 Asian Case Reports in Vascular Medicine 亚洲心脑血管病例研究, 2013, 2, 17-20 http://dx.doi.org/10.12677/acrvm.2013.23004 Published Online August 2013 (http://www.hanspub.org/journal/acrvm.html) Differences of Myocardial Tissue Gene Expression of Diabetic Rats and the Effect of Melatonin Ming Liu1, Yongquan Shi1, Zhimin Liu1, Ling Peng2, Junjie Zou1 1Department of Endocrinology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 2International Joint Cancer Institute, Second Military Medical University, Shanghai Email: zmliu_cz@hotmail.com Received: Jul. 9th, 2013; revised: Jul. 20th, 2013; accepted: Jul. 27th, 2013 Copyright © 2013 Ming Liu et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Aim: To investigate the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy. The differences of myocardial tissue gene expressions among diabetic group, control group, and high dose melatonin group were compared by using rat ge- nome-wide spectrum illumina beads chip. Methods: Divide 12 SD rats into 3 groups, control group, streptozotocin (STZ) induced diabetic group, and diabetic and melatonin group. Extract mRNA from the myocardial tissue, transcript it into cDNA, hybridize the cDNA with gene chips, and then statistically analyze the results of gene chip scanning. Re- sults: Compared with the control group, the protein metabolism related gene expression significantly downregulated while apoptosis relevant gene expression upregulated in diabetic rats. Compared with the diabetic group, glucose and protein metabolism related genes expression in high dose melatonin group significantly increased while apoptosis and oxidative stress genes decreased in melatonin group. Conclusion: The results of gene chip analysis showed that glucose and protein metabolism, oxidative stress and apoptosis played important roles in the pathogenesis of diabetic cardio- myopathy. Keywords: Diabetes; Rat; Gene Microarray; Melatonin; Apoptosis; Oxidative Stress 糖尿病大鼠心肌组织基因表达谱的改变及 大剂量褪黑素的干预研究 刘 明1，石勇铨 1，刘志民 1，彭 玲2，邹俊杰1 1第二军医大学长征医院内分泌科，上海 2第二军医大学国际合作肿瘤研究所，上海 Email: zmliu_cz@hotmail.com 收稿日期：2013 年7月9日；修回日期：2013 年7月20 日；录用日期：2013 年7月27 日 摘 要：目的：比较糖尿病大鼠与正常对照组和大剂量褪黑素组心肌组织基因谱表达差异，探讨糖尿病心肌病 变发病机制。方法：选用 12 只SD 大鼠分3组，正常对照组，链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)诱导糖尿病组，糖 尿病 + 褪黑素组。从心肌组织抽提mRN A，逆转录为 cDNA，与基因芯片杂交。扫描芯片结果统计分析。结果： 与正常对照组相比，糖尿病组大鼠心肌蛋白代谢相关基因明显下调，凋亡相关基因明显上调；与糖尿病组相比， 大剂量褪黑素组糖及蛋白代谢相关基因明显上调，氧化应激相关基因和凋亡相关基因明显下调。结论：物质代 谢、氧化应激和凋亡在糖尿病心肌病变发病机制中可能起到重要作用。 关键词：糖尿病；大鼠；基因芯片；褪黑素；凋亡；氧化应激 Copyright © 2013 Hanspub 17  糖尿病大鼠心肌组织基因表达谱的改变及大剂量褪黑素的干预研究 Copyright © 2013 Hanspub 18 1. 引言 基因表达谱芯片可以对来源于不同个体、不同生 理病理状态、不同药物治疗手段或不同治疗阶段等的 组织细胞基因表达mRNA 水平进行检测，有助于理解 基因及其编码蛋白质的生物学功能和阐明疾病的发 病机制。本研究应用基因芯片技术研究链脲佐菌素诱 导大鼠糖尿病心肌病变后心肌组织基因表达谱变化 以及在药物干预下表达谱的改变。探讨糖尿病心肌病 变的发病机制。 2. 材料与方法 2.1. 糖尿病心肌病变动物模型建立 SPF 级健康雄性 Sprague-Dawley大鼠：共12 只， 体重 160~180 克，6周龄，购进后普通饲料适应性喂 养3天，随机分为二组：对照组(CN)4只，模型组 8 只。禁食12 小时后模型组以65 mg/kg的剂量腹腔注 射STZ (PH = 4.5 的0.1 mol/L 无菌柠檬酸盐缓冲液， 用前新鲜配制)，对照组同时腹腔注射等体积的上述缓 冲液作为对照。于注射 STZ 后第 3天，用罗氏优势型 快速血糖仪检测大鼠尾尖血，以随机血糖持续≥16.7 mmol/L 的大鼠确定为建模成功。建模成功大鼠随机 分为 2组：糖尿病组(DM)和大剂量褪黑素组(MEL)： 褪黑素 10 mg/kg/d，每日一次灌胃。12 周后麻醉放血 处死所有大鼠，取心肌组织做电镜检查，DM 组大鼠 心肌细胞肌丝排列紊乱、扭曲；线粒体出现肿胀变形， 原本平行排列的嵴成花环状排列，有些嵴断裂，基底 空化，并可见部分线粒体内出现空泡化，表明已形成 糖尿病心肌病变。 2.2. 芯片检测 Trizol 试剂提取各组大鼠心肌组织总 RNA，采用 Ambion Illumina RNA Amplification试剂盒反转录合 成cDNA。体外转录(IVT)合成cRNA，将样品与杂交 试剂混合后加入芯片，杂交舱58℃孵育 16~22 h，清 洗芯片，离心干燥，用 Illumina BeadChip Reader 读取 图像，用Illumina BeadStudio Application进行数据分 析，两样本差异分值大于20 为基因表达上调，小于 −20 为基因表达下调。 3. 结果 3.1. DM组与 CN 组比较 心肌组织差异表达 862条，上调 597 条，下调 265 条。差异分值大于 20 及小于−20 的基因共有 41 条。 一部分基因功能与名称已明确，另一部分为表达序列 标签，功能还未确定。表 1列出部分已知名称和功能 的基因及其序列号、差异分值。 与对照组相比，糖尿病组大鼠心肌组织中与蛋白 质合成相关的基因表达，如核糖体蛋白L30 及核糖体 蛋白 S9 均明显下调，可能在糖尿病心肌组织中蛋白 质合成受到抑制。同时，与凋亡相关基因泛素 D表达 较正常对照上调。 3.2. MEL组与 DM 组比较 心肌组织差异表达1263 条，上调 849 条，下调 414 条。差异分值大于20 及小于−20 的基因共有145 条。表2列出部分已知名称和功能的基因及其序列号、 差异分值。 在大剂量褪黑素组大鼠心肌组织中，核糖体蛋白 L30 及核糖体蛋白S9 基因表达较糖尿病组显著上升， 可能存在蛋白质合成的修复。与氧化应激相关基因谷 Table 1. Dominant difference of gene chips expression in myocar- dial tissue between DM and CN group 表1. 糖尿病组和正常对照组大鼠心肌部分基因差异表达谱 Genbank序列号 基因名称 差异分值 糖代谢相关 NM_19286 乙醛还原酶1 −30.2 脂代谢相关 NM_17004 酯酶2 −27.4 NM_24386 3-羟基-3-甲基-戊 二酰辅酶A分解酶 38.0 NM_138828 载脂蛋白E −20.7 蛋白质合成相关 NM_22699 核糖体蛋白L30 −84.1 NM_31108 核糖体蛋白S9 −61.5 NM_53502 AT P结合盒 −27.4 凋亡相关 NM_53299 泛素D 45.2 NM_22303 半胱天冬酶补充区域家族 −84.1  糖尿病大鼠心肌组织基因表达谱的改变及大剂量褪黑素的干预研究 Table 2. Dominant difference of gene chips expression in myocar- dial tissue between DM and high dose melatonin group 表2. 大剂量褪黑素组与糖尿病组大鼠心肌部分基因差异表达谱 Genbank序列号 基因名称 差异分值 糖代谢相关 NM_12621 6-磷酸果糖激酶-2 32.0 NM_22407 醛脱氢酶家族1 36.5 NM_53551 丙酮酸脱氢酶 242.0 脂代谢相关 NM_31315 酯酰辅酶A硫解酶 183.8 NM_53535 磷酸二酯酶1 22.1 NM_173094 3-羟基-3甲基戊 二酰辅酶A合酶2 101.9 NM_24386 3-羟基-3甲基戊 二酰辅酶A分解酶 −25.5 NM_53923 磷脂酰肌醇3激酶 192.8 蛋白质合成相关 NM_31108 核糖体蛋白S9 279.1 NM_22699 核糖体蛋白L30 269.8 氧化应激相关 NM_134349 谷胱甘肽硫转移酶 48.4 NM_138826 金属硫蛋白 −21.2 凋亡相关 NM_12749 核仁素 28.5 NM_53299 泛素D −90.0 胱甘肽硫转移酶表达较糖尿病组明显上升。但金属硫 蛋白基因表达下调。大剂量褪黑素干预后泛素 D表达 较糖尿病组明显下调。 4. 讨论 以往关于糖尿病并发症的研究汗牛充栋，但是大 多数的研究工作仅仅从 1个或几个基因、蛋白质入手， 孤立地分析其与糖尿病并发症的关系，难以从基因的 整体表达谱全面地观察 2型糖尿病发病时基因的反应 模式。基因芯片技术克服上述缺点，可以大规模、高 通量、高效地进行成千上万基因在各种生理和病理状 态下表达状况的研究以及分析大量的生物信息。 糖尿病心肌病变是由 Rubler 于1972 年首先提出， 研究证实，糖尿病心肌病变是一种独立的糖尿病慢性 并发症，病理基础是心肌内微血管病变[1]，它是一种 特异性心肌病，其发生与冠状动脉供血障碍无关。高 血糖是糖尿病最基础的特征，此基础上通过多元醇旁 路、蛋白激酶 C激活、糖基化终末产物增多及氧化应 激作用增强和各类细胞因子产生而致全身广泛的微 血管病变。目前认为这些机制均与糖尿病心肌病变发 病有关。 与蛋白质合成相关基因核糖体蛋白L30 及核糖体 蛋白 S9 在糖尿病大鼠心肌组织表达均明显下调，说 明在糖尿病时心肌组织存在负氮平衡[2]。在大剂量褪 黑素组大鼠心肌组织中，核糖体蛋白L30 及核糖体蛋 白S9 表达较糖尿病组明显上升。在大剂量褪黑素组 和对照组之间，这两种基因表达差异不显著，说明药 物干预后心肌组织的蛋白质代谢紊乱得到一定程度 纠正。 氧化应激机制在糖尿病并发症中的地位越来越 受到人们的关注[3]。心肌组织自身的抗氧化酶保护系 统薄弱，同时代谢旺盛易受自由基攻击，这都给糖尿 病心肌病变打下基础。此外，ROS 还可直接攻击膜中 的多价不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，形成过氧化 产物，过氧化物可以氧化修饰糖基化的低密度脂蛋白 (LDL)，导致体内 ox-LDL的含量明显增加，进一步加 重心肌损害。谷胱甘肽硫转移酶(GST) 是抗氧化防御 机制中的重要的抗氧化酶，GST 是谷胱甘肽(G SH)代 谢中的重要酶，它可以催化氧化应激引起的脂质过氧 化损伤产生的各种有毒代谢产物与GSH的巯基共价 结合，防止脂质过氧化引起的损伤，具有清除体内过 氧化物及解毒的双重功能[4]。本实验发现大剂量褪黑 素组大鼠心肌组织中谷胱甘肽硫转移酶表达较糖尿 病组明显上升，说明大剂量褪黑素可能通过GST 发挥 抗氧化应激作用，保护心肌组织。有趣的是，大剂量 褪黑素干预下，金属硫蛋白的基因表达下调。褪黑素 和金属硫蛋白均有抗氧化应激作用，可能在大剂量褪 黑素的作用下，金属硫蛋白的基因表达受到抑制。本 课题组发现金属硫蛋白通过抑制凋亡以及抗氧化应 激，对糖尿病心肌病变有明确保护作用(未发表)。 泛素是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多 肽链，在蛋白质降解过程中，泛素的枢纽作用越来越 得到研究者的重视[5]。Ub-26s 蛋白酶体途径(ubiquitin- 26s proteasome pathway, UPP)是胞浆中一条重要的蛋 Copyright © 2013 Hanspub 19  糖尿病大鼠心肌组织基因表达谱的改变及大剂量褪黑素的干预研究 Copyright © 2013 Hanspub 20 白降解途径。近年来 UPP在凋亡中的作用受到重视， 可通过降解多种凋亡关键调控因子及调控细胞周期 进程的调节因子、转录因子来影响凋亡。本研究中发 现在糖尿病大鼠心肌组织中泛素的表达较正常对照 组明显上调，大剂量褪黑素干预后泛素表达较糖尿病 组明显下调，说明在糖尿病大鼠心肌组织中，凋亡明 显增强，药物干预后凋亡受到抑制。 在整个糖尿病及糖尿病心肌病变的过程中，某些 基因的表达可发生变化[6]，我们仅从一个时间点进行 研究，还是远远不够的。同时许多基因在功能上存在 交叉，同一基因可通过多种功能参与作用。我们的工 作为今后对糖尿病心肌病变发病机制的研究积累一 些经验，在研究方向上作多方面的探讨，将在今后工 作中继续努力，以期揭开糖尿病微血管病变的具体发 病机制。 参考文献 (References) [1] M. Hamblin, D. B. Friedman, S. Hills, et al. Alteration in the diabetic myocardial proteome coupled with increased myocar- dial oxidative stress underlies diabetic cardiomyopathy. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2007, 42(4): 884-895. [2] Y. Weng, F. Shen, J. Li, et al., Expression changes of mitogen- activated protein kinase phosphatase-1 (MKP-1) in myocardium of streptozotocin-induced diabetic rats. Experimental and Clini- cal Endocrinology & Diabetes, 2007, 115(7): 455-460. [3] H. Nie, J. L. Wu, M. Zhang, et al., Endothelial nitric oxide syn- thase-dependent tyrosine nitration of prostacyclin synthase in diabetes in vivo. Diabetes, 2006, 55(11): 3133-3141. [4] J. W. Hartog, A. A. Voors, S. J. Bakker, et al., Advanced glyca- tion end-products (AGEs) and heart failure: Pathophysiology and clinical implications. European Journal of Heart Failure, 2007, 9(12): 1146-1155. [5] R. Marfella, C. Di Filippo, M. Portoghese, et al., The ubiquitin- proteasome system contributes to the inflammatory injury in is- chemic diabetic myocardium: The role of glycemic control. Car- diovascular Pathology, 2009, 18(6): 332-345. [6] H. Miyazaki, N. Oka, A. Koga, et al., Comparison of gene ex- pression profiling in pressure and volume overload-induced myocardial hypertrophies in rats. Hypertension Research, 2006, 29(12): 1029-1045. |