC standard chromatographic fingerprint for nine reference substances

图1. 对照品HPLC图谱

Figure 2. HPLC standard chromatographic fingerprint for 24 batches of the Flos of Scabiosa comosa Fisch

图2. 24批次蓝盆花药材叠加的特征指纹图谱

3-绿原酸;4-咖啡酸;6-獐芽菜苷;11-异槲皮苷;12-木犀草苷;14-异绿原酸A;15-大波斯菊苷20-芹菜素;21-木犀草素

Figure 3. HPLC sample chromatographic fingerprint the Flos of Scabiosa comosa Fisch

图3. 样品指纹图谱

Table 2. Relative retention time of common peaks of 24 batches of the Flos of Scabiosa comosa Fisch

表2. 24批蓝盆花药材共有峰的相对保留时间

Table 3. Relative peak area of common peaks of 24 batches of the Flos of Scabiosa comosa Fisch

表3. 24批蓝盆花药材共有峰的相对峰面积

Table 4. Similarity of fingerprints among 24 batches of the Flos of Scabiosa comosa Fisch

表4. 24批蓝盆花药材与对照指纹图谱的相似度

3.5. 含量测定

采用HPLC法建立了不同产地蓝盆花指纹图谱,确定了9个共有峰。由图2可知,24个批次蓝盆花的色谱图较为相似,但是还不足以评价不同产地之间质量差异。因此,进一步建立多成分含量测定方法,对蓝盆花指纹图谱指认的9个共有成分(绿原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、异槲皮苷、木犀草苷、异绿原酸A、大波斯菊苷、芹菜素、木犀草素)进行含量测定。

3.5.1. 方法学考察

精密吸取混合对照品溶液 2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL进样分析。以各对照品进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得出回归方程分别为绿原酸:y = 5978.3x − 30649,r = 0.9999,线性范围为2.576~15.456 μg;咖啡酸:y = 4599.6x − 26538,r = 0.9994,线性范围为0.028~0.164 μg;獐芽菜苷:y = 3358.5x + 36907,r = 0.9991,线性范围为0.171~1.027 μg;异槲皮苷:y = 1509.6x − 16272,r = 0.9992,线性范围为0.106~0.636 μg;木犀草苷:y = 4413.5x + 70685,r = 0.9994,线性范围为0.148~0.888 μg;异绿原酸A:y = 2699.2x + 80149,r = 0.9998线性范围为0.819~4.914 μg;大波斯菊苷:y = 1509.6x − 16272,r = 0.9992,线性范围为0.840~5.040 μg;木犀草素:y = 7148.5x + 26667,r = 0.9998,线性范围为0.226~1.356 μg;芹菜素:y = 1975.2x + 3354.8,r = 0.9997,线性范围为0.086~0.516 μg;精密度、稳定性、重复性试验RSD均小于2%;加样回收率均在 95%~105%之间。

3.5.2. 样品测定

取24批蓝盆花样品,每批3份,按“2.2.2”项下方法制备,按“2.1”项下方法进行色谱分析,测定样品中绿原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、异槲皮苷、木犀草苷、异绿原酸A、大波斯菊苷、芹菜素、木犀草素的含量,结果见表5。结果表明,各批次中的绿原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、异槲皮苷、木犀草苷、异绿原酸A、大波斯菊苷、芹菜素、木犀草素的含量差异较大,可能是因为批次之间的差异造成的。

Table 5. 24 batches of contents of main constituents about the Flos of Scabiosa comosa Fisch (mg·g−1) n = 3

表5. 24批蓝盆花主要成分含量测定结果(mg·g−1) n = 3

4. 讨论

4.1. 提取条件的选择

蒙药材蓝盆花主要成分有黄酮类,萜类及环烯醚萜类等化合物,其具有较高的亲水性,易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。本实验中,比较60%甲醇回流1 h和2 h、80%甲醇回流1 h、乙醇回流1 h、甲醇回流1 h和超声1 h各(20 mL)的提取效果,峰的分离度不理想且峰面积小。通过不同提取方法的比较,确定为提取溶剂为甲醇,提取方式为回流提取60 min [8]。

4.2. 色谱条件的选择

色谱条件流动相的选择,以检测出样品的有效成分、洗脱的色谱峰及分离度为指标,比较了乙腈–磷酸水体系,甲醇–磷酸水体系。结果表明,使用乙腈-0.1%磷酸水体系洗脱条件下色谱峰分离效果较好。检测波波长的选择中,对蓝盆花样品在327 nm、350 nm、254 nm波长下进行测定时,在254 nm时吸收较好,且最终确定254 nm为检测波长。柱温的选择,主要比较了30℃和40℃,在30℃的时不吸收,40℃下有效成分的峰吸收较好且分离度较 [9]。

4.3. 结果分析

24批药材与共有模式对照指纹图谱的相似度均在0.9以上,说明不同产地蓝盆花药材化学组成一致性较好,但同时也应看到各色谱峰的相对峰面积还有一定的差异。因此应用过程中,蓝盆花药材来源和产地均应该固定,这对保证产品质量的稳定具有重要意义,为建立该蒙药材的特征图谱蒙药蓝盆花的质量标准研究提供更全面的依据 [10]。HPLC特征指纹图谱更加全面客观地反映了药材特性的色谱分离图,制定出系统性、特征性和稳定性均较好的药材指纹图谱,为药材的质量评价提供了全面的分析方法 [11] [12]。

基金项目

蒙药标准化研究国际合作科技创新项目(MDKBZH2018014);蒙药资源保护与可持续利用研究创新平台项目(MY20190002)。

文章引用

文 花,青 虎,刘 燕,拉喜那木吉拉,白玉霞. 蒙药蓝盆花HPLC指纹图谱及主要成分的含量测定研究
HPLC Fingerprint and Determination of Main Components of Mongolian Medicine of the Flos of Scabiosa comosa Fisch[J]. 中医学, 2022, 11(02): 155-166. https://doi.org/10.12677/TCM.2022.112027

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