 Bioprocess 生物过程, 2013, 3, 23-28 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2013.33004 Published Online September 2013 (http://www.hanspub.org/journal/bp.html) Molecular Biology Technology and Its Application in Soil Microbial Diversity* Wanju Cao1, Xin Sui2,3#, Shijie Han2, Yun W ang4, Jingong Li4, Jie Wang4 1Baihe Forestry Bureau of Jilin Province, Baihe 2Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 4Nature Reserve Management Center of Chaingbai Mountains in Jilin Province, Baihe Email: bhlyjcwj@163.com, #xinsui117@sina.cn Received: Jul. 5th, 2013; revised: Jul. 15th, 2013; accepted: Jul. 30th, 2013 Copyright © 2013 Wanju Cao et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Microorganism plays a key role in ecosystem, the structure and function of microbial diversity, to a certain extent, reflects the status of ecosystem. It is unilateral to study microorganism with traditional cultural method, which could not reflect the real situation of microorganism in ecosystem. Recently, the molecular biology technology breaks the limitation of traditional cultural method and tremendously promotes the development of microbiology and ecology. So, this paper introduces several molecular biology methods which are applied in microbial diversity research. Keywords: Microbial Diversity; Research Method; Molecular Biology; Ecosystems 分子生物学技术在土壤微生物多样性中的应用* 曹万举 1，隋 心2,3#，韩士杰 2, 王 云4，李金功 4，王 洁4 1吉林省白河林业局，白河 2中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳 3中国科学院大学，北京 4吉林省长白山自然保护管理中心，白河 Email: bhlyjcwj@163.com, #xinsui117@sina.cn 收稿日期：2013 年7月5日；修回日期：2013 年7月15 日；录用日期：2013 年7月30 日 摘 要：微生物在生态系统中占据着很重要的作用，其结构和功能的多样性及变化在一定程度上反映了生态系 统的基本状态。传统的微生物培养和鉴定方法得到的微生物信息很片面，不足以代表微生物在生态系统中的真 实情况。近几十年发展起来的分子生物技术突破了传统方法的限制，极大地促进了微生物学和生态学的发展。 本文介绍了现在常用的几种分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用现状。 关键词：微生物多样性；研究方法；分子生物学；生态系统 1. 引言 土壤微生物包括从原核到真核的不同类群的生 物，主要有：真菌、细菌、放线菌、原生动物、藻类 和病毒，是生物多样性的重要组成部分。土壤微生物 是土壤生态系统中最活跃的部分，是生态系统养分的 源和汇，在凋落物的分解、养分循环与平衡、土壤理 *基金项目：国家重点基础研究发展计划 973 项目(2011CB403200) 和国家自然科学基金(40930107)资助。 #通讯作者。 化性质改善中起着重要的作用，一个高质量的土壤应 Copyright © 2013 Hanspub 23  分子生物学技术在土壤微生物多样性中的应用 该具有良好的生物活性和稳定的微生物种群组成[1,2]。 过去，传统的方法是利用选择性的平板培养基来 分离环境样品中的可培养的微生物，然后使用显微镜 观察分离微生物形态、数目以及一些生理生化指标来 反映微生物的种类多少，此方法廉价而快速，可以提 供活的、不同生活类型的种群信息，特别是在水环境 样品中，利用这种方法已分离了一些具有一定功能的 特殊目标物种，获得许多很有应用价值的微生物种 类。这种方法操作简单，但是由于这种方法人为限定 了一些培养条件，无法全面模拟微生物生长的自然条 件，常常造成选择性地富集一些微生物，而不能获得 另一些微生物，导致了自然界中的绝大多数微生物仍 然不能通过传统微生物培养方法被人们所认识。因此 应用传统的研究方法反映的微生物信息较少，大量有 应用价值的微生物信息无法获得。所以，现在传统培 养方法只能作为一种辅助手段，常与与其他先进方法 联合起来应用，这样才能较为客观而全面地反映环境 样品微生物群落组成和结构的真实信息。 2. 几种常见的分子生物学方法 近年来，许多以分子生物学技术为基础的方法应 用到土壤微生物多样性的研究中。促进了人们对土壤 微生物群落组成以及功能的了解。这些方法包括变性 梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)、末端限制性片段长度多态性 分析(Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)、克隆文库、随机扩增 DNA 多态性分析 (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)、单 链 构 象多态性分析(Single strain conformation polymor- phism, SSCP)、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片 (Microarry)、稳定同位素探针(SIP)、宏基因组学、实 时荧光定量 PCR、转录基因组学技术等，为揭示土壤 中微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。 2.1. 变性梯度凝胶电泳 DGGE 是由 Fischer 等[3]1979 年首先提出的用于 检测 DNA 突变的一种电泳技术，其分辨力比琼脂糖 电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳高，是一种很常用的单碱 基突变筛查检测方法。1993 年，Muzyer 开始利用这 个技术来研究微生物的遗传多样性，目前该技术已被 广泛用于土壤、污泥、水体、食品、人类肠道菌群等 样品中微生物多样性分析、微生物鉴定和变异以及种 群演替等方面研究[4-7]，其在揭示自然界微生物群落遗 传多样性和种群差异方面具有一定的优越性。TGGE 是与 DGGE 相似的方法，称为温度梯度凝胶电泳技 术，近十多年来，DGGE/TGGE 技术已成为研究微生 物多样性的重要手段[8,9]。此技术可直接对提取的环境 样品总 DNA 进行微生物多样性分析，通过 PCR 扩增 微生物 16S rRNA基因或功能基因，通过聚丙烯酰胺 凝胶电泳对其产生的 DNA 片段混合物进行分离。同 样大小的 DNA 序列由于含有的 GC碱基含量不同， 各片段的 Tm 值也就不同，甚至一个碱基对的不同， 都会引起 Tm 很大的差异。DGGE/TGGE 就是应用这 种差异来区分不同的基因序列，为了使亲缘关系接近 的微生物分离，通常会使目的片段全部解链，但为了 防止单链 DNA 分子互相分离，通常会在设计引物时 加40 个左右的 GC 碱基序列(GC 夹)，这样通过 DGGE 或TGGE 分离，收集不同的 DNA 条带，再分别建立 克隆文库，进行测序，序列与基因文库中的现有序列 比较，即可确定微生物的种类[10,11]。PCR-DGGE/TGGE 技术的优点是可靠、重现性好、方便快捷，适合于大 量样品快速分析。可用于不同微生物群落之间的差异 分析，也可进行同一种微生物群落随时间和环境变化 演替规律的研究，是微生物群落遗传多样性和动态分 析的有力工具。此技术也存在一定局限性，DGGE法 只能对微生物群落中数量大于 1%的优势种群进行分 析，还不能完整地反映复杂环境中微生物的群落；对 于DNA 片段长度也有要求，最适范围为 100 bp~500 bp，其分辨率可达到 1个碱基，在 200 bp~900 bp检 测效果还好，但超出此范围的片段难以检测[12]，若电 泳条件不适宜，则不能完全保证将有序列差异的 DNA 片段分开，容易发生共迁移现象[13,14]。 2.2. 末端限制性片断长度多态性(T-RFLP) 末端限制性片断长度多态性(T-RFLP)，又称为 16S rRNA基因的末端限制性片段(Terminal Restric- tion Fragment, TRF)分析技术，具有非常广阔的应用前 景。该技术建立在 PCR的基础之上，已被成功的应用 到了菌种鉴定、微生物群落的对比分析、微生物群落 Copyright © 2013 Hanspub 24  分子生物学技术在土壤微生物多样性中的应用 多样性及结构特征分析等领域[15-18]。根据目的基因的 保守区设计通用引物，其中一个引物的 5’端用荧光物 质标记，常用的荧光物质有 HEX，TET，FAM等[19]。 提取待分析样品的总 DNA，以它为模板进行 PCR 扩 增，所得到的 PCR 产物一端就带有这种荧光标记。然 后将 PCR 产物用合适的限制性内切酶消化，一般选用 酶切位点为 4 bp的限制性内切酶。由于在不同微生物 的扩增片段内存在核甘酸序列的差异，酶切位点就会 存在差异，酶切后就会产生许多不同长度的限制性片 段。消化产物用自动测序仪(选用gene marker或gene scan 功能)进行检测，只有带有荧光标记的片段能被检 测到，而其它没有带荧光标记的片段则检测不到[20,21]。 这些末端标记的片段就可以反映微生物群落组成情 况，因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的 细菌，也就是说一种末端限制性片段至少代表一类细 菌；通过比较峰的数量、峰高、峰面积，再经一些统 计学软件分析，可知不同处理间微生物群落组成的差 异[22,23]。 2.3. 宏基因组技术 1998 年Handelman 等[24] 首次提出宏基因组 (Metagenomics)又称 元基因组、 环境基因组或 群落基 因组，是指一个群落中的不同微生物基因组的总和。 宏基因组是以功能基因筛选和序列筛选为研究手段， 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、 相互协作关系、及与环境之间的关系为研究目的的新 的微生物研究方法[25]。其直接从环境样品中提取总 DNA，通过物理方法直接破碎环境中的 DNA，获得 大片段的样品 DNA，与载体连接构建克隆文库，通过 对宏基因组文库的筛选来获得新的功能基因和生物 活性物质。宏基因组文库既包括了可培养的，又包括 了未培养的微生物遗传信息，因此增加了获得新生物 活性物质的机会[26-28]。其主要流程首先是环境样品及 目的基因组富集，目前预富集技术主要分为基因组水 平和细胞水平富集富集，基因组水平富集常用的技术 为稳定同位素探针技术(SIP)，细胞水平富集主要是通 过利用选择培养基对目的微生物进行富集培养，如底 物选择、物理化学指标选择等，为了避免富集培养选 择性地富集了快速生长特性的菌群，丧失物种多样性 信息，现也常通过先在严格胁迫条件下短期处理，然 后改为较温和的处理条件，来克服这种方法的局限 性。其次是宏基因组 DNA 的提取，获得高质量的环 境样品总 DNA，这是后续分析的基础，也是宏基因文 库构建的关键步骤。第三，宏基因组文库的构建，根 据DNA 提取质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌 及筛选方法选择合适的载体系统，常用的载体有质 粒、黏粒和细菌人工染色体等[29]。早期宏基因组文库 主要以质粒载体为主，一般用于克隆小于 10 kb的 DNA 片段，适用于单基因的克隆与表达。然而，很多 时候，微生物的活性物质是大片段的 DNA，所以插入 大片段的 DNA 以获得完整的基因组文库是很有必要 的，目前，已经有可以插入 30 kb~40 kb外源DNA 的 Cosmid 文库和 Fosmid 文库，细菌人工染色体插入片 段可达 350 kb，可用来制备由多基因簇调控微生物活 性物质的完整代谢途径的相关片段文库[30]。第四，宏 基因组文库筛选，由于宏基因组文库容量较大，最近 的生物信息学的研究表明，如果对于一个插入子(<10 kb)的文库，为寻找一个目的基因需要筛选 105~106个 克隆，这表明从复杂的宏基因组中筛选目的基因一直 是宏基因组学技术中的瓶颈。近年来，各种宏基因组 文库筛选方法相继建立起来，根据筛选原理大体分为 两大类：序列依赖性筛选法和非序列依赖性筛选法 [31]。 2.4. 稳定性同位素探测技术(Stable Isotope Probing, SIP)分析技术 稳定性同位素探测技术(Stable Isotope Probing, SIP)是由稳定性同位素标记技术同分子生物学技术相 结合而发展起来的，其优势在于除了对环境中微生物 群落组成进行遗传分类学鉴定外，还可以确定其在环 境过程中的功能，如可以提供复杂群落中微生物相互 作用及其代谢功能的相关信息，避免了实验室培养而 直接原位探测微生物的种类和功能，是一个很有应用 前景的方法[32-34]。其基本原理是运用稳定同位素标记 目标化合物，追踪该化合物在环境样品中的行为，并 用于表征该化合物在环境中发生的各种生物和非生 物反应，通常情况下，为了研究参与该化合物代谢的 环境样品中的微生物，将原位的环境样品暴露于稳定 同位素标记目标化合物的基质中，如果环境样品中存 在的某些微生物能够以基质中的稳定性同位素标记 Copyright © 2013 Hanspub 25  分子生物学技术在土壤微生物多样性中的应用 目标化合物为碳源或氮源进行物质代谢，那么基质中 的稳定性同位素便会被吸收并同化进入微生物体内， 参与各类物质如核酸(DNA和RNA)及磷脂脂肪酸 (PLFA)等的生物合成，通过提取、分离、纯化、分析 这些微生物体内稳定性同位素标记的生物标志物，就 可以将微生物的组成与其功能联系起来[35-37]。此技术 为测定微生物底物利用和功能研究提供了强有力的 手段，对于研究植物与土壤生态系统物质流对根际微 生物群落结构和功能的影响方面也大有用途，例如根 际碳流是土壤微生物生物多样性的主要驱动力，Lu 等用此技术测定了水稻根系的产甲烷古生菌和产乙 酸细菌群落[38]。目前此技术已经应用于探测有机污染 物的生物分解，如在研究环境样品中具有降解菲能力 的微生物时，首先向受试环境供应13C标记底物，在 降解和利用 13C标记的菲时，其子代 DNA 链骨架中 必然出现 13C，然后从环境提取核酸，用超速离心将 核酸分成重核酸(13C标记)和轻核酸(非13C标记)两部 分。用分子生态技术分析13C标记和非标记的核酸， 用系统发育分析方法确定“活跃”和“非活跃”微生 物的种类，进而可以直接对具有菲降解能力的微生物 的DNA 进行分子生物学方面的研究，确定其分类发 育地位等等[39]。SIP 技术存在的主要问题是在培养过 程中可能存在交叉取食的风险，即目标微生物死体的 分解而使 13C通过取食转移到其它微生物体内，现在 大多数 SIP 是在实验室条件下人为设置的微宇宙中进 行的，因此并不能完全代表微生物生长的实际环境条 件[40]。 2.5. 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交(FISH)是用带有荧光标记的特异核 酸探针与细胞内相应的靶 DNA或RNA 分子杂交，然 后应用荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪(ConfocalLaser Scanning Microscope, CLSM)来观察荧光信号，确定结 合了荧光探针的 DNA或RNA分子在染色体或其它细 胞器中的位置，同时也可以观察与特异探针杂交后被 染色的细胞或细胞器的形态和分布。可以应用此技术 来研究微生物群落结构的特征，并实时跟踪微生物种 群的动态变化，也可以了解不同功能菌群间的相互作 用[41-43]。如利用 FISH 技术监测了河流中微生物群落 的动态变化，获知了一些在人工条件下很难培养的菌 种以及一些新的微生物信息[44]。应用CLSM-FISH 研 究了厌氧反应器的生物膜中的乙酸氧化细菌、脱硫微 菌属、产甲烷细菌、硫酸盐还原细菌的分布情况[45]。 当然 FISH 技术也存在一些的问题，容易出现假阳性 或者假阴性，许多微生物有自身荧光，如霉菌、酵母 菌、假单胞菌属、军团菌属、蓝细菌属和古细菌等均 存在荧光特性，这样会导致检测的假阳性；FISH检测 的精确性和可靠性主要依赖于寡核苷酸探针的特异 性，因此探针的设计和评价十分重要，若设计上缺乏 特异性，也会导致检测的假阳性。同样，有时也会出 现假阴性，这主要是因为细胞壁的结构影响探针的穿 透力，可能导致杂交信号强度降低，尤其是革兰氏阳 性菌，为提高探针的渗透力，必须进行特殊的固定和 前处理，相对而言，革兰氏阴性菌通透性较好，即使 是多聚核苷酸探针也能很好的穿透到细胞内。此外 rRNA 形成的三维结构及其在细胞中的含量等也会影 响到探针杂交的准确性[46]。 2.6. 实时定量PCR 技术 实时定量 PCR，指在 PCR 反应体系中加入荧光 基团，利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR 进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法， 可以实时监测基因的表达量[47]。常用的实时定量 PCR 方法有两种：一种是荧光染料法，常用的染料为 SYBR Green I，它是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染 料，在 PCR反应体系中，染料掺入 DNA双链后，发 射荧光信号，否则不发光，保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。另一种应用较多的是 TaqMan 探针技术，探针两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团，5’端荧光基团吸收能量后 将能量转移给临近的 3’端荧光淬灭基团，因此探针完 整时，检测不到该探针 5’端荧光基团发出的荧光。PCR 扩增时，Taq 酶的 5-3’外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测 系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就 有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，目前此技术已在很多领域有广泛 应用。 上述一些微生物生态学技术让人们发现了许多 以前人们未发现的新的微生物种属，然而这些技术都 Copyright © 2013 Hanspub 26  分子生物学技术在土壤微生物多样性中的应用 是从 DNA 水平来研究微生物的群落，无法洞察活动 的微生物情况，以及活性功能基因的表达量，转录组 学技术从转录水平上研究基因的表达[48]，可以用此方 法研究土壤中参与物质代谢活动的微生物，转录基因 组学的应用会让我们更加深入地了解环境中的微生 物。 3. 展望 本文介绍一些常用的土壤微生物研究的分子生 物学方法，但是不同的方法在获取土壤微生物多样性 信息方面各有优劣势，因此在实际应用中，常常采用 多种方法想结合，互相补充，避免使用单一方法所带 来的偏差，尽可能的从多角度对土壤微生物进行分析 和研究。 4. 致谢 本文章由国家重点基础研究发展计划973 项目 (2011CB40320 0)资助和国家自然科学基金(40930107) 资助。 参考文献 (References) [1] 孙波, 赵其国. 土壤质量与持续环境: Ⅲ. 土壤质量评价的生 物学指标[J]. 土壤, 1997, 29(5): 225-234. 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