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Asian Case Reports in Veterinary Medicine
Vol. 08  No. 02 ( 2019 ), Article ID: 30331 , 5 pages
10.12677/ACRPVM.2019.82003

Preliminary Report on PCR Diagnosis of Yak Theileria annulata in Taskuergan County, Xinjiang

Caishan Li1, Min Dao2, Saidiram1, Xiangfeng Wang2, Abu Duwupul Amibek2, Nadirxia Gawanxia2, Rey Hanguli Tulson2, Nurbia Tulson2, Ruiqi Song1, Qingyong Guo1, Bayin Chahan1*

1College of Animal Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi Xinjiang

2Tashkurgan Tajik Autonomous County Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Tashkurgan Tajik Autonomous County Xinjiang

Received: May 3rd, 2019; accepted: May 15th, 2019; published: May 22nd, 2019

ABSTRACT

Bovine ring typhus is a rumorous blood protozoosis caused by the erythrocytes and reticuloendothelial system of Bovine larvae (Theileria annulata). The clinical manifestations are severe symptoms such as high fever and anemia. If the diagnosis and treatment are not timely, the mortality rate is extremely high and the economic loss is huge. In this paper, 30 yak blood samples collected from Tashkurgan County were tested by PCR for the detection of Theileria annulata. The results showed that the overall positive rate of PCR was 13.3% (4/30), the positive rate of female yak was 13.0%, and the positive rate of male yak was 14.0%. The variance of the disease was found to be insignificant between the sex of yak (P = 0.935 > 0.05), indicating that the plateau yak in the county is infected with Theileria annulata to varying degrees, which is potentially harmful and should be strengthened.

Keywords:Theileria annulata, PCR, Yak

新疆塔什库尔干县牦牛环形泰勒虫病PCR 诊断初报

李才善1，道敏2，赛迪拉木1，王向峰2，阿布都吾甫尔·亚米别克2，那地尔夏·加完夏2， 热依汉古丽·图尔荪2，努尔比亚·图尔荪2，宋瑞其1，郭庆勇1，巴音查汗1*

1新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐

2塔什库尔干塔吉克自治县畜牧兽医局，新疆 塔什库尔干塔吉克自治县

收稿日期：2019年5月3日；录用日期：2019年5月15日；发布日期：2019年5月22日

摘 要

牛环形泰勒虫病是由牛环形泰勒虫(Theileria annulata)寄生于牛类动物的红细胞和网状内皮系统内所引起的蜱传性血液原虫病。临床表现为高热、贫血等重剧症状，若诊治不及时死亡率极高经济损失巨大。本文采用PCR诊断方法对采集于塔什库尔干县的30份牦牛血样进行牛环形泰勒虫病检测。结果显示，PCR检测总体阳性率为13.3% (4/30)，母牦牛阳性率为13.0%，公牦牛阳性率为14.0%，经方差分析发现该病在牦牛性别之间感染率不显著(P = 0.935 > 0.05)，说明该县高原牦牛在不同程度地感染牛环形泰勒虫病，具有潜在危害，应该加强防范。

关键词 :牛环形泰勒虫，PCR，牦牛

Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

牛环形泰勒虫病是经蜱传播血液原虫病，其主要症状为消瘦，体温升高呈稽留热，全身淋巴肿大，肾脏、肝脏肿大质地变软，胆囊扩充等病理变化 [2] 。新疆的牦牛养殖是早年从西藏地区引入开始，据2008年统计目前牦牛在新疆地区的数量约为9.4万头 [1] 。相比较于普通牛，牦牛对生存环境要求较为严格一般生存在海拔较高的地区，主要以农牧民自养为主，未形成大规模集约化的养殖形式。有关牦牛环形泰勒虫病的研究报道相比之下甚少，如刘道鑫等人对青海省天峻地区牦牛泰勒虫病进行过血清学调查 [2] 和阿力米江·沙克等对新疆部分地区牦牛环形泰勒虫病调查 [3] ，尤其对塔什库尔干的高原牦牛尚未详细地报道过。本文通过对采集于新疆塔什库尔干县的的30份牦牛血样进行血液涂片和PCR方法进行检测、诊断牛环形泰勒虫病，以便为当地牛环形泰勒虫病的综合防治提供参考。

2. 材料与方法

2.1. 样品来源

通过颈部采血法从新疆塔什库尔干县地区采集30份牦牛血液样品，其中23为雌性、7份为雄性牦牛，具体采样信息详见表1。采集的血样收集于EDTA-K2抗凝管，并将采集好的血液样品放置于有冰袋的采样箱内带回实验室待检。

2.2. 主要试剂及仪器设备

试剂：DNA聚合酶、DNA提取试剂盒、DNA Marker等PCR实验所需的相关试剂购自北京鼎国生物公司；仪器：PCR仪、平衡离心机、恒温水浴锅、BIO-RAD凝胶成像分析系统、恒压恒流电泳仪、电泳槽等。

Table 1. The geographic conditions in the research areas

表1. 采样地区地理气候条件

2.3. 试验方法

2.3.1. PCR检测法

将采集好的牦牛全血样品轻微颠倒混匀后抽取200 μL通过DNA提取试剂盒进行血液DNA提取，将提取好的DNA作为模板，应用特异性强的通用引物 [4] ，上有引物：5'-ACT TTG GCC GTA ATG TTA AAC-3'，下游引物：5'-CTC TGG ACC AAC TGT TTG G-3'，目的片段大小为312bp，进行PCR扩增、诊断。其PCR扩增反应体系为13 μL，具体如下：2 × Es Taq Master Mix 6.5 μL上游、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水2.5 μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；95℃变性50 s，56℃退火50 s，65℃延伸50 s，30个循环；65℃终延伸5 min，PCR扩增结束后取5 μL PCR产物经行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定分析。

2.3.2. 血涂片检测

将收集于EDTA-K2抗凝管中的血液样品在实验室制作成血液涂片进甲醇固定后放置到新配制的10%姬姆萨染色液里进行染色，随后使用自来水冲洗，在油镜下观察。

2.3.3. 数据分析

通过Excel软件对库孜更村、萨尔库塔什村感染率为、库仑木勒克村三个采样点的牛环形泰勒虫病感染率进行了比较分析，通过SPSS数据分析软件，对本实验样本进行了差异水平分析。

3. 试验结果

3.1. 高原牦牛环形泰勒虫PCR检测结果

本次实验对30份牦牛全血样提取DNA，以提取的DNA作为模板进行牛环形泰勒PCR检测。环形泰勒虫形泰勒虫条带大小为312 bp，结果(见图1)。

Figure 1. PCR detection for Theileria annulata. M: DNA Marker (DL2000); 1 - 9: Samples

图1. 牛环形泰勒虫PCR检测结果。M：DL-2000 Marker；1~9：本文测定样品

3.2. 高原牦牛不同采样点牛环形泰勒虫感染情况

在样品采集点采集的样本中，牛只感染牛环形泰勒虫的感染率分别为：库孜更村中感染率为11.1%(1/9)，萨尔库塔什村感染率为0% (0/8)，库仑木勒克村感染率为23.1% (3/13)，详情见图2。

Figure 2. Infection rate of Theileria annulata in yaks which from different areas in the research

图2. 不同地区的牦牛牛环形泰勒虫感染率

3.3. 高原地区牦牛不同性别感染情况

本次检测的高原牦牛中，牛环形泰勒虫总体阳性率为13.3% (4/30)，母畜中检出率为13.0% (3/23)，公畜中检出率为14.3% (1/7)，使用SPSS17软件进行分析后发现P = 0.935 > 0.05表明在本次牦牛感染牛环形泰勒虫中，性别与感染率之间不存在差异性。

4. 结论

牛环形泰勒虫病从世界范围内来看是一种常出现在热带和亚热带地区影响畜牧经济的疾病 [5] 。但是塔什库尔干县属于高原高寒干旱–半干旱气候，该地区由于海拔均在3000米以上从而导致气压极低，这种气候是适合牦牛生存的自然环境，但本结果验证了这种高原牦牛仍然感染了牛环形泰勒虫病流行病，这与中国环形泰牛勒虫病一般出现在西北半干旱地区 [6] 很大程度上对西北地区的畜牧业，尤其是牛类养殖方面产生了很大的负面影响，根据大量的文献研究表明该类疾病可以表现出不同且明显的临床症状 [7] 的文献描述基本一致。

常见的诊断方法主要有血清学检测ELISA方法，该方法操作简单，价格不是很昂贵适合大量样品的检测。但是也有文献指出ELISA检测其灵敏度和特异性较低 [8] 。本文选用了血涂片法和PCR检测 [9] ，以更提高了检测、诊断的准确度。结果显示，阳性率为13.3% (4/30)。由于该季节操场遥远、牦牛散养等因素本文只调查了少部分(30头份)牦牛的牛环形泰勒虫病感染情况，为后期工作打基础。这次报道，阿勒泰地区有患有牛环形泰勒虫病的报道 [10] 之后又一个非热带和亚热带地区(塔什库尔干县)的报道，这次季节的原因未采集到媒介蜱，故对于塔什库尔干县牛环形泰勒虫病的传播情况以及流行情况还需要进行进一步的研究。

基金项目

自治区法人科技特派员定点承包技术服务项目(编号：2016D09F011)。

文章引用

李才善,道 敏,赛迪拉木,王向峰,阿布都吾甫尔·亚米别克,那地尔夏·加完夏,热依汉古丽·图尔荪,努尔比亚·图尔荪,宋瑞其,郭庆勇,巴音查汗. 新疆塔什库尔干县牦牛环形泰勒虫病PCR诊断初报
Preliminary Report on PCR Diagnosis of Yak Theileria annulata in Taskuergan County, Xinjiang[J]. 亚洲兽医病例研究, 2019, 08(02): 17-21. https://doi.org/10.12677/ACRPVM.2019.82003

参考文献

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  2. 2. 孔繁瑶. 家畜寄生虫学[M]. 第二版. 北京: 中国农业出版社, 2008: 339-340.

  3. 3. 阿力米江•沙克, 巴音查汗. 阿合奇县色乡牦牛环形泰勒虫病流行病学调查报告[J]. 当代畜牧, 2012(4): 25-27.

  4. 4. Bilgic, H.B., Karagenc, T., Shiels, B., Tait, A., Eren, H. and Weir, W. (2010) Evaluation of Cytochrome b as a Sensitive Target for PCR Based Detection of T. annulata Carrier Animals. Veterinary Parasitology, 174, 341-347. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2010.08.025

  5. 5. Sivakumar, T., Hayashida, K., Sugimoto, C. and Yokoyama, N. (2014) Evolu-tion and Genetic Diversity of Theileria. Infection, Genetics and Evolution, 27, 250-263. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2014.07.013

  6. 6. Guo, H.P., Yin, C.S., Galon, E.M., Du, J.G., Gao, Y., Moumouni, P.F.A., Liu, M.M., Efstratiou, A., Lee, S.-H., Li, J.X., Ringo, A.E., Wang, G.B., Li, Y.C., Tumwebaze, M.A. and Xuan, X.N. (2018) Molecular Survey and Characterization of Theileria annulata and Ehrlichia ruminantium in Cattle from Northwest China. Parasitology Interna-tional.

  7. 7. Xu, Y.T., Zhang, S.F., Li, S.Y. and Jin, M.H. (1997) Progress in Diagnosis and Prevention Research of Bovine Theilerio-sis. Journal of Agricultural Science Yanbian University, 19, 271-275. (In Chinese)

  8. 8. Gubbels, J.M., d’Oliveira, C. and Jongejan, F. (2000) Development of an Indirect Tams1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of T. annulata Infection in Cattle. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 3, 404-411. https://doi.org/10.1128/CDLI.7.3.404-411.2000

  9. 9. Farnaz, M., Mousa, T., Mohammad, Y., et al. (2014) Detection of Theileria equi and Babesia caballi Using Microscopic and Molecular Methods in Horses in Suburb of Urmia, Iran. Veterinary Research Forum, 5, 129-133.

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    11. NOTES

    *通讯作者。

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