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Advances in Clinical Medicine
Vol. 13  No. 03 ( 2023 ), Article ID: 62463 , 8 pages
10.12677/ACM.2023.133515

清营汤可减轻SAP大鼠肠屏障氧化应激损伤

高照宇1，李医铭2*，姜英健3，李洪波3，王江3，张佃良3

1青岛大学医学部，山东 青岛

2青岛大学附属青岛市海慈医院神经内三科，山东 青岛

3青岛市市立医院普外一科，山东 青岛

收稿日期：2023年2月13日；录用日期：2023年3月9日；发布日期：2023年3月15日

摘要

重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis, SAP)常伴随肠屏障功能损伤，从而恶化预后，但其机制不明确，治疗方式不统一。本研究的目的是探究通过服用古方清营汤能否减轻这一损伤，并观察其对肠粘膜机械屏障的作用。采用逆行胆管注射5%牛磺胆酸钠建立SAP模型。将大鼠分为3组：对照组(SO)、SAP组(SAP)、清营汤干预组(QYT)。检测血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α等指标评估炎症严重程度。HE染色观察肠道组织学变化；采用超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)检测肠上皮细胞氧化应激；检测肠屏障相关蛋白的表达。结果显示，QYT组血清指标、组织损伤严重程度、氧化应激水平均显著低于SAP组同时肠屏障相关蛋白表达回升。这些结果表明清营汤可减轻SAP大鼠肠屏障氧化应激损伤，为该病的治疗提供新思路。

关键词

清营汤，氧化应激，肠屏障，紧密连接，重症急性胰腺炎

Qingyingtang Can Reduce Oxidative Stress Injury of Intestinal Barrier in SAP Rats

Zhaoyu Gao1, Yiming Li2*, Yingjian Jiang3, Hongbo Li3, Jiang Wang3, Dianliang Zhang3

1Medical College, Qingdao University, Qingdao Shandong

2Third Department of Neurology, Qingdao Haici Hospital Affiliated to Qingdao University, Qingdao Shandong

3Department of General Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao Shandong

Received: Feb. 13th, 2023; accepted: Mar. 9th, 2023; published: Mar. 15th, 2023

ABSTRACT

Severe Acute Pancreatitis (SAP) is often accompanied by intestinal barrier dysfunction, which worsens the prognosis, but its mechanism is not clear, and the treatment is not uniform. The aim of this study is to investigate whether Qingyingtang, an ancient prescription, can alleviate this injury and to observe its effect on the intestinal mucosal mechanical barrier. The SAP model was established by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the bile duct. The rats were divided into three groups: control group (SO), SAP group (SAP) and Qingying tang intervention group (QYT). Serum amylase, lipase, TNF-α and other indicators were detected to evaluate the severity of inflammation. HE staining was used to observe intestinal histological changes. Superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) were used to detect oxidative stress of intestinal epithelial cells. The expression of intestinal barrier related proteins was detected. The results showed that the serum indexes, tissue injury severity and oxidative stress level in QYT group were significantly lower than those in SAP group, and the expression of intestinal barrier related proteins increased. These results indicate that Qingyingtang can reduce oxidative stress injury of intestinal barrier in SAP rats, and provide a new idea for the treatment of SAP.

Keywords:Qingyingtang, Oxidative Stress, Intestinal Barrier, Tight Junction, Severe Acute Pancreatitis

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 简介

急性胰腺炎(Acute Pancreatitis, AP)是一种因胰酶异常激活、胰腺局部炎症反应为主要表现的临床常见的急腹症，其中部分可进展为重症急性胰腺炎，并引起一系列严重的全身炎症反应，甚至威胁生命 [1] 。肠粘膜屏障是一种选择性渗透屏障，其包括了生物屏障、机械屏障及肠粘膜相关淋巴组织等，肠粘膜屏障既能保证营养物质的吸收，又能防止抗原微生物、毒素等透过肠腔进入血液循环 [2] 。既往的研究表明，SAP常引起肠屏障的损伤并恶化疾病的预后，因此关注肠粘膜屏障功能的变化对于重症急性胰腺炎的治疗有重要作用 [3] 。

紧密连接蛋白(TJ)是肠机械屏障的重要组成部分，其由多种跨膜蛋白构成，如ZO-1、occludin、claudin-1等，其结构常位于相邻的上皮细胞之间，从而封闭细胞间隙，限制肠内有害物质的移动并允许营养物质的吸收 [4] [5] 。一旦TJ结构出现损伤，肠屏障功能也随之下降，从而可能导致细菌移位、出血甚至是脓毒血症等一系列严重并发症 [6] [7] [8] 。肠粘膜屏障功能损伤涉及多种机制，其中氧化应激损伤是其中重要的一部分 [9] 。近年来的研究表明，活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)是其中重要的作用因子，ROS可导致肠粘膜结构和功能障碍，加重炎症反应并进一步损伤肠粘膜屏障 [10] 。

清营汤有清热解毒、活血化瘀之功效，其以犀角为君药(现用水牛角)，水牛角咸寒，其气清灵透发，寒而不過，清营凉血解毒，且能散瘀。三甘寒，清营凉血滋阳；玄参威寒，滋阴清热解毒：麦冬甘寒，养阴生津清热。三味相合助君药清营凉血解毒，为豆药。银花、连翘清热解森，轻宣透邪，使营分之热转出气解，此即叶天士所谓“人营犹可透热转气”之理诸药相合，共奏清营污热解毒、透热养阴活血之功，以清污营分热毒为中心，佐以养明生津、透热转气、活血散瘀 [11] [12] 。祖国医学认为，SAP的发生和发展主要因饮食不调、外感湿热毒瘀等六淫，内伤七情，邪气侵袭，腑气不通、瘀毒内蕴，根据其病因不同，治疗方式迥异。

本研究试图探究清营汤这一重要方剂在重症急性胰腺炎中的作用，与传统生长抑素制剂相比，中医药有性温和，多靶点等优势，对于SAP继发的肠屏障损伤可起到多方面的调节作用，为临床工作以及中医药的发展提供新的思路和可能性。

2. 材料和方法

2.1. 动物和模型

本研究经青岛大学(中国青岛)动物伦理与实验委员会批准，按照美国国立卫生研宄院(National Institutes of Health)的实验动物指南进行。SPF级Wistar成年雄性大鼠24只，8周龄，体重200~250 g，由青岛大学动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组(SO)、SAP组(SAP)和清营汤治疗组(QYT)。用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，沿腹白线开放大鼠腹腔。直视下将套管针逆行插入胰胆管，然后将套管针穿入肝脏方向，用SK-5001微输液泵逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液(Signa) (1 ml/kg，0.02 ml/min)，建立SAP模型。根据前期研究发现，SAP大鼠损伤在24 h时最为严重，故本实验中所有大鼠均在建模后24 h取样 [13] 。SO组胰胆管逆行注射等量生理盐水，清营汤组成及制备：水牛角30 g，生地黄15 g，元参9 g，竹叶必3 g，麦冬9 g，丹参6 g，黄连6 g，银花9 g，连翘6 g，中药材均购自青岛市中医医院中药房。药材加水比例1:9，药材浸泡时间1 h，煮沸时间30 min；药渣加水比例1:3，煮沸时间20 min，过滤后将两次煎液合并，用双层纱布过滤后，加热蒸发浓缩滤液至1 g/mL。QYT组自建模前3天开始，按1 ml/100g体重给予浓缩滤液灌胃，共治疗4次。

2.2. 样本收集

SAP模型建立后24 h取样。按原切口打开大鼠腹腔，穿刺下腔静脉取血液标本，血样于4℃下离心5 min (3000 RPM)，收集上清液进行分析。取末端回肠组织，部分标本用4%多聚甲醛固定。其余保存在−80℃冰箱中。

2.3. 血清检测

采用Olympus全自动生化分析仪检测血清脂肪酶(LIPA)和淀粉酶(AMY)活性；采用标准ELISA试剂盒(南京建成生物技术公司)检测血清肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-10 (IL-10)水平。采用EKT-5M革兰阴性菌动态检测试剂盒(北京金山春生物技术公司)检测血清内毒素浓度。采用二胺氧化酶(DAO) ELISA试剂盒测定DAO水平(南京建成生物技术公司)。

2.4. 氧化应激指标测定

采用试剂盒检测回肠中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用活性氧测定试剂盒(Solarbio)测定肠黏膜ROS含量。

2.5. 组织病理学评估

取回肠末端组织，石蜡包埋，5 μm切片，苏木精–伊红(HE)染色，光镜下进行组织学分析。

2.6. Western-Blot

采用BCA蛋白检测试剂盒(Transgen)检测回肠总蛋白。用ZO-l (Affinity)、Occludin (Affinity)、Claudin-1 (Affinity)、二抗(Bioeasy BE0101)进行Western-Blot检测。以β-actin蛋白(ABways)作为对照。采用Image J软件((Media Cybernetics, Rockville, MD, USA))分析灰度值。

2.7. 统计学分析

采用GraphPad Prism8.0软件(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)进行统计学分析。定量资料以均数士标准差(SD)表示。组间变量比较采用t检验、单因素方差分析、Tukery检验。计数资料采用χ2检验。以p < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. SAP大鼠肠屏障损伤模型的建立

如前所述SAP模型在建立后24 h达到峰值，故于此时采样以达到最理想的效果。如图1所示，血清的损伤指标显示SAP组指标明显高于SO组(图1；p < 0.01)。与SO组相比，SAP组出现了如水肿、出血、绒毛、黏膜细胞坏死等典型的肠道损伤(图2)，这些现象表明我们成功建立了SAP诱导的肠屏障损伤模型。

3.2. 肠粘膜氧化应激

取回肠末端组织，检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)，以确定肠粘膜中发生氧化应激损伤的程度。与SO组相比，SAP组大鼠GSH、SOD指标明显降低，ROS、MDA指标明显升高(图3，p < 0.05)，提示SAP大鼠模型中，回肠组织存在严重的氧化应激损伤。

血清淀粉酶(a)、脂肪酶(b)活性，内毒素(c)、TNF-α (d)、DAO (e)在SAP组中水平显著高于SO组。与SAP组相比，QYT组血清淀粉酶(a)、脂肪酶(b)活性，内毒素(c)、TNF-α (d)、DAO (e)水平降低。以平均值 ± 标准差(n = 8)表示。与SO组比较，*p < 0.05和*p < 0.01；与SAP组比较#p < 0.05和##p < 0.01。

Figure 1. Changes in serum inflammatory markers

图1. 血清炎症指标的变化

与SO组相比，SAP组出现了如水肿、出血、绒毛、黏膜细胞坏死等典型的肠道损伤，同时QYT组的图像显示这一现象被逆转。

Figure 2. Intestinal mucosal injury

图2. 肠粘膜损伤

与SO组相比，SAP组SOD活性和GSH含量降低，MDA和ROS指标升高。与SAP组比较，QYT组SOD、GSH明显升高，MDA、ROS明显降低。以平均值 ± 标准差(n = 8)表示。与SO组比较，*p < 0.05和*p < 0.01；与SAP组比较#p < 0.05和##p < 0.01。

Figure 3. GSH (a), GSH (b), SOD (c), ROS (d) contents in terminal ileal tissue

图3. 末端回肠组织中GSH (a)、GSH (b)、SOD (c)、ROS (d)含量

3.3. 清营汤可改善SAP大鼠症状

清营汤在《温病条辨》中被记载，有着养阴透热、清营养阴，使营分之邪热转出气分而解，为治疗营分证之主方。对营分证疾病研究的深入，热盛阴虚病机进一步被阐明，并在临床新药研究及治疗方面取得很大发展。按照前期实验设计，给予大鼠清营汤浓缩液灌胃治疗，结果表明与SAP组相比，应用清营汤可大鼠血清炎症指标更低(图1，p < 0.05)。同时观察大鼠病理检测的结果，与SAP组相比，QYT组大鼠肠粘膜及胰腺损伤减轻。

3.4. 清营汤可减轻肠道氧化应激水平

与SAP组相比，QYT组末端回肠肠粘膜组织中GSH、SOD水平明显上升，同时ROS、MDA等损伤指标降低(图3，p < 0.05)，提示应用清营汤治疗可减轻SAP大鼠肠粘膜氧化应激水平，保护肠屏障。

3.5. 清营汤可保护肠道TJ蛋白，减轻SAP大鼠肠屏障损伤

TJ蛋白在维持肠黏膜屏障的正常生理功能中发挥着重要作用，为了进一步确定清营汤对肠粘膜屏障的保护作用，我们采用Western-Blot技术检测末端回肠TJ蛋白的表达，结果表明，SAP组Occludin、Claudin-1、ZO-1的表达低于QYT组(图4，p < 0.05)。同时，与SAP组相比，QYT组大鼠血清内毒素指标降低，也从侧面证实了肠屏障功能的恢复(图1，p < 0.05)。

Western-blot检测回肠TJ蛋白印迹、ZO-1、occludin、claudin-1的表达水平。数据以均数 ± 标准差(n = 8)表示。与SO组相比*p < 0.05和*p < 0.01；与SAP组比较#p < 0.05，## < 0.01。

Figure 4. Expression level of TJ protein

图4. TJ蛋白表达水平

综上所述，我们的这项实验证实了服用清营汤治疗可减轻SAP大鼠肠粘膜氧化应激水平，提高TJ蛋白的表达从而保护肠粘膜机械屏障。

4. 讨论

清营汤治疗重症急性胰腺炎在临床中早有报道及应用 [14] [15] 。在我们的实验中首次关注到其对肠粘膜屏障的保护作用以及对氧化应激的抑制作用。与SAP组相比，QYT组大鼠各项血清炎症指标下降，通过观察大鼠末端回肠GSH、MDA、ROS及SOD水平，证实清营汤可减轻SAP大鼠末端回肠的氧化应激反应，这些证据为清营汤的发展和应用提供了新的思路。

SAP是一种严重的、迅速进展的急腹症，同时SAP可造成肠屏障功能的损伤，从而继发SIRS、ALI等一系列严重并发症，病死率高达10%~30% [16] 。研究表明，氧化应激对于SAP大鼠的肠屏障功能损伤尤为重要 [17] 。本实验采用成熟的SAP大鼠模型，探讨清营汤这一传统中药方剂对于肠屏障功能的保护作用。

在正常生理条件下，肠道屏障在维持肠道渗透压和限制细菌移位方面发挥着重要作用 [18] 。肠道屏障功能主要由上皮细胞及其胞间TJ蛋白维持，共同维持肠道生态稳定，大量的临床和实验数据表明，SAP的全身反应可能与肠屏障损伤有关 [19] 。

血淀粉酶、脂肪酶是SAP常用的判断指标，TNF-α、IL-6则与SAP预后相关 [20] 。服用清营汤后，SAP大鼠相关指标降低。ROS是正常的细胞代谢副产物，生理剂量下ROS是有益的，但是过量的ROS会导致氧化应激损伤 [21] 。在本实验中，ROS的表达程度与TJ蛋白损伤严重程度程正相关。

古籍中有关“胰”的记载很少，后代医家根据临床腹痛、腹胀、恶心、呕吐、发热等症状，将其归属于中医“腹痛”“胰瘅”“胃心痛”“脾心痛”等范畴。中医认为“不通则痛”“不容则痛”是其根本原因 [22] 。胰腺病位主要在脾、胃、肝、胆，其病因主要为饮食不节、情志不畅、劳逸失常等，加之外感六淫化热入里、湿热蕴结，热结伤阴，导致营阴亏损而发病 [23] 。

清营汤为著名医家吴瑭先生《温病条辨》中的传世方剂，其有清热解毒、活血化瘀、养阴补虚之功，与胰腺炎中药治疗方案切合，其中水牛角清灵解疫，黄连清热燥湿，同时生地黄、元参清热兼滋肾补水，自清代以来，该方常用于感染类疾病 [24] 。

综上所述，本实验证实了清营汤对SAP大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用，肠屏障功能损伤机制复杂，涉及大量的通路，相关方面的研究一直在不断进行，氧化应激只是其中一小部分。清营汤作为祖国医学的重要传世方剂，其应用及相关研究有望进一步发展。

文章引用

高照宇,李医铭,姜英健,李洪波,王 江,张佃良. 清营汤可减轻SAP大鼠肠屏障氧化应激损伤
Qingyingtang Can Reduce Oxidative Stress Injury of Intestinal Barrier in SAP Rats[J]. 临床医学进展, 2023, 13(03): 3596-3603. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.133515

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缩写

SAP：重症急性胰腺炎

ROS：活性氧

TJ：紧密连接蛋白

TNF-α：肿瘤坏死因子-α

IL-6：白介素-6

GSH：谷胱甘肽

DAO：二胺氧化酶

MDA：丙二醛

SOD：超氧化物歧化酶

AMY：淀粉酶

LIPA：脂肪酶

NOTES

*通讯作者。

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