ABSTRACT

Ancient tree tea has important scientific, social, economic and cultural value, but there is less research on its genetic diversity at present. In the study, 8 pairs of SSR primers were used to analyze the genetic diversity of the ancient tree tea and a total of 18 alleles were detected. Within the population, the average observed heterozygosity (Ho) was 0.392 and the expected heterozygosity (He) was 0.353. The average Shannon information index (I) was 0.578, and the average percentage of polymorphic loci (P%) was 75%, indicating that the ancient tea resources in these areas are rich in genetic diversity. According to Nei’s genetic distance and heritability, the genetic distance between Wengji and Mangjing was the closest (0.019) and has the highest similarity (0.982). The genetic distance between Nannuoshan and Dapingzhang had the largest difference of 0.303 and the lowest similarity with 0.739. AMOVA analysis showed that the genetic differentiation coefficient (Fst) between the ancient tea plants was 0.133, which indicated that the ancient tea tree population was moderately differentiated. Further analysis showed that 87% of the genetic variation was within the population and 13% of the genetic variation was among the different populations. The ancient tea tree resources in 10 regions can be divided into 2 categories using the UPGMA method for cluster analysis. One category includes Laobanzhang, Wengji, Mangjing, Huazhuliangzi and Dapingzhang, and another kind of cluster covers Nannuoshan, Xiaomengsong, Luoshuidong, Mahei and Gaoshanzhai. In this paper, the results will provide theoretical basis for research on the construction of genetic map, gene localization, germplasm identification and genetic relationship as well as genetic basis for the identification, protection and utilization of the rare ancient tea tree resources.

Keywords:Xishuangbanna, The Ancient Tea Plants, Genetic Diversity

西双版纳地区古茶树遗传多样性分析

杨金玲¹，赵艳娟¹，黄光福¹，Getachew Melaku¹，乔琴¹，张静¹，张石来¹，刘本英²， 黄立钰^1*

¹云南大学农学院，云南 昆明

²云南农科院茶叶研究所，云南 勐海

收稿日期：2018年6月20日；录用日期：2018年7月10日；发布日期：2018年7月17日

摘 要

古树茶具有重要的科学和社会经济文化价值，但目前对其遗传多样性研究较少。本文利用8对SSR引物对古树茶种质资源进行遗传多样性分析，共检测到18个等位基因，居群的平均观察杂合度(Ho)为0.392，期望杂合度(He)为0.353，shannon信息指数(I)平均为0.578，多态位点百分率(P%)平均为75%，说明这些地区的古树茶资源具有丰富的遗传多样性。根据Nei’s遗传距离和遗传一致度来看，翁基和芒景遗传距离最小，为0.019，两者的一致度最高，为0.982；南糯山和大平掌的遗传距离相差最大，为0.303，一致度最低，为0.739。AMOVA分析显示，古茶树之间的遗传分化系数(Fst)为0.133，古茶树群体间属于中度分化，87%的遗传变异来自居群内，13%的遗传变异来自居群间。用UPGMA法，进行聚类分析，可将10个地区的古茶树资源分为2大类：一类是以老班章为代表的翁基、芒景、滑竹梁子和大平掌聚；另一类是以南糯山为代表的小勐宋、落水洞、麻黑和高山寨。本文研究结果将为古树茶遗传图谱构建、基因定位、亲缘关系和种质鉴定等研究提供理论依据，为珍稀古茶树资源的鉴定、保护和利用提供一定的遗传基础。

关键词 :西双版纳，古茶树，遗传多样性

Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

云南省是中国乃至世界上保存古茶园面积最大、古茶树最多，资源最集中的地区。古树茶包括古老野生型、过渡型、栽培型古茶树群落和茶树王，据不完全统计，云南省目前在47个境县内发现大约130处古茶树群落 [1] ，古树茶具有重要的科学和社会经济文化价值，是世界重要的农业文化遗产。研究表明，山茶科植物起源已有6000~7000万年的历史 [2] ，在漫长的古地质和气候变化历史中，茶树形成了独特的形态特征、生理生化特性、生长发育和遗传规律。西双版纳、普洱、临沧、保山等地区是云南野生型、过渡型大茶树和栽培型古茶园的集中分布区，是古茶树、古茶园的典型代表，受到国内外专家学者的高度评价。陈进等 [3] 对云南不同地区的地方栽培品种与野生亲缘关系的遗传多样性的研究表明，古茶园茶树遗传多样高于台地茶，说明云南的地方品种在长期的栽培驯化中并未造成遗传多样性的丧失。古茶树资源具有丰富的遗传多样性，几乎包括了原始和进化的各种类型，是研究茶树起源和进化必不可少的材料 [4]。云南古茶树存活了数百年甚至上千年，除了得天独厚的自然环境和本身丰富的遗传多样性为古茶树的生存提供保障以外，通过调查发现 [5] ，古茶园通常不施肥翻耕，由于山区交通不便，茶叶向外运输困难，古茶树仅在春季采摘，从而保证了有充足的时间积累养分。此外，云南海拔高，生态环境良好，环境污染少，植被覆盖率高，阳光充足且多云雾，古茶树根深干粗，吸取日月精华，接受大地滋养，无需施化肥农药，与此同时，古茶树的树大、冠大、根深，能最大限度地吸收和储存土壤中的丰富养分。这一定程度上符合了现代人对于食品安全与生态的追求。消费者对茶叶消费的质量和生态意识的追求，扩大了古茶树的知名度与影响力。消费者对传统的古树茶需求量的增加，使得云南古茶园、古茶林的社会经济价值得以体现。

近年来SSR术成为研究茶树遗传多样性、目的基因定位、种质资源鉴定和遗传育种等研究的重要手段。刘振等人 [6] 用SSR引物揭示出60份茶树拥有丰富的遗传多样性；段云裳 [7] 分别用40、39和58对引物对乌龙茶品种(系)，红绿茶品种(系)以及无性品种分析，均表现出较高的遗传多样性；此外，尚卫琼等人 [8] 用28对SSR引物对94份大叶茶种质材料进行遗传多样性分析，结果表现出丰富的遗传多样性。本文通过SSR分子标记进一步对西双版纳部分茶区的古树茶资源进行了遗传多样性分析，明确不同地区古树茶个体之间的亲缘关系，结果将为古树茶遗传图谱构建、基因定位、亲缘关系和种质鉴定等研究提供理论依据。

2. 材料和方法

2.1. 实验材料

本实验的材料均为云南大叶种栽培型古茶树，共计164个样品，来源于西双版纳地区不同的10个地点，材料名称来源及编号见表1，10个不同地点取样的地理位置见图1，将采集好的样品储存于-80°C冰箱里备用。

2.2. DNA的提取和SSR-PCR的扩增及电泳

DNA提取方法及PCR扩增检测参照王磊 [9] 、黄建安 [10] 等人的方法进行，选择引物参考王磊硕士论文 [9] ，对众多引物进行扩增预实验，从中选择了8对多态性较好的引物进行下一步扩增。SSR引物由昆明硕擎生物技术公司合成，引物序列序列见表2。

PCR总反应体系为15 μl (dd H₂O 9.1 μl，10× buffer 1.5 μl，dNTPs 1.2 μl，Primer F 0.5 μl，Primer R 0.5 μl，DNA 2 μl，Taq酶0.2 μl)，按顺序依次加入以上试剂，混匀后，按照以下程序进行PCR扩增：94℃预变性5 min，94℃变性1min，57℃~59℃退火1 min，72℃延伸1 min，32个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。扩增结束后，取2.5 μl的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

表1. 用于遗传多样性分析的10个古树茶居群信息

图1. 10个不同古树茶茶区地理位置

表2. 引物信息列表

2.3. 数据处理和分析

采用人工计读条带的方法，在电泳胶上不同位置的清晰条带上从上到下依次记为“1，2，3，4”，例如MS1样品在G2引物下的基因型为“23”，MS2样品在G2引物下的基因型为“123”，依次类推，制作成基因型Excel表，把基因型导入CONWERT软件中，把原始数据矩阵转换成基因型数据类型，再采用GeneAlEx 6.502软件分析计算出观察等位基因的数目(Na)，有效等位基因数目(Ne)，shannon多样性指数(I)，观察杂合度(Ho)，遗传分化系数(Fst)，基因流(Nm)等遗传多样性参数，使用Popgene2软件进行聚类分析图绘制。

3. 结果

3.1. 古茶树叶片DNA的提取结果

经改良过的CTAB法提取茶树基因组总DNA条带基本清晰明亮，没有降解，没有断裂，说明完整性比较好，基本符合SSR-PCR的要求。

3.2. SSR标记及其位点多样性分析

本研究利用8对SSR引物在所有群体中共检测到18个等位基因，表3中显示，所观察等位基因的平均数(Na)为2.263，平均有效等位基因数Ne = 1.815，变化范围为1.023 (G5)~2.545 (G8)；观察杂合度(Ho)的变化范围0.000 (G4)~0.840 (G8)，平均为0.392；期望杂合度(He)的平均值为0.353，变化范围为0.020 (G5)~0.596 (G8)；Shannon信息指数(I)在0.069 (G4)~1.005 (G7)之间变动，平均0.578；从表3中的固定指数(Fis)可知，G3，G4和G5这3对引物的固定指数(Fis)为正值外，其余地方均为负值，8个位点的平均固定指数(Fis)值为−0.083，说明这些标记能较好的反应参试古茶树群体平均杂合度，且杂合度较高。以上结果说明，8对SSR核心引物能较好的显示参试材料的遗传多样性。

3.3. 遗传多样性

对10个不同茶区164个古茶树样品中采用8个SSR标记进行群体内遗传多样性研究表明(表4)，观察杂合度(Ho)的变化范围在0.256~0.510，平均值为0.392，最高的是老班章古茶树群体，期望杂合度(He)在0.270~0.430之间变动，平均值为0.353，期望杂合度(He)与观察杂合度(Ho)的平均值比较接近，两者之间的值越接近说明群体遗传多样性越高 [11]。Shannon信息指数(I)的平均值为0.578，大小在0.459~0.687

表3. 8对SSR引物在164份古茶树资源的多态性扩增信息

表4. 不同地理来源的古茶树遗传多样性分析

之间，十个居群的多态位点百分率为75%，数值大小均在62.5%~87.5%之间，绝大多数为75%，表明这10个不同地区的古茶树具有高度的多态性，这说明了这10个古茶树居群遗传多样性丰富，可以为品种选育提供丰富优质的材料。表4中不同茶区古茶树居群的遗传多样性参数，说明了供试材料具有较为丰富的遗传多样性。

3.4. 遗传分化

Fst参数用来描述群体的分化程度 [12]。在表5中，群体遗传分化系数(Fst)为0.133，处于0.05~0.15之间，表明古茶树群体间属于中度分化 [13] ，87%的遗传变异来自居群内，13%的遗传变异来自居群间。古茶树的遗传多样性主要源于居群内，但水平较低，不同地区的居群存在一定的遗传分化，居群内的遗传多样性高于居群间的遗传多样性。此外，西双版纳地区不同地理区域的古茶树基因流(Nm)较高，为1.624 (>1)，说明古茶树群体存在一定的基因交流。

3.5. 遗传距离

本研究所用的样品涉及到了滇南6个乡镇，10个不同的茶山，将每一个取样的茶山看作是一个群体进行分析，对地理居群之间的遗传一致度和遗传距离分析，如表6。

遗传距离(D)和遗传一致度(I)分别是从相同和相反方面看遗传关系的指标，地理遗传距离反应了各居群之间的亲缘关系远近 [14] ，从表6中可以看出，164份古茶树的遗传距离在0.019~0.303之间，说明这些古茶树具有一定的遗传差异，遗传多样性较高。翁基和芒景遗传距离最小，只有0.019，其次是麻黑和高山寨，两者之间的遗传距离为0.021；这有可能跟两者之间的地域的远近有关。南糯山和大平掌两个地区的遗传距离相差较大，高达0.303。从一致度来看，翁基和芒景的一致度是最高的，为0.982，南糯山和大平掌的一致度最低，为0.739，这说明了遗传距离越远，遗传的一致度越低，遗传距离越近，遗传的一致度越高，而且遗传的一致度和遗传距离与古茶树所在的地理位置具有很强的关系。翁基、芒景、大平掌都位于惠民乡景迈山，遗传距离均小于0.1，所以遗传距离很近，遗传一致度也高；麻黑、落水洞、高山寨都属于勐腊县易武乡，遗传距离相对很近，遗传一致度高。

表5. 不同地区古茶树居群间的遗传分化

表6. 地理居群间的遗传一致度和遗传距离

注：*上为遗传一致度，*下为遗传距离。

3.6. 聚类分析

根据UPGMA聚类图显示(图2)，以老班章为代表的翁基、芒景、滑竹梁子、大平掌聚在一类，以南糯山为代表的小勐宋、落水洞、麻黑、高山寨聚为一类。从遗传距离来分析，麻黑和高山寨遗传距离最小，相似度最高，两者与老班章的遗传距离最大，说明各个茶山古茶树的遗传距离与地理距离有很大的关系，该结果与遗传距离的分析结果基本一致，出现这一聚类结果可能是因为长期以来的人工养护，良好的自然生态环境和一定地域范围内少数民族的宗教信仰相关。

4. 讨论

4.1. 古茶树的遗传多样性

从物种水平上看，多态性百分数是衡量一个种群遗传变异水平高低的一个重要指标，一个种群多态性分数高说明这个物种适应不良环境能力较强，种群多态性百分数低说明物种难以适应不良环境从而在自然选择过程中就会有被淘汰的可能 [15]。Shannon信息指数(I)能反应供试材料的遗传多样性水平，西双版纳地区不同居群古茶树的多态性百分数(P = 75%)、Shannon信息指数(I = 0.578)，期望杂合度(He = 0.353)与观察杂合度(Ho = 0.392)的平均值比较接近，说明西双版纳地区古茶树群落遗传多样性高 [11]。推测古树茶遗传多样性丰富的原因可能是：第一，人为保护自然，特别是保护古茶树的意识强；第二，茶树是多年生异花授粉植物，具有自交不亲和性 [16] ，野生茶树长期进行着天然杂交，基因交流频繁，具有高度

图2. 基于遗传距离的不同地区古茶树UPGMA聚类图

杂合性和异质性，导致遗传背景复杂，呈现较高的遗传分化；第三，云南的西南部是茶树的原产地，茶树的起源可能影响不同地区的茶树遗传多样性水平 [17] ；第四，遗传多样性的高低与温度和复杂的生态环境有密切的关系 [18] ；第五，SSR分子标记技术具有可靠性高，多态性好，操作程序简单等优点，在植物遗传育种中广泛应用，SSR标记也在茶树分子领域中广泛利用，是茶树遗传领域的热点，在茶树的品种鉴定、遗传图谱构建及遗传多样性中广泛应用，而当前研究所采用的引物较少，所采样本也存在着一定的局限性，在物种水平上容易导致遗传多样性指标偏高，今后应进一步开发增加SSR标记的数量，为茶树种质资源的应用提供更多的标记材料。

4.2. 古茶树的遗传分化

居群遗传结构是指遗传多样性在居群内和居群间的分布，即遗传分化。遗传分化主要用来衡量种群大小、组成、差异、繁育系统、隔离程度和迁移格局的时空动态 [19]。有研究表明 [20] ，不同的物种其分布地区、环境因素、生态习性，自然选择，突变、演化阶段等的变化都会影响着种群的遗传结构。种群在遗传结构上的差异能够体现出一个种群的遗传多样性水平，一个物种对恶劣环境的适应能力与种群内的遗传变异和种群结构有关 [21]。Wright等 [13] 指出群体分化系数(Fst)处于0~0.05之间群体分化较小，可忽略不计，Fst处于0.15~0.25之间，属于中度分化，当Fst处于0.25时，出现了很大程度的分化。本研究中，古茶树群体间存在中等分化(Fst = 0.133)，而AMOVA分子变异分析也显示了古茶树居群间产生了一定的遗传分化(13%)，古茶树的遗传多样性主要源于居群内(87%)。据有关研究表明 [22] ，其部分原因是异质生境导致的地理隔离和因生态破坏导致的基因流等因素。唐探 [19] 对镇沅县野生型茶树的AMOVA分子方差分析也表明，在野生茶树居群间，有16.32%的个体发生了变异，其余大部分的变异均发生在居群内，野生茶的居群间出现了一定程度的遗传分化。季鹏章等 [23] 通过ISSR对云南古茶树遗传多样性AMOVA分子方差分析，发现在变种水平上，大部分的遗传变异存在于居群内，少部分的遗传变异存在于居群间，居群之间表现出中度的遗传分化。遗传变异大决定了物种的进化能力强，抵御外界不良环境的能力强 [24]。此外，基于RAPD、AFLP、ISSR等分子标记对于茶树资源的研究均发现 [25] [26] [27] [28] [29] ，绝大部分的遗传变异存在于居群内，居群间的遗传差异对整体遗传多样性的贡献较小。这可能是因为一方面在地理区域的划分上存在着人为因素或者突变等因素影响；另一方面可能是由于茶树是异花授粉的植物，不同地域间的茶树不断异交，导致不同种质类型的茶树和不同的群体间基因交流频繁，不同群体间基因分化系数低，遗传差异大，导致遗传背景复杂。因此，在采样过程中要根据茶树遗传结构特点，在地理间隔大的基础上，在同一个群体内多取样，而少取群体。

基因流(Nm)是影响植物遗传变异的重要因素，也是影响植物种群遗传结构的主要因素，对于保护濒危植物具有重要的意义 [30]。Wright [31] 表明若Nm < l，则是群体间的遗传分化是由于遗传漂变导致的，本研究中，基因流Nm=1.624 > 1，说明群体间的遗传分化不是由于遗传漂变产生的，有可能是与群居所处的人文环境和人为因素的干扰有关，气候、温度、土壤等生态因子的差异性也可能是导致品种问遗传分化的主要内因。

4.3. 古茶树遗传距离

本研究的结果中，基于遗传距离和遗传一致度的分析结果表明，翁基和芒景遗传距离最小，麻黑和高山寨之间的遗传距离也相对较小，遗传距离最大的是南糯山和大平掌两个地区，从地理区域来看，南糯山位于勐海县格朗和乡，大平掌位于澜沧县惠民乡，翁基和芒景距离较近，同属澜沧县惠民乡景迈山，麻黑和高山寨则隶属于勐腊县易武乡，地理距离和遗传距离具有显著的相关性。遗传距离越远，遗传的一致度越低，遗传距离越近，遗传的一致度越高。在黄晓霞等 [32] 对千家寨不同海拔野生茶的遗传多样性研究中，在不同海拔上野生茶树居群的遗传距离越小(0.09)，一致性越高(0.91)，遗传距离越大(0.56)，一致性越低(0.57)，这和本研究中遗传距离和遗传一致度的关系基本一致。李赛君等 [33] 对16个茶树品种进行遗传距离分析，高芽齐和湘红茶2号一致度最小(0.37)，相反遗传距离远。季鹏章等 [34] 用AFLP标记分析古茶园与台地茶园遗传多样性，西双版纳6个阿萨姆茶的是南糯山和云抗10号的遗传距离为0.1674，居群间的Nei’s遗传距离最大，最小的是小勐宋和易武为0.0122；遗传一致度最大的是小勐宋和易武武为0.9879，最小的为南糯山和云抗10号为0.8459。在本研究中，南糯山和大平掌的遗传距离最大，一致度最小，小勐宋和易武三个地区(落水洞、麻黑、高山寨)的遗传距离分别为0.139、0.102和0.119，两个研究结果基本趋于一致，差值较小，仅为0.1左右，说明小勐宋和易武古茶树之间存在一定的亲缘关系，在聚类图中聚成一个小类的古茶树又可能存在着独特的遗传关系。

姚明哲 [35] 对中国茶树资源的遗传结构分析也得出了同样的结论。说明了西双版纳地区古茶树资源的遗传多样性广泛存在，因此要进一步对古茶树种质资源开发与利用，合理选择遗传多样性高，遗传结构有差异的古茶树种质资源，在育种方面高度重视不同地理区域的种质资源，拓宽同一地理区域不同种质资源的遗传多样性基础性作用。对于遗传多样性水平高的古树茶资源要加以重视和保护，近几年由于古树茶价格不断攀升，部分地区保护不当导致采摘严重、开发不当，造成了一些古茶树资源破坏。

古茶树种质资源是云南的特色资源，如果一旦遭到破坏，将严重威胁着整个居群的丧失繁衍，从而影响到云南古茶树种质资源的遗传多样性和种群居群规模。所以，古茶树的遗传多样性研究可以为珍稀古茶树资源的鉴定、保护和利用提供一定的遗传基础。

致谢

本研究依托云南省多年生稻工程技术研究中心，由国家重点基础研究发展计划(973计划) (2013CB835201)资助完成。

文章引用

杨金玲,赵艳娟,黄光福,Getachew Melaku,乔琴,张静,张石来,刘本英,黄立钰. 西双版纳地区古茶树遗传多样性分析
Genetic Diversity Analysis of Ancient Tea Plants in Xishuangbanna Area[J]. 植物学研究, 2018, 07(04): 442-452. https://doi.org/10.12677/BR.2018.74054

参考文献