Immunology Studies
Vol.03 No.02(2015), Article ID:15531,5 pages
10.12677/IS.2015.32002

The Research Status of Hepatitis B Virus cccDNA

Ning Wang

The Poverty Alleviation and Development Office of Daozhen County, Zunyi Guizhou

Email: 714055748@qq.com

Received: Jun. 4th, 2015; accepted: Jun. 20th, 2015; published: Jun. 26th, 2015

Copyright © 2015 by author and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

ABSTRACT

The hepatitis B virus (HBV) is a kind of small DNA virus. The original template of covalently closed circular DNA (cccDNA) HBV is very important for the replication of the hepatitis B virus and the establishment of infection status. The progress of the formation of cccDNA, the methods of detection and the impact of antiviral drugs were reviewed in this paper.

Keywords:HBV, rcDNA, cccDNA

乙肝病毒cccDNA的研究现状

王 宁

贵州省道真县扶贫开发办公室,贵州 遵义

Email: 714055748@qq.com

收稿日期:2015年6月4日;录用日期:2015年6月20日;发布日期:2015年6月26日

摘 要

乙型肝炎病毒(HBV)是一种小DNA病毒,共价闭合环状DNA (cccDNA)是HBV的原始复制模板,对乙肝病毒的复制及感染状态的建立具有重要意义。本文旨在对近年来有关cccDNA的形成、常用检测方法、抗病毒药物对其的影响等方面的进展作一综述报道。

关键词 :乙型肝炎病毒,松弛环状双链DNA,共价闭合环状DNA

1. 引言

乙型肝炎病毒基因组为双链松弛环状DNA (rcDNA)。HBV感染发生后,HBVDNA进入细胞,rcDNA转化为共价闭合环状DNA (cccDNA),并以cccDNA为模板开始一系列的病毒复制过程。HBV复制是一种保守的机制,在转录后模板cccDNA仍然完整,并且可反复转录,所以cccDNA是嗜肝病毒持续感染的关键因素,是HBV复制的突出标志,也是评价HBV感染状态及药物疗效最重要的指标[1] 。

2. HBV cccDNA的形成与调节

在感染的早期阶段细胞核内cccDNA合成的途径为:HBV进入细胞后,在胞浆内脱壳,DNA的正链在DNA聚合酶作用下形成全长的rcDNA [2] 。rcDNA进入肝细胞核中解脱负链5’端连接的末端蛋白、正链5’端的RNA残段;依赖宿主细胞的DNA聚合酶补齐两条链上的缺口,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA,并以cccDNA为模板转录为不同大小mRNA (3.5 Kb、2.4 Kb、2.1 Kb、0.8 Kb mRNA),从而翻译各种病毒蛋白。其中3.5Kb的mRNA作为逆转录模板,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA,再以负链DNA作为模板,通过病毒DNA聚合酶的作用,合成正链DNA,与负链DNA一起组成新的HBV rcDNA。新合成的HBV rcDNA一方面进入细胞核内,转化为新的cccDNA,补充细胞内的cccDNA库,使每个肝细胞中保持大约5~50个cccDNA分子;另一方面与病毒蛋白装配成新的完整HBV,释放至细胞外,再感染健康的肝细胞[3] 。

另外还有一种次要的HBV cccDNA合成方式。在这种方式里,由于正链DNA在适当区域合成失败而产生线性双链DNA,通过在线性DNA末端的非同源重组而被有效地转换成HBV cccDNA。这种方式产生的一些HBV cccDNA分子能产生前基因组。由于非同源重组产生的变异,多数前基因组仅产生线性双链DNA,这些线性双链DNA重组产生更多HBV cccDNA,这种过程称为非法复制。因为由此产生的下一代HBV cccDNA在非同源重组处的序列上区别于亲代分子,由此推测细胞内低水平病毒的这种“非法复制”可能提供此类细胞在抗原特异性细胞免疫反应中的一种生存优势[4] 。

在稳定感染的细胞中,核内cccDNA维持在一定的水平,以满足病毒复制而对细胞无毒性,这一调节作用可能通过细胞主导的过程或病毒主导的负反馈机制来实现。一个感染病毒体在感染肝细胞后只产生一个cccDNA分子,但处于稳定感染的每个肝细胞内有50~100个cccDNA拷贝,其原因就是rcDNA又在胞内转换成cccDNA。

3. HBV cccDNA的常用检测方法

根据cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同,可以建立检测cccDNA的方法:

cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同:1) rcDNA能与蛋白质共价结合,cccDNA则不能;2) rcDNA的双链是不对称的,全长的一链与病毒mRNA互补,为负链,较短的一链为正链。在正链和负链上均存在缺口,两链DNA通过5’端250~300个互补碱基的氢键作用形成部分环状结构,而非超螺旋结构;cccDNA的两条链均是完整的,形成超螺旋结构;3) 由于正链和负链上均有缺口存在,rcDNA可以被一些能够切除单链或含有缺口DNA的核酸酶如Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnase、绿豆核酸酶(mung bean nuclease)等降解成寡核苷酸或单核苷酸,而cccDNA则由于双链结构完整,不会被上述酶降解[5] -[7] 。

常用检测方法:

3.1. Southern Blot

HBV cccDNA以往多用Southern blot方法进行检测,它的基本过程包括:电泳分离酶解后的DNA片断,将DNA片断转移到合适的固相支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上,将标记的探针与膜上的DNA片断杂交,分析杂交信号。以往多用Southern印记方法进行HBV cccDNA检测,是一种定性的检测方法。该方法是分子生物学的经典方法,但对操作者的技术要求较高,且步骤繁琐,灵敏度较低[8] 。

3.2. 普通PCR

基于rcDNA的正链和负链上均存在缺口,故可以设计跨越两个缺口的引物,使rcDNA不被扩增,cccDNA由于有完整的双链可以被有选择地扩增。汪菁[9] 等对普通PCR法进行了优化,应用套式PCR结合直接测序法测得HBVcccDNA的YMDD位点,证实了肝内cccDNA YMDD自然变异株的存在。

3.3. 实时荧光定量PCR

He等[10] 建立了实时荧光定量检测cccDNA的方法。他们将具有发光基团和淬灭集团的TaqMan探针设计于负链缺口的下游,与负链互补。在上游引物的引导下,若负链是完整的,Taq酶则到达TaqMan探针所结合的位点,利用其5’→3’的外切酶活性将探针切断,从而3’端的淬灭基团失去对5’端发光基团的抑制作用,产生荧光信号。若负链含有缺口,由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口,故不能产生荧光信号。这样,cccDNA和rcDNA得以区分开来。此方法变普通PCR法的终点监测为实时动态检测,不需对PCR反应产物进行开盖检测,从而减少了PCR产物污染的可能。

3.4. 入侵检查(Invader Asssay)

入侵检查是近年来刚开始应用的技术。其基本原理是根据目标DNA设计一对探针,一个探针称为初始探针(primary probe),另一个称为入侵探针(invader probe),初始探针的5’端一段寡核苷酸序列不与目标DNA互补,入侵探针3’末端的单个碱基不与目标DNA互补,Flap核酸内切酶I (Flap endonuciease I)将初始探针5’端不与目标DNA互补的寡核苷酸序列剪切下来,之后此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭集团的FRET (FluorescenceResonance Energy Transfer)探针相结合,从而产生荧光信号,能够被实时荧光PCR仪器检测[11] 。DKHw等[12] 根据此原理,分别设计了与HBV DR2区正链下游、负链上游相结合的两种入侵探针,这样当正链、负链均为完整时产生两种荧光信号,从而检测cccDNA;rcDNA 由于正链含有缺口,只能产生一种荧光信号,得以和cccDNA相区分。整合型HBV DNA在DR2区的5’端也是一段完整的序列,但整合多发生在1lbp的DR区[12] [21] ,Wong DK等[12] 。据此认为用人侵检查技术测到整合型HBVDNA的几率应该很低。

有研究表明血清HBeAg不能准确反映HBV cccDNA水平,而肝组织内的HBV cccDNA又是HBV在肝细胞内感染的复制状态及其传染程度的更精确地反应,当患者出现血清HBeAg阴性时,为了准确表达HBV在肝细胞体内的感染状态,使用HBV cccDNA作为观察指标能够较为直接的反映肝细胞内感染的真是情况[13] 。

由于cccDNA主要存在于肝细胞核中,所以认为用肝组织检测cccDNA结果较为可靠和准确,但用肝穿获取肝组织临床难以普及,相比较而言血中cccDNA的检测较为可行。理论上讲,当肝细胞破坏时,存在于肝细胞核中的cccDNA会释放入血,有研究表明其既可作为肝损伤的评价指标,也可用来评估病毒复制。cccDNA目前多采用实时荧光定量PCR方法检测[14] 。

4. 药物对HBV cccDNA的影响

4.1. 干扰素

干扰素是一种广谱的抗病毒药,其抗病毒机制是与细胞膜特异性受体结合,在细胞内产生一种“抗病毒蛋白”的酶,此外,它还能增强机体的免疫功能。但干扰素的治疗效果是有限的,长期应用才能抑制HBV复制,获得较持久的效应,但长期使用会产生很多不良反应;且其抗病毒作用只限于HBV DNA,并不能清除存在于肝细胞核内HBV的复制模板cccDNA,也不能清除已与宿主DNA整合的病毒基因[3] [15] 。

4.2. 拉米夫定

拉米夫定为核苷类似物,通过抑制病毒DNA聚合酶阻止病毒的复制。使用侵入检测法检测慢性乙型肝炎82例外周血的cccDNA,治疗前平均水平3.0 × 106 copy/ml,经拉米夫定(100 rag/天)治疗24周时,降至3.3 × 104 copy/ml,52周时4.9 × 104 copy/ml。由于其中15例出现YMDD变异,所以52周时外周血cccDNA水平比24周时略有升高。表明其对HBV的抑制作用是可逆的,一旦停用后HBV常重新复制,而且也不能完全清除cccDNA,更不能清除已与细胞基因组整合的病毒。只有长期使用,持续性抑制HBV复制,才可获得较为持久性的效应,但是长期治疗部分病人可发生病毒变异,引起耐药性[2] [3] 。

4.3. 阿德福韦

采用实时定量PCR检测肝组织cccDNA,包括接受阿德福韦治疗的慢性乙型肝炎22例,结果表明,阿德福韦(10 rag/天)治疗48周后,平均每个肝细胞的cccDNA下降0.8个对数级,即减少84%;肝组织内总的HBV DNA下降1.6个对数级,即减少98%。病毒感染的细胞数量在治疗前后无明显变化,提示阿德福韦通过非细胞死亡机制降低cccDNA [2] 。

4.4. 恩替卡韦

对恩替卡韦(0.5 rng/天) III期临床研究入组的部分病例进行了肝细胞内HBVcccDNA水平的检测,初步结果表明,治疗48周后恩替卡韦降低HBVcccDNA的作用强于拉米夫定,而在此前的鸭乙型肝炎模型上已证实,与拉米夫定相比,恩替卡韦对降低鸭肝细胞内DHBV cccDNA的水平更为有效,但也不能完全清除病毒[2] 。

4.5. 替诺福韦酯

该药物是替诺福韦的酯类前药,口服吸收后迅速水解为替诺福韦,其活性代谢产物二磷酸可竞争进入病毒DNA链,导致病毒DNA延长受阻,进而抑制病毒复制。其抗病毒作用强,耐药率低,对耐药株、变异株均有抑制作用。对拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦耐药的患者仍有较好的抗病毒作用。但该药物尚未在我国批准上市[16] 。

4.6. 克拉夫定

克拉夫定的3位羟基,不是一个终止物,而是形成了三磷酸酯L-FMAU-TP结合在活性部位,诱导聚合酶构象发生变化,使病毒DNA链的合成不能顺利进行。临床试验结果显示其安全性、药代动力学性质及耐受性良好,具有良好的耐受性和抗HBV活性[17] 。但在进入临床应用后,在克拉夫定治疗的患者中检测到rtA181T变异,表明克拉夫定可能产生耐药[18] 。

5. 新药物及新方法

5.1. 治疗性DNA疫苗

Thermat等[19] 用包含DHBV大包膜蛋白基因的质粒作为治疗性DNA疫苗,治疗慢性携带DHBV的鸭,发现可以显著减少其病毒的复制。更有意义的是,在一些鸭(7/30)的肝细胞内,cccDNA已被完全清除。提示治疗性DNA疫苗可能是一种清除HBV感染肝细胞内的cccDNA、减少复发的有效方法。其他旨在阻断病毒在细胞内复制、转录、翻译,乃至释放的某一个环节的抗病毒药物,则很难清除肝细胞内的cccDNA。

5.2. 基因治疗

RNA干扰技术是短小的干扰RNA (siRNA)通过序列特异性降解目的mRNA,而起到调节RNA表达的作用。有研究结果表明,siRNA可特异性降解人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)的genomicRNA,从而抑制病毒复制。同时,有研究结果表明,HBV羧基端siRNA能显著降低HBVcccDNA的水平和HBV DNA的复制[20] 。这可能是由于HBV cccDNA的减少引起其转录为HBV RNA水平的降低,最后导致HBVDNA复制水平的下降[2] 。无疑基因治疗为乙肝治疗带来了新的希望。

6. 小结与展望

嗜肝DNA病毒cccDNA分子的形成机制,以及在病毒的生物周期中作为前基因组RNA 和部分基因mRNA的模板的重要意义已经明确,但目前尚无手段有效抑制其合成及彻底清除cccDNA。目前,一方面应积极研制新的抗HBV药物,抑制HBV DNA合成,减少HBV DNA进入细胞形成cccDNA库并清除cccDNA;另一方面应将抗HBV药物与免疫调节剂联合应用,提高细胞免疫功能,阻止HBV感染细胞,促进cccDNA的清除。如能有效地实现上述抗HBV策略,将能大大提高治疗效果,并有可能根治HBV感染。

文章引用

王 宁, (2015) 乙肝病毒cccDNA的研究现状
The Research Status of Hepatitis B Virus cccDNA. 免疫学研究,02,13-18. doi: 10.12677/IS.2015.32002

参考文献 (References)

  1. 1. 马艳丽, 任万华 (2006) 乙肝病毒cccDNA的研究进展. 临床肝胆病杂志, 3, 221-222.

  2. 2. 许海苗, 王慧芬 (2007) 乙肝病毒cccDNA的研究进展. 人民军医, 5, 271-273.

  3. 3. 张涛, 高英堂, 韩涛 (2005) 乙肝病毒cccDNA的研究进展. 国外医学病毒册, 6, 161-164.

  4. 4. 陈勇, 秦波 (2007) 乙型肝炎病毒cccDNA的研究动态. 胃肠病学和肝病学杂志, 4, 303-305.

  5. 5. 赵克开, 缪晓辉 (2005) 乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义. 中华肝脏病杂志, 4, 315-317.

  6. 6. 陆晖, 江建宁 (2008) HBV cccDNA检测的研究进展. 内科, 2, 213-216.

  7. 7. 杨德刚, 缪晓辉 (2007) 对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的再认识. 中华医学杂志, 26, 1867-1869.

  8. 8. Li, X.M., Yang, Y.B., Hou, H.Y., et al. (2003) Interruption of HBV intrauterine transmission: A clinical study. World Journal of Gastroenterology, 9, 1501-1503.

  9. 9. 江菁, 陈玉, 等 (2012) 乙型肝炎病毒共价闭合环装DNA YMDD位点基因序列自然变异的检测分析. 临床论著, 6, 371-374.

  10. 10. He, M.L., Wu, J., Chen, Y., et al. (2002) A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real- time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications, 295, 1102-1107.

  11. 11. Kwiatkowski, R.W., Lyamichev, V., de Arruda, M. and Neri, B. (1999) Clinical, genetic, and pharmacogenetic applications of the invader assay. Molecular Diagnosis, 4, 353-364.

  12. 12. Wong, D.K., Yuen, M.F., Yuan, H., Sum, S.S., Hui, C.K., Hall, J. and Lai, C.L. (2004) Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patients. Hepatology, 40, 727-737.

  13. 13. 黄维亮, 徐丹, 谢元林 (2014) 肝组织HBV cccDNA与HBV复制水平的相关性分析. 医学临床研究, 11, 2108-2110.

  14. 14. 陈浩, 张涛 (2013) 乙型肝炎实验室检查研究进展. 医学信息, 10, 713-714.

  15. 15. Wieland, S.F., Spangenberg, H.C., Thimme, R., Purcell, R.H. and Chisari, F.V. (2004) Expansion and contraction of the hepatitis B virus transcriptional template in infected chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 2129-2134.

  16. 16. 李莉, 孙海霞, 李刚 (2012) 慢性乙型病毒性肝炎抗病毒治疗方案的新探索. 广东医学, 9, 1333-1335.

  17. 17. 徐海苗, 王慧芬 (2006) 核苷类药物治疗慢性乙型肝炎的新进展. 传染病信息, 3, 113-115.

  18. 18. 王洁, 金生 (2014) 乙型肝炎病毒耐药变异及其检测方法研究进展. 现代医药卫生, 24, 3711-3713.

  19. 19. Thermat, A., Rollier, C., Zoulim, F., Trepo, C. and Cova, L. (2003) Progress in DNA vaccine for prophylaxis and therapy of hepatitis B. Vaccine, 21, 659-662.

  20. 20. 唐世刚, 杨兵厂, 刘莉 (2005) 稳定表达HBVC蛋白羧基端SiRNA抑制HBVcccDNA的实验研究. 中华感染控制杂志, 7, 198-201.

  21. 21. Mason, A.L., Xu, L., Guo, L., Kuhns, M. and Perrillo, R.P. (1998) Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology, 27, 1736-1742.

期刊菜单