青海大学，青海 西宁

收稿日期：2021年2月25日；录用日期：2021年3月12日；发布日期：2021年3月30日

摘要

为探索分离自青藏高原高寒草地产漆酶新真菌菌株Marasmius tricolor 310b对苯甲烷类、蒽醌类和偶氮类染料的脱色效果，采用摇瓶发酵法获得漆酶粗酶液进行脱色实验。结果表明菌株Marasmius tricolor 310b漆酶发酵粗酶液都能够有效的降解溴甲酚绿(苯甲烷类)、茜素红(蒽醌类)、刚果红(偶氮类) 3种染料，但降解效果有所差异，其中，以苯甲烷类染料脱色作用最优。另发现菌株Marasmius tricolor 310b发酵粗酶液对3种染料的降解程度与波长和反应时间有直接关系，随着反应时间的延长，降解效率有不同程度提高。我们的研究初步揭示了新菌株Marasmius tricolor 310b发酵粗酶液对苯甲烷类、蒽醌类、偶氮类具有明显的脱色效果，这一发现对于更新具有脱色效果的真菌资源库有一定的理论支持。

关键词

发酵粗酶液，染料，脱色，菌株Marasmius tricolor 310b

Study on Decolorization Effect of Three Dyes by Fermentation Crude Enzyme Solution of Marasmius tricolor 310b

Zhihui Wang, Guangxin Lu^*, Caixia Huang, Yingcheng Wang, Bingyan Liu, Yumu Pan, Wenjun Zheng

Qinghai University, Xining Qinghai

Received: Feb. 25^th, 2021; accepted: Mar. 12^th, 2021; published: Mar. 30^th, 2021

ABSTRACT

In order to explore the decolorization effect of a new laccase producing fungus, Marasmius tricolor 310b, isolated from the alpine grassland of Qinghai-Tibet Plateau on phenylmethane, anthraquinone and azo dyes, we used shaking flask fermentation method to obtain the crude laccase solution. The results showed the Marasmius tricolor 310b can have a good decolorization effect on the three dyes bromocresol green, alizarin red and Congo red, and the benzomethane dye had the best decolorization. In addition, we found that the degradation degree of the crude enzyme solution of Marasmius tricolor 310b was related to the wavelength and reaction time, and with the reaction time increases, the degradation efficiency increased to different degrees. Our study revealed that the crude enzyme solution of the new strain Marasmius tricolor 310b had obvious decolorization effect on phenylmethane, anthraquinones and azo. This finding provided some theoretical support for updating the fungus resource bank with decolorization effect.

Keywords:Fermentation Crude Enzyme Solution, Dye, Decolorization, Marasmius tricolor 310b

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1. 引言

漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，漆酶广泛分布于多种植物、真菌、部分细菌和昆虫中，在一些动物肾脏和血清中也有发现 [1]。漆酶具有广泛的底物特异性，因此漆酶可以催化氧化工业上常用的多数染料，并不会产生有毒有害的物质，且具有较高的稳定性，多应用于工业染料脱色和纸浆漂白等领域 [2] [3] [4] [5]。由于微生物产漆酶培养具有周期短、易繁殖等优势，使得微生物产漆酶成为工业用途的重要来源 [6]。

实现绿色发展，加强生态文明建设，是新时期各行业高质量发展的必然要求。漆酶本身可作为一种“绿色催化剂” [7]，其特有的性质可以被广泛应用于对染料的脱色和废水处理，是解决污染问题的根本之策。对建设富强美丽的中国和清洁美丽的世界具有十分广阔的应用前景。本论文拟对实验前期分离筛选获得的产漆酶真菌菌株Marasmius tricolor 310b发酵获得粗酶液，研究用该酶液对溴甲酚绿、茜素红、刚果红等3种染料的脱色作用，旨在探索和发现对染料具有脱色效果的新的真菌资源，同时也为印染和纺织工业排放废水的生物治理技术奠定基础。

2. 材料与方法

2.1. 供试染料

选用溴甲酚绿、刚果红、茜素红等3种染料。染料的性质如下。

将表1的3种染料(溴甲酚绿、刚果红、茜素红)单独配制成终浓度为20 mg/L的溶液，然后等体积混合，摇匀、静置，配置成混合染料溶液。

表1. 3种染料的基本性质

2.2. 供试菌株

供试的菌株由本课题组从高寒草地土壤中分离筛选获得，菌株编号为：菌株Marasmius tricolor 310b [8] 存于4℃冰箱。

2.3. 培养基

活化、复壮培养基 [8]：采用PDA培养基进行菌株的活化和复壮。

液体产酶培养基 [8]：NaNO₃ 2.5 g，KH₂PO₄ 1 g，CaCl₂·6H₂O 0.1 g，MgSO₄ 0.3 g，NaCl 0.1 g，FeCL₃ 0.01 g，油菜秸秆(粉) 0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH (用稀盐酸调制6.0~7.0)。

2.4. 研究方法

2.4.1. 漆酶粗酶液的制备及酶活力检测方法

将活化的菌株分别接种于以0.5 g秸秆粉为底物，盛有50 mL液体产酶培养基150 mL的锥形瓶中，以不接菌为对照，每个处理重复3次。在25℃ 150 r/min条件下，置于摇床震荡培养，试验周期为7 d。实验结束后，经尼龙丝网过滤的发酵液，用灭菌的1000 µL移液器枪头，吸取2 mL上清液，于4℃，10,000 r/min，离心10 min，取上清液制备粗酶液。

2.4.2. 染料脱色实验

脱色实验反应体系总体积为20 mL，在带有刻度的试管中加入0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH = 4.5) 15 ml，再加入5 ml发酵粗酶液，混匀后在30℃的水浴锅中预热30 min。取出后在室温条件下放置30 min，以灭活的粗酶液为空白对照体系。自加入5 ml染料溶液起开始反应并计时，分别在2 h、24 h和48 h后定时取样，采用分光光度计在400~740 nm范围内进行全波长扫描，测定反应体系的吸光值的变化，同时，测定各染料最大吸收波长处的吸光值，计算脱色率。脱色率(%) = (A₀ − A₁)/A₀ × 100。其中：A₀为染料溶液初始吸光度，A₁为染料溶液最终吸光度。

2.5. 数据处理及分析

所有数据均用Microsoft Excel录入并作图，采用DPS 6.55进行统计分析。

3. 结果与分析

3.1. 3种染料的吸收峰及波长

在340~740 nm范围内，用分光光度计对3种染料溶液(终浓度为20 mg/L)进行全波长扫描，测定不同波长的吸收峰，测定结果如下：溴甲酚绿有3个峰值(图1)，分别是405 nm、570 nm、620 nm；茜素红有3个峰值(图2)，分别是405 nm、485 nm、530 nm；刚果红有2个峰值(图3)，分别是405 nm、485 nm。

图1. 溴甲酚绿的波长

图2. 茜素红的波长

图3. 刚果红的波长

3.2. 对3种不同染料的脱色效果

对溴甲酚绿的脱色实验结果表明，与对照相比，加入发酵粗酶液后吸光值下降，说明漆酶发酵液具有一定的脱色作用。但在不同波长范围内，吸光值变化与反应时间有关(图4(b))，400~475 nm和475~580 nm范围内，在反应2 h后，染料的吸光值明显下降，590~700 nm范围内，与反应2小时的吸光值相比，24 h后吸光值下降明显，说明目标菌株漆酶粗酶液对染料的脱色与波长有关，400~475 nm和475~580 nm范围内，脱色所需的时间较短，而在590~700 nm范围内脱色所需的时间较长。对溴甲酚绿的三个吸收峰吸光值的测定结果来看，3个吸收峰(405 nm、570 nm和620 nm)均有一定程度的降解(图4(a))，在405 nm处2 h、24 h、48 h后的降解率分别是10%、12.1%、17.5%；在570 nm处2 h、24 h、48 h后的降解率分别是13.2%、11.3%、17.5%；在620 nm处2 h、24 h、48 h后的降解率分别是20%、27.55%、32.1%。由此可见，在620 nm吸收峰的降解效果最好，并且48 h后脱色效果较好。

图4. 溴甲酚绿脱色效率

对茜素红的脱色实验结果表明，与对照相比，400~475 nm、475~580 nm以及590~700 nm范围内，反应2 h后，染料的吸光值明显下降(图5(b))。说明目标菌株漆酶粗酶液在2 h内可以达到对茜素红的脱色效果。对茜素红的三个波长范围而言，其中有两个波长即405 nm、530 nm降解效果较好(图5(a))，在405 nm处2 h、24 h、48 h后的降解率分别是7.5%、9.8%、19.5%；在530 nm处2 h、24 h、48 h后的降解率分别是7.5%、14.3%、22.3%，由此可见，在405 nm和530 nm的吸收峰的降解效果较好，且48 h后脱色效果较好。

图5. 茜素红的脱色效率

对刚果红的脱色实验结果表明，与对照相比，400~580 nm范围内，反应2 h就可以脱色，590~700 nm范围内，脱色效果不明显(图6(a))。对刚果红的三个吸收峰而言，其中有1个波长即485 nm降解效果较好，2 h、24 h、48h后的降解率分别是9.8%、18.5%、17%，在24 h时脱色效果好，其余两个吸收峰的降解率不明显(图6(b))。

图6. 刚果红的脱色效率

3.3. 混合染料的降解效果

混合染料在400~740 nm范围内进行全波长扫描，测定反应体系的吸光值。结果表明(图7)，与对照相比，在反应2 h后，混合染料的吸光值下降，说明漆酶酶液对混合染料具有脱色作用，但随着时间延长，脱色效果没有表现出明显的差异。

图7. 混合染料的降解作用

4. 讨论

本研究通过检测粗酶液与不同染料溶液在不同反应时间吸光度值的变化，定量分析了漆酶粗酶液对不同染料及混合染料溶液的脱色效果。结果表明菌株Marasmius tricolor 310b漆酶发酵粗酶液都能够有效的降解溴甲酚绿、茜素红、刚果红以及3种染料的混合溶液的脱色，但降解效果有所差异，其中，对苯甲烷类染料脱色作用最好，其次是蒽醌类染料，再次为偶氮类染料。从不同染料的吸收峰的降解情况来看，菌株Marasmius tricolor 310b发酵粗酶液的底物范围较广，但对不同类型染料的不同吸收峰的降解效果不同，说明对同一类型染料中的底物具有一定的特异性。我们的研究也发现菌株Marasmius tricolor 310b发酵粗酶液对不同染料的降解程度与波长和反应时间有直接关系，随着反应时间的延长，降解效率有不同程度提高。

据报道，漆酶是一类特殊的氧化还原酶，对多种染料、木质素及其衍生物等都有良好的降解作用，现已成为微生物学等多领域的研究热点 [9] [10]。以往的研究指明，漆酶所用的底物多为酚类、芳香类、多环类化合物及其衍生物，这些都具有复杂的多环结构 [11]，且广泛应用于工业中。在本研究中我们使用蒽醌、偶氮、三苯甲烷类合成染料进行供试菌株对三类合成染料的脱色研究。已有的研究发现，白腐菌漆酶可以对芳香环化合物进行氧化这一特性，使得纺织染料的脱色及降解效果明显 [12]。华煜 [13] 等人研究发现，酸性橙可以被米曲霉菌脱色，且金属离子Mg²⁺对其有促进作用，随着漆酶与底物反应时间的延长，还可以降解萘环。利用漆酶具有特殊的催化特性，随着漆酶的氧化还原电势的增高，在介体的协助下，漆酶可以降解的底物范围也就越广泛，其催化反应速率和转化率也得以大幅提高 [14]。Ranimol G [9] 等人使用愈创木酚为底物，在未优化的木霉中生产漆酶，发现其可以对纺织染料进行脱色。由此可见，不同真菌产漆酶对染料的降解效果与染料组成关系密切。到目前为止，利用高质量的工业化漆酶的途径较少，导致漆酶的产业化应用受到限制，在自然环境中继续寻找产漆酶的微生物资源仍然是人们努力的方向。因此，对产漆酶真菌资源的发掘和漆酶的作用的深入研究，将对新时期印染和纺织工业排放废水处理提供新的思路。

基金项目

国家自然科学基金项目(31860103，31770027)。

文章引用

王志慧,芦光新,黄彩霞,王英成,刘炳炎,潘宇睦,郑文珺. 菌株Marasmius tricolor 310b发酵粗酶液对3种染料脱色效果的研究
Study on Decolorization Effect of Three Dyes by Fermentation Crude Enzyme Solution of Marasmius tricolor 310b[J]. 微生物前沿, 2021, 10(01): 81-89. https://doi.org/10.12677/AMB.2021.101010

参考文献