 Hans Journal of Soil Science 土壤科学, 2013, 1, 15-20 http://dx.doi.org/10.12677/hjss.2013.13004 Published Online October 2013 (http://www.hanspub.org/journal/hjss.html) 31-P Nuclear Magnetic Resonance (31P-NMR) in Environmental Phosphorus Analysis* Jin Lu1#, Haiwen Wang2, Hong Hao 1, Bo Gao1, Jianli Jia2 1China Institute of Water Conservancy and Hydropower Research, Beijing 2School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, Beijing Email: #lujin@iwhr.com Received: Jul. 17th, 2013; revised: Sep. 18th, 2013; accepted: Sep. 25th, 2013 Copyright © 2013 Jin Lu et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Due to its advantages in improving our knowledge about the P fractions in environmental samples, the 31-P nuclear magnetic resonance (31P-NMR) technology has received extensive attention. This paper summarized the current studies on the characterization of P fractions in sediments by using this technology, and described the technical principles, sample preparation method and analytical procedures of this technol- ogy. The preparation procedures of environmental samples have a significant influence on the accuracy and precision of testing results, including determination of sample pretreatment, extraction time, sample to ex- traction ratio and concentration method. The specific application fields of this technology were also summa- rized in this paper. 31P-NMR technology has been applied in the field of Soil, Lake, Ocean, Wetland, and has made a number of achievements. Some future research focuses were expected in this paper in order to pro- vide theoretic support for the development and application as well as standardization of 31P-NMR technology in the future. Keywords: 31P-NMR; Phosphorus; Morphological Analysis; Environment 环境磷形态分析中的磷-31 核磁共振技术* 陆 瑾1#，王海文 2，郝 红1，高 博1，贾建丽2 1中国水利水电科学研究院，北京 2中国矿业大学(北京) 化学与环境工程学院，北京 Email: #lujin@iwhr.com 收稿日期：2013 年7月17日；修回日期：2013年9月18日；录用日期：2013 年9月25 日 摘 要：磷-31 核磁共振(31P-NMR)技术因可以增强研究者对环境中磷素组分信息的认识而广受关注。 本文综述了该技术在环境磷素形态表征方面的研究成果，对 31P-NMR技术的原理、样品制备方法及分 析流程进行了系统阐述。环境样品的制备过程(包括样品前处理方法、提取时间、提取剂比例、样品浓 缩方法等)对检测结果的精密度和准确度具有显著影响。论文同时综述了该技术在土壤、湖泊、海洋及 湿地磷循环等研究领域的研究成果，并对该技术未来的研究及应用重点进行了展望，旨在为环境磷形 态分析中的核磁共振技术的发展应用以及标准化研究提供借鉴。 关键词：31P-NMR；磷；形态分析；环境 *基金项目：国家自然科学基金资助项目(No. 50909102)，公益性行业专项资助项目(200901055)。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 15  环境磷形态分析中的核磁共振技术 Copyright © 2013 Hanspub 16 1. 引言 研究处于强磁场中的 31P原子核对射频辐射的吸收， 进而解决含P化合物分子结构信息的分析方法，可通 过图谱上不同的位移值判断各种含磷化合物[10] 。 31P-NMR技术分为固相和液相两种，由于环境样品有 机磷含量相对较低，金属矿物质含量较高，固相 31P-NMR 法由于灵敏度和分辨率低而不能检测到土 壤或沉积物中的有机磷[11]，因而环境样品形态分析通 常选用液相 31P-NMR技术。环境样品中通过液相 31P- NMR 技术可检测到的含磷化合物包括正磷酸盐 (orthophosphate) 、磷酸单酯(orthophosphate mono- esters)、磷酸二酯(orthophosphate diesters)、焦磷酸盐 (pyrophosph ate)、多聚磷酸盐(polyphosphate) 、膦酸脂 (phosphona tes)，典型图谱如图 1所示。 磷(P)是构成许多生物大分子的关键元素，在能量 贮存、迁移和转化过程中起关键性的作用[1]。以有机 磷为参与主体的湖库磷循环过程在很大程度上决定 了水体初级生产力的水平[2]，研究有机磷的组成及转 化特征是深入了解这一过程及其对富营养化贡献的 重要环节。然而，因为技术手段等因素的限制，对环 境中磷的研究多集中在无机磷上，有机磷的研究则相 对有限[3,4]。 环境样品中P化合物研究的传统方法或过于繁 琐，或不甚精确，尤其是对于有机磷化合物的研究， 基本是根据总磷与无机磷的差值获得，或被处理为连 续提取程序中可以统一被最强提取剂分离的含磷组 分[5]。相对其它分析技术而言，31P-NMR 技术对各种 含P化合物的破坏性最小，具有样品前处理相对简单、 组分分析完全等优点[6-9]。 3. 31P-NMR 样品制备方法 31P-NMR技术在环境磷形态分析中的应用常常 受环境样品制备方法的制约。 31P-NMR的样品制备可 概括为样品的前处理(干燥、研磨)，提取条件(提取剂 的选择、提取时间及温度、提取剂的比例)、提 取液的 处理三个部分，这几个部分都将对结果产生影响。 本文将通过总结国内外学者近30 年来的研究报 道，对样品制备这一影响该技术精密度和准确度的关 键环节进行全面阐述，总结该技术在土壤、湖泊、海 洋及湿地磷循环等研究领域的研究成果，旨在为环境 磷形态分析中的核磁共振技术的发展应用以及标准 化研究提供借鉴。 3.1. 样品的前处理 样品的前处理包括样品的干燥、研磨。一般来 说样品的干燥方式包括烘干、自然风干、冷冻风干， 或直接使用未经风干的新鲜样品。2005 年Barbara J. Cade-Menun 等人[13]通过具体分析不同储存条件下 2. 31P-NMR 技术简介 31P是P元素唯一的天然稳定同位素，自然丰度 为100%，31P-NMR(Nuclear Magnetic Resonance)，是 Figure 1. A solution 31P-NMR spectrum of phosphorus environmental standard samples (extracted with NaOH-EDTA) 图1. 磷的环境标准样品液相 31P-NMR 图谱(NaOH-EDTA提取)[12]  环境磷形态分析中的核磁共振技术 海洋沉积物的 31P-NMR 检测发现，自然风干会高 估样品中的磷，正磷酸盐和磷酸单酯都会增加，磷酸 二酯则会降低，而冷冻储存的样品则更接近原样品中 的磷组分含量。2011 年白秀玲等人也通过对我国 43 个湖泊的表层沉积物的研究证明[14]：风干样品较新鲜 样品磷的提取率更高，样品的风干可促进有机磷的水 解，较高温度的风干也会低估有机磷的含量，而直接 使用新鲜样品则在一定程度上低估了有机磷组分； 另外该研究还表明，风干样品经充分研磨可破坏沉积 物结构，尤其是对含矿物质多的沉积物，可促进磷的 释放，所以研磨作用也非常重要。因此建议 31P-NMR 样品前处理方法为：冷冻干燥，充分研磨后冷冻储 存。 3.2. 提取剂的选择 自1980 年该技术得到应用开始，早期研究者们 最常使用的主提取剂为 NaOH，但往往会选择一些其 它的试剂作为联用试剂[15-20]，如EDTA、CDB、NaF、 稀酸、阳离子交换树脂等。这是因为环境土壤或沉积 物中往往含有较多的Ca、Fe、Al、Mn 金属矿物质等， 与含磷化合物形成金属结合态磷，使得磷难以被释 放，因此单独使用 NaOH 提取(一些生物样品除外[21]) 并不能取得很好的效果。而阳离子交换树脂、CBD等 均可以达到去除或封闭金属离子的作用，从而释放 磷，提高提取效率。但研究发现，阳离子交换树脂在 去除阳离子的过程中还可能带走多聚磷[13]，而 CDB 与NaF 均具有针对性，CDB 主要是将固相的三价铁 转化为可溶性的二价铁离子[17]，NaF 则主要针对Al， 对沉积物中含量较多的含Ca 化合物则效果甚微。 相对而言，EDTA 作为金属螯合剂不仅适用于更 广泛的阳离子(对Ca、Fe、Al、Mn 等均可发挥作用)， 而且对有机磷组分的破坏性更小[22]。在提取过程中 EDTA 的螯合作用可破坏含磷金属配合物，同时还可 以阻止与微生物生长代谢密切相关的多聚磷的水解 [23]。因此近些年 31P-NMR技术应用的研究中，EDTA 逐渐成为了最常用的金属螯合剂[24-26]。但同时研究者 们发现EDTA 作为螯合剂也存在一定的缺陷，因为 EDTA 的络合作用，提取液中的会存在很多的金属络 合物，干扰核磁共振波谱，即EDTA 提取液并不适合 31P-NMR扫描分析。所以EDTA 的用法及配比问题成 了31P-NMR 技术的另一个研究重点与热点。2007年 Ahlgren, J.等人[27]研究发现单独使用NaOH主提取， 或EDTA 预提取 NaOH 主提取，对总磷的提取率都比 NaOH-EDTA 混合液主提取要小。因此认为EDTA应 与NaOH 混合使用。但在 2011年时又提出 EDTA 提 取液并不适合 NMR 扫描分析，因此应将 EDTA 作为 预提取剂处理1 h 后，再以 NaOH 进行主提取[28]。白 秀玲等人[29]也通过研究不同浓度NaOH及 不 同配比 NaOH-EDTA 对沉积物有机磷的提取及组成分析的影 响证明 NaOH-EDTA 提取率更高，同时在综合考虑 EDTA 络合作用及 pH 的影响下确定0.25 M NaOH- 0.05 M EDTA 为沉积物有机磷提取剂的最佳选择。目 前关于 EDTA的用法并未产生统一定论，但考虑到磷 提取率及操作方便的因素，多数研究者选择将其与 NaOH 联合作为主提取剂。 在NMR 扫描时发现，无机正磷酸盐往往会占极 大比例，这不仅会使得扫描时间大大增加，同时会压 缩其它含量较少的有机磷组分的出峰，甚至出现噪 音。因此如何去除环境样品中无机磷酸盐从而提高扫 描效果是另一个研究重点，一般会选择稀酸进行预处 理以达到去除的效果[30]，但此方法也会带走样品中的 部分有机磷[31]，目前这仍是学术界尚未解决的一个难 题。 3.3. 提取剂的比例 提取液中磷的浓度会直接影响到31P-NMR检测 的灵敏度。相同情况下，提取剂比例越高，各组分的 浓度就越低，被检测出来的可能性也越小；同时浓缩 的时间也会越长，以致有机磷水解或与金属离子沉淀 的几率越大。但如果提取剂比例过低，首先会影响提 取效果，其次无机磷酸盐的比例会相应增加，从而加 大扫描难度。因此虽然提取剂比例的变化并不影响提 取剂对磷的选择，但选用适当的提取剂比例，对提取 效果以及检测灵敏度都非常重要。应根据待测样品的 具体情况(主要可依据样品的总磷含量)设置适当的提 取剂比例，对于总磷含量较高(如，>1.0 g/kg干)的样 品，可选择 8:1~20:1或更高的比例[32]；而对于总磷含 量较低(≤0.8 g/kg 干)的样品，则可设为5:1 或4:1 等较 低的比例[33]。表 1列出了几种不同提取剂比例下的扫 描结果(省略了均检测到了的正磷酸盐及磷酸单酯)。 Copyright © 2013 Hanspub 17  环境磷形态分析中的核磁共振技术 Table 1. The results of different extracting ratio and NMR scans 表1. 不同提取剂比例及NMR 扫描结果 主提取剂 TP(g/kg干样) 提取剂(ml)/样品(g 干) 扫描结果 1.45~1.85 磷酸二酯、焦磷酸盐、多聚磷、膦酸脂 NaOH <0.60 20:1 磷酸二酯、焦磷酸盐 NaOH-EDTA 0.88~1.50 10:1 磷酸二酯、焦磷酸盐 NaOH] 0.85 3:1 磷酸二酯、焦磷酸盐、多聚磷 NaOH-EDTA 1.13~1.23 8:1 磷酸二酯、焦磷酸盐、膦酸脂 3.4. 其他参数的选择 在选择好提取剂及比例后，为了尽可能完整地提 取出样品中的含磷组分，同时保证某些化合物不致水 解，应把握好提取时间，研究表明常温下振荡提取12~ 16 h 是合适的[14]。除提取时间外，环境条件如温度、 pH 等因素也会在一定程度上影响提取液中最终的 磷 组分及 NMR 检测结果。伴随着温度的升高，有机磷 的矿化率以及无机磷的释放都会增加[28]。相对来说， 含氧量对磷组分的影响最大，氧气充足的情况下磷酸 二酯更容易发生降解；而缺氧或厌氧条件可导致更多 磷的释放[34]。所以提取完成后，可在4℃，10,000 r/min 下离心获得提取液，然后经冷冻干燥浓缩成粉末样 品，−20℃保存直至检测前。需要补充的是一般来说 pH 为6~7 的情况下，PO4-P 更加稳定，多聚磷不易降 解，因此在冷冻干燥前可使用少量稀酸调节提取液的 pH[35,36]。 3.5. 31P-NMR 分析 样品制备完成后，冷冻储存直至分析，但应在两 天之内进行核磁共振分析。31P-NMR 分析前，取出冷 冻浓缩样品，重新溶解，然后在4℃，10,000 r/min 下 离心 10 min，加入适量D2O锁定信号。然后将样品转 移至 5 mm NMR管中进行31P-NMR检测。 4. 31P-NMR 技术在环境有机磷 分析中的应用 4.1. 土壤学 土壤学家比较早地认识到了有机磷的重要性， 1980 年Newman[6]首次将 31P-NMR 技术应用到土壤有 机磷的研究中，突破性地获得了有机磷的具体成分， 此后该技术逐渐成为有机磷研究的有力武器。自 Newman等第一次开创性的将31P-NMR 用于土壤学研 究至今逾三十年，该技术得到了迅速的发展，俨然已 成为当今对有机和无机磷化合物结构分析的最重要 的工具之一，极大地推动了土壤有机磷及土壤磷循环 研究的发展。研究表明：①土壤中的有机磷除了与有 机质螯合的无机磷酸盐以外，主要为大分子有机生物 磷，包括磷脂、核酸、肌醇磷酸(酯)、葡萄糖-6-磷酸 (酯)、甘油磷脂、磷蛋白以及多聚态有机磷等[37,38]； ②聚磷酸脂含量、磷酸二酯与磷酸单脂比值、DNA 和非 DNA 类物质比值等则可作为有机磷来源的多元 示踪“生物标志”[39]；③不同种类或不同赋存状态的 有机磷在土壤中的稳定性和循环特征存在明显差异， 在土壤剖面上不同稳定性(如磷酸单酯与磷酸二酯)的 比例变化，反映了土壤中磷埋藏的改造强度和磷转化 稳态反应的某种质量上的平衡关系[40,41]。 4.2. 湖泊、海洋学 利用 31P-NMR技术研究湖沼及海洋沉积物中有 机磷的工作相对起步较晚，其分析方法也完全建立在 土壤学研究的基础上。但近些年的研究工作表明了 31P-NMR 技术在湖沼学和海洋学研究工作方面存在 的重大意义与前景。研究表明[17,28,35]：控制条件实验 发现含氧量、温度、有机质、抑制剂等都会对湖泊沉 积物磷组分产生影响，尤其是含氧量。厌氧条件下不 仅会促使更多磷的释放，同时在释放的过程中会促使 Fe-P系络合物溶解，伴随磷酸盐的释放，部分磷酸盐 会导致多聚磷的矿化。自然湖泊沉积物中有机磷成分 包括磷酸单酯、磷脂、DNA-P、膦酸脂、有机多聚磷 等，但人工景观湖中检测不到膦酸脂和有机多聚磷， 且其中生物磷的含量排序为单酯磷 > DNA-P > 焦磷 Copyright © 2013 Hanspub 18  环境磷形态分析中的核磁共振技术 酸盐 > 脂质磷，提示人类活动对水体－沉积物系统 磷素的组成具有重要影响，应重新考量景观湖对水体 的净化能力；缺氧且含有更多金属离子的海洋中没有 检测到湖泊沉积物中出现的焦磷酸盐和多聚磷，提示 氧化还原反应及阳离子强度变化是影响焦磷酸盐和 多聚磷的关键因子；磷酸二酯在低氧或厌氧区含量更 高，且明显高于磷酸单酯，有氧条件下则相反，符合 聚磷菌厌氧释磷，好氧聚磷的特征，提示溶解氧对水 体-沉积物系统磷素的迁移转化具有较大影响。 4.3. 湿地学 尽管湿地中磷持留和磷去除的主要过程都涉及 有机态磷的转化，且成熟湿地中 50%以上的总磷累积 为有机态磷，但目前关于湿地中有机态磷的赋存形 态、环境行为等基本问题的认知仍存在很大缺位，严 重限制了湿地生态工程的运用和管理。有机磷研究正 成为国际环境科学界的热点，随着 31P-NMR技术在湿 地磷研究中的逐步应用，国内外湿地有机磷研究逐渐 起步[42]。2007 年Benjamin L. Turner等[39]就在原有技 术的基础上研究了不同的前处理方式对湿地有机磷 提取的影响，研究发现冷冻干燥、0.25 M NaOH~0.05 M EDTA仍然是较好的处理方法。2013 年Min Li等 人[43]研究指出 HCl的预提取作用可以去除大部分的 无机磷，从而提高提取液中有机磷的比例。该研究还 指出，有机磷是湿地植物潜在的磷素来源；湿地表层 土壤中的有机磷成分包括磷酸单酯、磷酸二酯等，单 酯占着主导地位；随着湿地表层土壤深度的增加，有 机磷逐渐减少，这要归功于湿地植物残体的堆积作 用，以及土壤成岩作用；说明在湿地土壤中，有机磷 主要富集在表层土壤，且主要是稳定性的磷酸单酯； 浅层土壤中的细菌可以摄取大量的磷素形成多聚磷 酸铵，进而转化为无机磷，深层土壤的有机磷被细菌 降解的过程则是漫长的，说明细菌的生长代谢对于湿 地表层土壤中的磷素组成及迁移转化具有重要意义。 此外 2005 年Turne r[44]也发表过研究报告表明了磷酸 二酯在湿地磷循环中的重要性。 4.4. 小结 环境中磷化合物的种类包括无机磷酸盐、有机磷 酸单酯、磷酸二酯、膦酸盐、有机多聚磷等，不同种 类有机磷在环境中的稳定性和循环特征存在明显差 异，不同种类有机磷化合物的比值可作为磷来源的多 元示踪“生物标志”。随着水体富营养化问题的日益 突出，磷在环境中的形态及迁移转化规律成为了研究 热点， 31P-NMR 分析技术因具备传统磷化合物研究方 法所不具有的样品前处理相对简单、破坏性小、组分 分析完全等优点，不仅可以得到环境磷的具体形态， 还可据此分析磷的组成结构及空间分布等信息。该技 术的应用极大推动了环境磷特别是有机磷循环研究 的发展，尤其是在水体富营养化严重 的今天，31P-NMR 技术对于湖泊、湿地等系统磷的内循环的研究具有重 要的推动作用，对于进一步深化磷在环境中的迁移转 化以及动力学研究具有重要的意义，同时，可望为新 型生态污水处理系统——湿地系统的设计、运行和管 理等的发展与优化提供理论支撑。 5. 展望 1) 样品制备技术是影响该技术在环境磷形态分 析及迁移转化规律研究中应用的关键因素。关于 31P- NMR 技术的环境样品制备方法目前尚无统一的标准 方法，未来的研究工作可尝试将试验方法及参数标准 化，尽可能的改进并完善统一样品制备方法。 2) 不同种类有机磷在环境中的稳定性和循环特 征存在明显差异，含氧量、温度、有机质、细菌等因 素都会对环境中磷素的组成及迁移转化产生显著影 响。因此在方法标准化研究的同时，尝试将31P-NMR 技术应用到更多的领域，并结合其它生物物理化学方 法等，开展反应动力学等的研究。 参考文献 (References) [1] 徐进, 张奇. 表流湖滨湿地磷素汇－源功能研究[J]. 环境科 学学报, 2007, 27(10): 1617-1622. 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