浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江 杭州

收稿日期：2021年6月5日；录用日期：2021年7月5日；发布日期：2021年7月14日

摘要

建立乙醇/磷酸氢二钾双水相萃取–高效液相色谱法测定水样中萘普生和尼莫地平的分析方法，考察了不同的超声时间、超声功率、KH₂PO₄质量分数和乙醇质量分数对萃取率的影响，通过响应曲面试验设计进一步优化确定最佳萃取条件，结果得到乙醇/磷酸氢二钾双水相体系萃取水样中萘普生和尼莫地平的最佳条件为：在超声功率200 W，离心转速5000 r/min，离心10 min时间下，乙醇质量分数为39%，KH₂PO₄质量分数为18%，超声时间15 min，萘普生的萃取率可达94.73%，尼莫地平的萃取率可达88.57%。该方法简便、快速、准确，能满足萘普生和尼莫地平的萃取要求。

关键词

萘普生，尼莫地平，双水相体系，超声波辅助，萃取，高效液相色谱

Study on Extraction of Naproxen and Nimodipine from Water Sample by Ethanol/Dipotassium Hydrogen Phosphate Dual-Aqueous Phase System

Yating Tao, Guiwei Rao, Yingguo Fang

School of Biology and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou Zhejiang

Received: Jun. 5^th, 2021; accepted: Jul. 5^th, 2021; published: Jul. 14^th, 2021

ABSTRACT

Establishing an ethanol/dipotassium hydrogen phosphate dual-aqueous phase system to extraction—high-efficiency liquid chromatography determines the Naproxen and Nimodipine in water samples’ analytical method. The effects of different ultrasonic times, ultrasonic power, KH2PO4 mass fraction and ethanol mass fraction on the extraction efficiency were investigated. The optimal extraction conditions were further optimized by response surface test design. The results showed that the best conditions of ethanol/dipotassium hydrogen phosphate dual-aqueous phase system to extraction the Naproxen and Nimodipine in water samples is: Under the ultrasonic power of 200 W, centrifugation speed of 5000 r/min, centrifugation time of 10 min, mass fraction of ethanol is 39%, mass fraction of KH2PO4 is 18%, ultrasonic time of 15 min, the extraction rate of Naproxen and Nimodipine can reach 94.73% and 88.57%. The method is simple, fast and accurate, and can meet the extraction requirements of naproxen and nimodipine.

Keywords:Naproxen, Nimodipine, Dual-Aqueous Phase System, Ultrasonic Assistance, Extraction, High-Efficiency Liquid Chromatography

Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

近年来，药品和个人护理品(PPCPs)在水环境中被频繁检出，已经引起了普遍的关注 [1]。水体中的PPCPs主要来源于过期药物的排放和人畜的排泄物 [2]。查阅资料显示，2000~2004年间，美国用于治疗的药品销量就增加了62%。随着社会的发展和人口老龄化严重，PPCPs的使用量也越来越多 [3]，而萘普生和尼莫地平均属于药品和个人护理品。萘普生(naproxen. NPX)是一种常用的非甾体抗菌药，在医学中广泛被应用于抗炎、解热以及镇痛。但有研究发现，萘普生容易在水体中积聚，且长期摄入萘普生会引发心脏病、痛风病，甚至对肺部产生毒性效应 [4] [5]。尼莫地平( nimodipine, NMDP)是一种双氢吡啶类钙拮抗剂，在医学中广泛被应用于扩张脑血管、改善神经元和阻止癌细胞扩散等作用，且长期摄入尼莫地平会使脑水肿、颅内顶压增高，甚至引起肝功能受损和胃肠道出血 [6] [7]。

双水相萃取技术(ATPS)是一种新型液/液萃取分离技术，具有易于放大、可连续化操作、易集成技术、富集效果好、回收率高等优点 [8]。有研究显示，双水相体系已经成功的应用到金属离子 [9]、部分抗生素 [10] (阿莫西林、金霉素、伊诺沙星等)的萃取和分离中，且效果较好。但目前国内外，几乎没有关于萘普生和尼莫地平的双水相系统萃取的报道，所以本实验根据在双水相体系形成的两相中分配系数的不同，被提取到有机物含量较高的上相，萃取、净化和浓缩的同时完成极大地提高萃取效率。

超声具有操作简单、传质效率较高、便与其他技术联用、清洁且卫生等优点 [11]，所以使其应用范围广泛、被使用的频率高。但是超声波单独使用时，处理速度较慢 [12]、能量消耗较大且成本较高，所以常与其他技术联用(例如氧化技术、光催化技术)。因此，本研究采用响应面优化超声波辅助双水相体系形成正向的协同效应来萃取萘普生和尼莫地平。

2. 材料与试剂

2.1. 材料及试剂

0.45 μm的过滤膜，试管架，15 mL离心管，烧杯，药匙。

萘普生(上海阿拉丁试剂有限公司)；尼莫地平(武汉三宝医药化工国际贸易有限公司)；磷酸氢二钾(上海国药集团化学试剂有限公司)；硫酸铵(汕头西陇科学股份有限公司)；磷酸二氢钠(湖州湖试化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯)；乙醇(分析纯)；聚乙二醇400 (分析纯)；乙腈(分析纯)；实验用水为超纯水。

2.2. 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪、二极管阵列检测器(DAD) (美国安捷伦科技有限公司)；UPWS-1-60D型超纯水器(杭州永洁达净化科技有限公司)；GL-20G-H型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；MS205DU型电子天平(METTLER TOLEDO)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

3. 实验方法

3.1. 标准曲线绘制

称取标样0.2 g，加甲醇使之溶解，并用甲醇定容至100 mL容量瓶中，标记为“原始标准储备液”，置于冰箱低温保存。然后分别移取0.5 mL、1.25 mL、2.5 mL、3.75 mL和5 mL于10 mL容量瓶中再用甲醇稀释定容为不同浓度的混合标准溶液。

3.2. 双水相萃取步骤

称取1.0 g含有萘普生和尼莫地平水样于15 mL离心管中，加入适量的醇和盐，后加超纯水至10 g，在室温度中，设定的超声功率下萃取一定时间后，放置于离心机中，离心转速5000 r/min下离心10 min后取出静止10 min，双水相形成。上相经过0.45 μm的过滤膜过滤，进HPLC测定。

3.3. 单因素试验及响应面优化试验

单因素试验：称取萘普生和尼莫地平粉末，研究双水相体系、超声萃取时间、超声萃取功率、磷酸氢二钾的质量分数及乙醇的质量分数对萘普生和尼莫地平萃取率的影响。响应面优化试验设计，在单因素试验基础上，以萘普生和尼莫地平萃取率为响应值，超声时间、磷酸氢二钾的质量分数和乙醇的质量分数为自变量进行提取条件优化，具体见表1。

表1. 响应面分析因素与水平表

3.4. 色谱条件

色谱柱：依利特Hyprevail Carbohydrate ES柱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm) (大连依利特分析仪器公司)；柱温为30℃；流动相：甲醇–水(65:35)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；波长：254 nm。

3.5. 萃取率计算

将之前处理好的萘普生和尼莫地平提取液，测定上相体积并进行液相色谱分析，并根据峰面积计算样品中萘普生和尼莫地平萃取的浓度，后再根据公式计算二者的萃取率 [13]。采用Excel 2010、Word 2010进行数据处理和分析。

$萃取率/\%=\left(V_t\times C_t\right)/M\times 100$ (1)

公式中： $V_t$ 为上相体积，mL； $C_t$ 为上相物质浓度，g/L；M为加入的药品的质量，g。

4. 结果与分析

4.1. 萘普生、尼莫地平标准曲线线性关系考察

在3.4色谱条件下，配置相同浓度的萘普生和尼莫地平标准溶液，以浓度(mg/L)作为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，回归方程及相关系数。萘普生和尼莫地平在0~1.0 mg/L范围内线性关系良好，线性相关系数r ≥ 0.999，具有较好的灵敏度。以3倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)确定方法的定量限(LOQ)，具体见表2，萘普生和尼莫地平标准品的峰面积如下图1所示。

表2. 标准曲线的线性方程、相关系数r、检出限及定量限

图1. 标准品的HPLC色谱图

4.2. 不同条件对超声波辅助双水相萃取效果的影响

4.2.1. 双水相体系的选择

本研究考察了① 聚乙二醇400–硫酸铵、② 乙醇–硫酸铵、③ 乙醇–磷酸二氢钠、④ 乙醇–磷酸氢二钾、⑤ 乙腈–磷酸氢二钾共5种双水相体系对萘普生和尼莫地平的萃取效果。

如图2所示，在五种双水相体系中，由KH₂PO₄与乙醇组成的双水相体系萃取效率最高：加入0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平，后加超纯水至10 g，温度为20℃，超声功率为200 W，超声时间为10 min的条件下，萘普生的萃取率可达87.02%，尼莫地平可到达81.31%。故本研究后续考察的是优化KH₂PO₄与乙醇组成的双水相体系条件对水体中萘普生和尼莫地平的萃取。

图2. 不同萃取体系对萃取率的影响

4.2.2. 超声时间

在16% KH₂PO₄与36%乙醇组成的双水相体系中，加入0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平，后加超纯水至10 g，温度为20℃，超声功率为200 W的条件，选择超声时间5~25 min，考察时间对萃取率的影响。

由图3所可知，随着时间的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率先是逐渐上升，在超声时间为15 min时，二者萃取率达到最大值，当超声时间过长，将其他杂质更充分溶出，抑制了萘普生和尼莫地平的溶出，导致萃取率的降低。所以最佳时间为15 min。

图3. 时间对萃取率的影响

4.2.3. 超声功率

在16% KH₂PO₄与36%乙醇组成的双水相体系中，加入0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平，后加超纯水至10 g，温度为20℃，超声时间为15 min的条件下，选择超声功率120~200 W，考察功率对萃取率的影响。

从图4看出，随着功率的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率也逐渐上升，在超声波清洗器功率最大限度时，萘普生和尼莫地平的萃取率也达到最大值。所以最佳功率为200 W。

图4. 功率对萃取率的影响

4.2.4. KH₂PO₄质量分数

在温度为20℃，超声功率为200 W，超声时间为15 min的条件下，选择改变KH₂PO₄的质量分数，分别称取1.2~2.0 g (即质量分数12%~20%)的KH₂PO₄与质量分数36%的乙醇，0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平构建10.0 g双水相体系。

如图5所示，随着KH₂PO₄的质量分数的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率先是逐渐上升，在KH₂PO₄的质量分数为18%时，二者萃取率均达到最大值，当KH₂PO₄的质量分数过高时，KH₂PO₄析出慢慢变多，导致萃取率的下降。所以最佳KH₂PO₄的质量分数为18%。

图5. KH₂PO₄的质量分数对萃取率的影响

4.2.5. 乙醇质量分数

在温度为20℃，超声功率为200 W，超声时间为15 min的条件下，选择改变乙醇的质量分数，分别称取3.2~4.8 g (即质量分数32%~48%)的乙醇与质量分数18%的KH₂PO₄，0.5 g萘普生和0.5 g尼莫地平构建10.0 g双水相体系。

在图6中，随着乙醇的质量分数的增加，萘普生和尼莫地平的萃取率先是逐渐上升，在乙醇的质量分数为40%时，二者萃取率均达到最大值，当乙醇的质量分数过高时，可能是下相中的萘普生和尼莫地平的质量浓度也在增加，从而抑制了二者的析出，导致萃取率的下降。所以乙醇的质量分数最佳为40%。

图6. 乙醇的质量分数对萃取率的影响

4.3. 响应曲面法优化实验结果与分析

4.3.1. 模型建立

根据单因素结果，在超声功率200 W的条件下，选择超声时间、KH₂PO₄质量分数和乙醇质量分数为自变量，萃取率为因变量，采用Desgin-Expert 8.0.6.1软件进行3因素3水平响应曲面试验设计及结果见表3。

表3. 响应面试验设计与结果

4.3.2. 萘普生响应面试验结果

1) 响应面结果及方差分析

由表4得，萘普生(P = 0.0015 < 0.05)二次回归方程模型显著，萘普生(P = 0.7693 > 0.05)的失拟项不显著。通过该模型的方差分析可知，A和B对萘普生的萃取率的影响不显著，C对萘普生的萃取率的影响显著。各因素对萘普生萃取率影响效应的大小依次为乙醇质量分数 > KH₂PO₄质量分数 > 时间。

表4. 萘普生萃取率影响因子二次回归模型方差分析

经回归模型拟合，三因素对响应值的影响可以用以下三元二次方程表示：

$萃取率=-472.06-1.00A+37.29B+12.20C+0.16AB+0.061AC+0.074BC-0.14A^2-1.17B^2-0.19C^2$

2) 各因素交互作用响应面与优化验证

如图7所示，萘普生萃取率的响应面的开口向下，萃取率和双水相萃取体系中的三个因素均呈现二次抛物线关系。AB曲面较陡，表明时间和KH₂PO₄质量分数之间的相互作用最为明显；而AC、BC曲面较为平缓，表明时间和乙醇质量分数以及KH₂PO₄质量分数和乙醇质量分数之间的相互作用较小，随数值的增加或减少，响应值变化也小，这与方差分析结果一致。该回归模型具有稳定点，稳定点即使最大值，采用Desgin-Expert软件得到萘普生萃取率的最大响应值时，时间、KH₂PO₄质量分数、乙醇质量分数对应的值分别为15.18 min、18.14%、38.82%，萃取率最大值为95.30%。

图7. 两个萘普生萃取率因素间的交互作用图。(a) 超声波时间和KH₂PO₄质量分数对NPX萃取率的影响；(b) 超声波时间和乙醇质量分数对NPX萃取率的影响；(c) KH₂PO₄质量分数和乙醇质量分数对NPX萃取率的影响

4.3.3. 尼莫地平响应面试验结果

1) 响应面结果及方差分析

由表5得，尼莫地平(P = 0.0011 < 0.05)二次回归方程模型显著，尼地平(P = 0.1010 > 0.05)的失拟项不显著。通过该模型的方差分析可知，A和B对尼莫地平的萃取率的影响不显著，C对尼莫地平的萃取率的影响显著。各因素对尼莫地平萃取率影响效应的大小依次为乙醇质量分数 > KH₂PO₄质量分数 > 时间。

经回归模型拟合，三因素对响应值的影响可以用以下三元二次方程表示：

$萃取率=-345.15+5.35A+21.97B+9.97C+0.014AB-0.022AC+0.12BC-0.16A^2-0.74B^2-0.15C^2$

表5. 尼莫地平萃取率影响因子二次回归模型方差分析

2) 各因素交互作用响应面与优化验证

如图8所示，尼莫地平萃取率的响应面的开口向下，萃取率和双水相萃取体系中的三个因素均呈现

图8. 两个尼莫地平萃取率因素间的交互作用图。(a) 超声波时间和KH₂PO₄质量分数对NMDP萃取率的影响；(b) 超声波时间和乙醇质量分数对NMDP萃取率的影响；(c) KH₂PO₄质量分数和乙醇质量分数对NMDP萃取率的影响

二次抛物线关系。AB曲面较陡，表明时间和KH₂PO₄质量分数之间的相互作用最为明显；而AC、BC曲面较为平缓，表明时间和乙醇质量分数以及KH₂PO₄质量分数和乙醇质量分数之间的相互作用较小，随数值的增加或减少，响应值变化也小，这与方差分析结果一致。该回归模型具有稳定点，稳定点即使最大值，采用Desgin-Expert软件得到尼莫地平萃取率的最大响应值时，时间、KH₂PO₄质量分数、乙醇质量分数对应的值分别为15.11 min、18.17%、38.97%，萃取率最大值为89.09%。

4.3.4. 最优萃取条件验证

现检测试验结果是否与真实情况一致，考虑到实际操作的便利，将萃取萘普生和尼莫地平最佳条件修正为：功率200 W，时间15 min，KH₂PO₄质量分数18%，乙醇质量分数39%，在此条件下进行3次验证实验，测出萘普生的萃取率为94.73%，尼莫地平的萃取率为88.57%，与预测试验结果基本相符，且重复性良好。

4.4. 结论

通过双水相提取并富集环境水样中的萘普生和尼莫地平，建立了一种检测环境水样中萘普生和尼莫地平的高效液相色谱联用技术的方法。实验发现，双水相可以提取环境水样中萘普生和尼莫地平，所建立的方法绿色环保、操作简便、选择性好、灵敏度高、试剂用量少且提取率高，能够满足实际样品分析的要求。运用该方法有可能为应用于测定环境水样中的萘普生和尼莫地平提供理论科学依据。

基金项目

浙江省科技厅分析测试项目(LGC19B050010)。

文章引用

陶雅亭,饶桂维,方应国. 乙醇/磷酸氢二钾双水相体系萃取水样中萘普生和尼莫地平的研究
Study on Extraction of Naproxen and Nimodipine from Water Sample by Ethanol/Dipotassium Hydrogen Phosphate Dual-Aqueous Phase System[J]. 水污染及处理, 2021, 09(03): 113-124. https://doi.org/10.12677/WPT.2021.93014

参考文献