 Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2013, 3, 9-14 http://dx.doi.org/10.12677/aac.2013.32003 Published Online May 2013 (http://www.hanspub.org/journal/aac.html) Research Progress in Development of the Determination Methods of Vitamine C in Food and Pharmaceuticals* Hongliang Zhu1, Huofeng Dai1, Kairun Wang1, Tupeng Yao1, Yun Zhang1,2, Haoyu Shen1# 1Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 2Quzhou Center for Disease Control and Prevention, Quzhou Email: #hyshen@nit.zju.edu.cn Received: Jul. 16th, 2013; revised: Jul. 20th, 2013; accepted: Aug. 1st, 2013 Copyright © 2013 Hongliang Zhu et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Vitamin C is necessary to the growth and metabolism for human beings. Vitamin C is mainly from fruits, vege- tables and medicine, so it is one of the important standards to evaluate the quality of the food nutrition and medicine. With the growing concern of food safety, the quantitative analysis of vitamin C in food nutrition and pharmaceuticals has at- tracted more and more attention. In recent years, determination techniques of vitamin C in food and pharma- ceuticals have been developed rapidly, including titrimetric method, spectrophotometric method, electrochemical me- thod, chemilumi- nescence method, flow injection analysis, liquid chromatography and indirect atomic adsorption me- thods, etc. In this work, some principles, characteristic and the recent progress of reported methods have been summarized and compared. Keywords: Vitamin C; Food and Pharmaceuticals; Determination Method; Review 食品与药品中维生素 C含量的检测方法进展* 朱宏亮 1，戴火锋 1，汪凯闰 1，姚屠鹏 1，张 蕴1,2，沈昊宇 1# 1浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，宁波 2衢州市疾病预防控制中心，衢州 Email: #hyshen@nit.zju.edu.cn 收稿日期：2013 年7月16 日；修回日期：2013 年7月20 日；录用日期：2013 年8月1日 摘 要：维生素 C是人体不可缺少的营养物质之一，人体主要通过新鲜水果、蔬菜或药片来获取或补充维生素 C。因此维生素 C的含量成为评价食品营养价值和药品质量的重要标准之一。随着对食品安全的日益关心，食 品营养中维生素 C和医药品的定量分析已经吸引了越来越多的关注。近年来食品与药品中维生素 C的检测方法 发展较为迅速，主要有滴定分析法、光度法、电化学法、化学发光法、流动注射法、液相色谱法以及原子吸收 间接法等。本文对比总结了这些方法的原理、特点以及应用范围，讨论了方法的优缺点，以期为选择合适的检 测方法提供一定的参考。 关键词：维生素 C；食品与药品；检测方法；综述 1. 引言 维生素 C又称抗坏血酸，其结构式如图 1所示， 是一种重要的水溶性维生素，作为一种抗氧化剂和自 由基清除剂，能够缓解多种疾病的氧化应激，与生命 活动密切相关，具有极其重要的生理功能[1]。维生素 C在人体内不能合成，因此必须从食品中摄取，其中 水果和蔬菜是人体维生素 C的主要来源[2]。中国营养 *本文得到浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划 2012)项 目和浙江大学宁波理工学院教研教改项目(NITJY-201021, NITJY- 201217)的资助，特此感谢。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 9  食品与药品中维生素 C含量的检测方法进展 OO OH HO HO HO H Figure 1. The structural formula of vitamin C 图1. 维生素 C的结构式 学会推荐的每日膳食营养素供给量(RDAs) 中婴儿(初 生~12 个月)维生素 C的摄取量为 30 mg/天，儿童(1~12 岁)为40~50 mg/天，12 岁以上及成年人为 60 mg/天[3]。 人体如果缺乏维生素 C将引起疾病的发生，甚至导致 坏血病、心脏及肝脏损伤等疾病。由于维生素 C的性 质不稳定，在氧气、金属离子(如Cu2+、Ag+、Fe3+)存 在下以及碱性、高温等条件下，很容易被氧化[1,4]，不 能确保维生素 C的含量恒定。因此，测定食品中维生 素C的含量对人们日常通过膳食补充维生素 C具有科 学的指导意义[3-5]。近年来，随着人们对食品安全问题 的日益关注，维生素 C的定量分析在食品营养分析与 药物分析中越来越受到人们的重视。 文献报道的食品与药品中维生素 C的检测方法主 要包括滴定分析法[6-8]、光 度 法[6,9-12]、电化学法[6,13-16]、 化学发光法[6,17] 、流动注射法[18,19] 、液相色谱法 (HPLC)[6,20-27]以及原子吸收间接法(AAS)[6,28-30]等。表 1中汇总了已报道的主要检测方法。以下对几种常见 的检测方法进行简要的叙述。 2. 维生素 C的测定方法 2.1. 滴定分析法 采用滴定法测定维生素 C的原理主要是利用维生 素C的氧化还原性质，通过化学反应，选择合适的指 示剂，根据样品溶液颜色的变化判定终点。常见的方 法有 2,6-二氯吲哚酚滴定法(又称染料法)[7]和碘量法[8] 等。其中 2,6-二氯吲哚酚滴定法的基本原理是：在酸 性环境中，红色的 2,6-二氯吲哚酚与维生素 C反应被 还原为无色的酚亚胺，以 2,6-二氯吲哚酚染料为滴定 剂，用滴定剂自身的颜色变化指示终点，当溶液中的 维生素 C刚好被全部氧化时，溶液呈浅红色 30 s 内不 褪色，即为滴定终点，其反应式如图 2所示。滴定分 析法快速、准确、方便，可用于测定水果中少量的维 生素 C。但当样品中含有 Fe(II)、Sn(II)、Cu(I) 、SO2、 S2O3 2−等离子和富含丹宁酸、甜菜苷时，由于这些物 质本身也有还原性，也会与氧化剂发生氧化还原反 应，而使测定结果不准确。因此滴定分析法往往只适 用于测定不含 L-脱氢抗坏血酸(DHA)、花青素含量较 低及不含还原性离子的样品[31]。 2.2. 光度法 光度法测定样品中维生素 C含量的原理大多利用 显色剂与维生素 C发生的氧化还原反应，通过测定溶 液的吸光度建立标准曲线来测定样品维生素 C的含量 [32]。然而，由于总抗坏血酸的局限性，例如 GB/T 12392-1990 只能测定脱氢抗坏血酸。而对于还原型抗 坏血酸测定，GB5009.159-2003 则采用抗坏血酸与固 蓝盐 B(Fast blue salt B)反应生成黄色的草酰肼-2-羟基 丁酰内酯衍生物，在最大吸收波长420 nm测定吸光 度来检测[32]。陈焕文等[9]采用亚甲蓝褪色光度法能够 方便的测定维生素 C，具有良好的选择性。黄仲鑫[12] 利用抗坏血酸对于 Cu(II)具有专一的还原作用，在 Cu(II)的存在下，抗坏血酸将 Cu(II)迅速还原成 Cu(I)， Cu(I)与新亚铜灵(2,9-二甲苯-1,10 菲绕啉)络合生成黄 色水溶性物质，并在分光光度计下测定。此类方法结 果可靠，重现性好，能准确测定维生素 C的含量；但 如果待测液本身有颜色时，吸光度会受到影响，进而 影响测定结果的准确性，且耗时较长。 2.3. 电化学法 电化学分析法是利用维生素 C在电极上发生氧化 反应而进行测定的。维生素 C在电极上失去 2个电子 和2个氢离子被氧化形成脱氢抗坏血酸，经过不可逆 的水合作用形成脱氢古落糖酸。常用的工作电极有金 属电极、石墨电极等，但维生素 C在此类电极氧化需 要较高的氧化电位，在检测过程中易受到其它物质的 干扰。近年来，采用修饰电极来降低氧化电位受到研 究者的广泛重视，如纳米粒子金修饰的氧化钛膜电极 (Au/TiO2/Ti)[14]，聚吡咯修饰的分子印迹(MIP)石墨电 极[17]等，大大提高了检测方法的灵敏度和选择性。电 化学分析法具有分析速度快，操作简便、成本低、试 剂用量少等优点，还可以与液相色谱[20]、毛细管电泳 [26]、生物传感器[16]等联用来提高测定方法的灵敏度。 Copyright © 2013 Hanspub 10  食品与药品中维生素 C含量的检测方法进展 Copyright © 2013 Hanspub 11 Table 1. Determination methods of vitamin C in food and pharmaceutical 表1. 食品与药品中维生素 C的检测方法 基体 样品前处理 实验方法及条件 线性范围 检出限 回收率/% RSD/% Ref 柑橘、西瓜、 葡萄、香蕉 2%草酸溶液为提取 剂，捣碎呈浆， 过滤滴定滤液 滴定法(碘量法) 2 mol/L HAc 体系，1% CuSO4 溶液为指示剂 N.A. N.A. N.A. N.A. [7] 饮料、蔬菜、 维生素 C药片 取一定量的待测样 品溶解稀释， 取样测定 光度法： 维生素 C的还原性对亚甲基蓝有褪色 作用；试剂：对氨基苯磺酸(增敏剂)； pH = 2 的缓冲液(HCl-KCl)；测定波 长：660 nm 0.4~40 mg/L 0.4 mg/L N.A. N.A. [9] 维生素 C药片、 泡腾片、复合 维生素药片 研磨后，用盐酸溶液 溶液提取并过滤后 稀释 光度法：利用维生素 C的还原性将 Cu(II)还原为 Cu(I):C6H8O6 + Cu(II)-NH3→C6H6O6 + Cu(I)-NH3，铜 与铜氨络合试剂(pH = 9.5)显色反应； 测定波长：600 nm 0.8~6 mmol 0.26 mmol 97~101 1.00~5.00[10] 食品、药品、 生物样品 0.2 mol/L 草酸溶液 溶解或提取， 加5% EDTA离心 后，取上清液稀释 光度法：利用维生素 C与甲基紫在碱 性溶液中形成蓝色化合物的显色反 应；测定波长：600 nm 0.1~1.0 μg/L 0.1 μg/mL 98.5~99.3 1.9 [11] 维生素 C药片 研磨后用水提取 荧光猝灭法：维生素 C与亚甲基蓝形 成化合物，根据亚甲基蓝的荧光强度 减弱进行测定；发射波长 682 nm； 激发波长：664 nm 3.0 10−7~6.0 10−6 mol/L2.5 10−7 mol/L N.A. N.A. [12] 阿司匹林 研磨后用水提取 电化学方法(循环伏安法)： 以石墨为电极(PEG)；利用聚吡咯 (PPy)的分子印迹膜测定；阳极峰电 压：+0.15 V；阴极峰电压：+0.00 V 0.25~7.0 mmol/L 7.4 × 10−5 mol/L 93~97.1 <1.62 [15] 果汁 用50 mmol/L的磷酸 缓冲液 PBS (pH = 6.5)溶解 电化学生物法：工作电极：直径 3 mm 玻璃电极(GCE)；阻抗电极：直径 0.5 mm 铂丝；参比电极：饱和甘汞电极； 响应分析系统的电压为 0.3 V，Eac = 10 mV，频率在10 kHz~0.1 Hz 之间 4.0 × 10−5~3 × 10−3 mol/L13 μmol/L N.A. 0.43~0.91[16] 维生素片 研磨后用水提取 毛细管电泳–电化学法：采用柱端射 壁电化学检测系统；直径 300 μm碳 圆盘电极为工作电极；电动进样：20 KV 下进样 10 s；最佳工作电位：1.2 V 1.0 × 10−5~1.0 × 10−2 mol/L1.0 × 10−6 mol/L 96 <3.0 [27] 果蔬 捣碎，三氯乙酸提 取，加入 DL-光胱氨 酸反应后测定 毛细管电泳–电化学法：毛细管电泳 仪；磷酸盐缓冲液：pH = 6.90；进样 条件：14 KV/(42~44) μA N.A. N.A. N.A. N.A. [31] 软饮料 稀释 化学发光法(间接法)：利用维生素 C 的还原性对 Fe-叶绿酸–过氧化氢化 学发光体系的猝灭作用测定；发射波 长：400~600 nm；光电倍增管电压： 700 V 4.0 × 10−12~4.0 × 10−4 mol/L4.0 × 10−12 mol/L N.A. 3.8 [17] 补血药，柠檬 汁，洗发水等 溶于水，过滤， 收集滤液，稀释 流动注射法(FI)：利用维生素C对 p H 3.0 的Ti(III)溶液的还原性形成荧光 物质 TiCl32-测定；激发波长： 227 nm；发射波长：419 nm 1 × 10−6~5 × 10−5 mol/L 8 × 10−7 mol/L 91~117 2.1 [18] 液相色谱–紫外检测法 (HPLC-UVD)：流动相：0.1 mol/L， pH = 3.5 的磷酸钾缓冲液； 检测波长：245 nm N. A. N.A. N.A. 1.35~1.55[13] 婴儿奶粉，婴儿 豆制品 1%的偏磷酸溶液溶 解，离心， 收集上清液和 过滤膜 电位滴定法：1%的草酸溶液标准加入 校准法；初始电压：−0.15 V；终止电 压：+2.0 V;扫描速率：5 mV/s；电流 密度：5 nA/min N.A. N.A. N.A. 2.53~3.41[13]  食品与药品中维生素 C含量的检测方法进展 续表 橘子汁，葡萄 柚汁，萝卜 流动相稀释后，过 0.45 μm滤膜 液相色谱–电化学法(HPLC-ED)：电 极：Ag/AgCl；测定电压：400 mV； 色谱柱：C18；流动相：20 mmol 的鸟 嘌呤-5’-单磷酸二钠(GMP)； 流速：0.8 mL/min 0.02~10 ng/μL 0.02 ng/μL >90 2.7 [20] 半固体药物 及化妆品 流动相溶解后，离心 去上层物，稀释定容 液相色谱–紫外检测法 (HPLC-UVD)：色谱柱：C18；流动相： 0.2 %的偏磷酸/甲醇/乙腈 = 90:8:2； 流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm 1~12 μg/mL 0.05 μg/mL 95.5~101.5 0.38~1.22[21] 茶、枸杞 含苏糖醇的乙腈/水 (30:70) 溶液超声提取 并离心，流动相稀释 液相色谱–紫外检测法 (HPLC-UVD)：色谱柱：二醇基柱； 流动相：乙腈/66.7 mmol/L 醋酸铵水 溶液 = (85:15)；检测波长：260 nm 1~50 μg/mL 0.3 μg/mL 100.2~105.8 1.0~2.8 [22] 果汁，茶饮料， 可乐等 直接测定； 必要时过滤稀释 液相色谱–紫外检测法 (HPLC-UVD)：色谱柱：ODS 或 Mediterranea sea 18；流动相：0.1%的 甲酸水溶液；检测波长：254 nm 0.2~400 mg/L 0.01 mg/L N.A. <2 [23] 蔷薇果 液氮冷冻或低温烘 干后用 5%的偏磷酸 溶液提取离心 液相色谱–紫外检测法 (HPLC-UVD)：色谱柱：RP C18 柱； 流动相：0.5%NaH2PO4-乙腈 = (93:7) pH = 2.25；检测波长：254 nm 0.5~200 mg/L 0.05 mg/L 97~102 2.42~6.24[24] 蔬菜，水果 用3%偏磷酸，8%甲 酸和 1 mmol/LEDTA 溶液提取，离心过滤 超高液相色谱–二极管阵列检测法 (UHPLC-PDA)：色谱柱：HSS T3； 流动相：0.1%的甲酸水溶液； 检测波长：254 nm 0.05~100 μg/mL 22 ng/mL 88.9~102.5 <3.9 [25] 果蔬 捣碎 原子吸收间接法(AAS)：在酸性介质 中维生素 C可将 Cu2+定量的还原为 Cu+，然后 Cu+与SCN-反应生成 CuSCN 沉淀,离心分离出 CuSCN 沉 淀，洗涤后经浓硝酸溶解，用原子吸 收法测定沉淀中的铜的吸光度， 测定维生素 C的含 量； 步骤：依次加入一定体积 CuSO4 溶 液，NH4SCN 溶液，HC1-NaAc 缓冲 液及饱和 KCl 溶液，混合摇匀，离心， 洗涤沉淀, 最后用浓 HNO3溶解沉淀， 测定。 N.A. N.A. 96.6~100.7 3.02~4.77[28] 维生素 C药片， 感冒药 与0.2 mol/L HNO3 ——起研磨后用水 稀释 原子吸收间接法(AAS)：利用维生素 C 的还原性，将固相反应柱中二氧化锰 还原成二价锰，检测流出液中锰含量， C6H8O6 + MnO2 + H+ → C6H6O6 + MnO；洗脱液：6.3 mmol/L HNO3 (pH = 2.2)，洗脱速度：4.0 mL/min； 扫描宽度：0.5 nm；灯电流：9 mA； 检测波长：279.5 nm ~30 mg/L 0.2 mg/L 98.7~103.2 <1.09 [29] 药片、食品、 果蔬或饮料 捣碎，研磨 或稀释 原子吸收间接法(AAS)：利用维生 素C的还原性，将过量的 Fe3+定量 还原成 Fe2+，通过微型阳离子交换 树脂柱的在线吸附，再用一定浓度 的硝酸溶液洗脱，并通过火焰原子 吸收分光光度仪(FAAS)测定 Fe2+， 即可知维生素 C的含量； 流速：7 mL/min；灯电流：6.0 mA； 检测波长：248.3 nm 0.1~50 mg/L 0.06 mg/L 96~106 1.6 [30] Copyright © 2013 Hanspub 12  食品与药品中维生素 C含量的检测方法进展 Copyright © 2013 Hanspub 13 O OH HO COH CH 2 OH H + O NH ClCl OH H + + OH HN ClCl OH O O COH CH 2 OH H O O O 同。 常用于测定维生素C的色谱柱以反相柱为主，检 测器包括的紫外(UV)或二极管阵列(PDA)检测器和电 化学(EC)检测器等[20,25]。例如：Maia 等采用 0.2%的 偏磷酸–甲醇–乙腈 (90:8:2)为流动相，C18 柱为色谱 柱，在 254 nm波长下对药品中的维生素 C含量进行 测定[21]。Quiros 等，以 0.1%(V/V)的甲酸溶液为流动 相，Mediterranea sea 18 为色谱柱，在 254 nm 波长下 测定果汁和饮料中维生素 C含量[23]。由于流动相常常 要使用含有一定的离子强度的缓冲溶液，故基本无法 使用液相色谱–质谱联用技术来测定维生素 C的含 量。 Figure 2. Reaction mechanism of the 2,6—chloride indoles phenol based titration method 图2. 2,6- 二氯吲哚酚滴定法反应式 其缺点是对样品前处理要求较高，操作较为繁琐。 2.4. 化学发光法(CL) 2.7. 原子吸收光谱法(AAS) 化学发光法(CL)是利用维生素 C与高锰酸钾、 K2Cr2O7、Fe3+或铁氰化合物等发生氧化反应，并与鲁 米诺(Luminol)或光泽精(Lucigenin) 化学发光体系进行 反应偶合来测定体系的发光强度进行维生素 C的测 定。Kato 等利用在维生素 C中加入 Fe-叶绿酸发光体 系发生淬灭来测定微量的维生素C[17]。化学发光法具 有易操作、线性范围宽和灵敏度高的优点，是一种有 效的痕量分析方法。 原子吸收光谱法(AAS)间接测定维生素 C的含量 已有一些报道[28-30]，大致分为两类：沉淀法和阳离子 树脂交换法。沉淀法的原理是：在酸性介质中维生素 C与Cu2+及SCN−反应生成一价铜盐 CuCNS (沉淀)， 分离后用原子吸收法测铜含量而间接测定维生素 C含 量[28]。阳离子树脂交换法是通过维生素 C在阳离子交 换柱表面将高氧化态金属离子或氧化物(Fe3+, MnO2) 还原为低氧化金属离子(Fe2+, Mn2+)，通过流动注射(FI) 洗脱，利用原子吸收光谱法(AAS)测定其中还原态金 属离子，从而达到间接测定维生素 C含量的目的[29, 30]。 2.5. 流动注射分析法(FIA) 流动注射分析法(FIA)是将有色(或无色但有紫外 吸收)溶液作为载流，当被测样品注入载流时，发生化 学反应，使载流溶液颜色变淡(或紫外吸收降低)。若 载流吸光度的变化与被测物质量具有一定的函数关 系，即可以此对被测样品进行定量。流动注射法具有 试剂用量少，重现性好，样品自动注射，占用空间少 等优点[19]，特别适用于在大量样品中测定某一种目标 分析物。近年来，FIA技术用于维生素 C测定受到很 多研究者的关注，实现了快速、自动分析测定维生素 C。流动注射系统可以与光谱法、电化学分析、色谱 法、荧光法结合，与传统方法相比，大大提高了灵敏 度和准确度。 3. 结论与展望 综上所述，食品与药品中维生素 C的定量分析方 法中，已报道的几类主要检测方法各有利弊。常规滴 定法方法简单，但操作费时费力，滴定有色物质时终 点难以判断；紫外分光光度法目前所需的仪器设备比 较成熟，且准确度较高，因而成为实验室定量分析维 生素 C的主要方法。高效液相色谱法由于其选择性好、 测定迅速，与其他检测技术联用灵敏度较高，是近年 来发展快速的一种方法，但仪器设备价格高昂，推广 和普及仍存在一定的困难；原子吸收法操作简单快 速，可以避免果蔬中色素的干扰，但同样的也存在仪 器设备价格高昂的问题；电化学法应用于维生素C的 定量检测是近几年来研究应用最活跃的一个领域，因 其所需仪器结构简单、操作方便、便于携带且准确度 高，在现场快速检测方面具有较好的应用前景，但实 2.6. 液相色谱法(HPLC) 液相色谱法(HPLC)由于其具有灵敏度高、重现性 好、操作简便和能实现多种维生素的同时测定等优点 已成为近年来应用最广的分离和测定维生素 C的方 法。基于样品前处理方法、测定色谱条件和检测器的 不同采用 HPLC测定维生素 C含量的方法也不尽相  食品与药品中维生素 C含量的检测方法进展 用性有待进一步完善。 4. 致谢 本文得到浙江省大学生科技创新活动计划(新苗 人才计划 2012)项目和浙江大学宁波理工学院教研教 改项目(NITJY-201021, NITJY-201217)的资助，特此感 谢。 参考文献 (References) [1] M. 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