 Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2013, 3, 23-28 http://dx.doi.org/10.12677/aac.2013.34005 Published Online November 2013 (http://www.hanspub.org/journal/aac.html) Studies on the Extraction of ALDH from Instant Yeast by Ultrasonic Crushing Method and Purification Baiyong Qian Guangzhou Kaihong Flavor & Fragrance Co. Ltd., Guangzhou Email: ayong200508@126.com Received: Dec. 11th, 2013; revised: Dec. 16th, 2013; accepted: Dec. 18th, 2013 Copyright © 2013 Baiyong Qian. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: This paper studies the extraction of acetaldehyde dehydrogenase from instant yeast by ultrasonic fragmenta- tion method. And studied the solid-liquid ratio, sample processing, pH, ultrasonic power, the time of ultrasonic influ- ence on the extraction process of instant low sugar yeast through single factor experiment. That gets a set of optimal extraction process: the ratio of material liquid is 1:4, 20 mL capacity, extraction buffer pH 8.0, 300 w ultrasonic power, ultrasonic time of 16 min. Under the optimum process, the enzyme activity of ALDH crude enzyme is up to 3.56 U/mL. The crude enzyme of ALDH liquid used ultrasonic broken method through salting out, dialysis, Sephadex G-75 column chromatography, the ratio of the purified is 2.562, and the specific activity reached 1.24. Keywords: Aldehyde Dehydrogenase; Ultrasonic Broken; Purification 超声波破碎法从干酵母中提取乙醛脱氢酶 及其分离纯化的研究 钱柏勇 广州市凯虹香精香料有限公司，广州 Email: ayong200508@126.com 收稿日期：2013 年12 月11 日；修回日期：2013 年12 月16日；录用日期：2013 年12 月18 日 摘 要：本文研究了超声波破碎法从干酵母中提取乙醛脱氢酶的实验，并通过单因素实验研究了料液比、样品 处理量、提取液 pH、超声功率、超声全程时间对低糖型酵母中 ALDH 提取工艺的影响，得到一组最优的提取 工艺：料液比1:4、处理量 20 ml、提取缓冲液的 pH 值8.0、超声功率 300 W、超声全程时间 16 min，在此最佳 工艺下获得的 ALDH 粗酶提取液的酶活力高达 3.56U/mL。超声破碎法得到的 ALDH 粗酶液经过盐析、透析、 Sephadex G-75柱层析后，其纯化倍数可达 2.562，比活力达到1.24。 关键词：乙醛脱氢酶；超声破碎；纯化 1. 引言 乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)广 泛存在于原核生物和真核生物中，在辅酶 I存在的条 件下，它能催化某些醛和酮的脱氢反应[1]。在人类和其 他许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有 害的醛类转化，因此在细胞解毒研究中，乙醛脱氢酶 受到高度关注[2]。人体由肠道吸收摄入的乙醇，主要 在肝脏内代谢。乙醇进入体内后，首先在乙醇脱氢酶 (ADH)的作用下使乙醇脱氢转化为乙醛，然后在由乙 醛脱氢酶(ALDH)的催化作用下，使乙醛氧化生成 Copyright © 2013 Hanspub 23  超声波破碎法从干酵母中提取乙醛脱氢酶及其分离纯化的研究 乙酸，乙酸通过三羧酸循环(TCA)分解为 CO2和水， 并释放能量生成 ATP[3]。乙醇在人体内的代谢途径有 乙醇脱氢酶(ADH)催化的乙醇氧化体系、肝线粒体乙 醇氧化体系(MEOS)、乙醛脱氢酶(ALDH)催化的乙醛 氧化体系和过氧化氢酶体系、NADPH氧化酶体系[4]。 乙醛是毒性很强的物质，可以共价结合微粒体蛋白形 成乙醛蛋白络合物，抑制肝细胞合成蛋白的排出，最 终造成人体酒精性肝病的发生。而且乙醛还在体内通 过黄嘌呤氧化酶转变为超氧化合物，使膜脂质过氧化 生成丙二醛和壬烯，它们可以进一步促进肝细胞释放 因子，破坏细胞膜[5-7]。当乙醛在体内累积过多时，会 使人酒后产生脸红、恶心、呕吐、全身出汗、肌肉抽 搐等症状，严重时会导致休克。乙醛在体内是潜在的 致癌物质，能引起体内口腔、肝脏、食道、肠道癌[8]。 因此，乙醛在 ALDH 的催化作用下氧化分解至关重 要，例如可以应用 ALDH 来开发解酒药物制品[9]，加 快体内乙醛的代谢速度。 本文利用超声破碎法从干酵母中提取 ALDH，研 究了超声破碎法中各因素对提取ALDH的影响，得到 一组最佳的反应参数，并对超声破碎法得到的 ALDH 粗酶液进行了分离纯化，得到了比较高纯度的 ALDH 酶液。 2. 材料与方法 2.1. 试剂与仪器 即发干酵母(乐斯福明光有限公司)、氧化型辅酶 I (广州市齐云生物技术有限公司)、无水乙醇(天津市富 宇精细化工有限公司)、超声波细胞粉碎机(宁波新芝 生物科技有限公司)、紫外可见光光度计(上海棱光技 术有限公司)、台式高速冷冻离心机(EPPENDORF A.G)。 2.2. 方法 2.2.1. 酵母的处理 取1.5 g干酵母，放入盛有 15 mL蒸馏水的试管中。 混匀，于 35℃水浴中孵育 15 min，制得菌悬液。将菌 悬液于 4℃、5000 r/min、离心 5 min，弃上清液，蒸馏 水清洗 1次，再次离心，取沉淀并保存于 4℃冰箱备用。 2.2.2. 粗酶液的制备 将湿酵母按质量体积比 1:3(w/v)重悬浮于 0.05 mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4，pH8.0，浓度 0.05 mol/L) 中，于冰水浴中超声波破碎，条件：功率 300 W、破 碎时间 3 s、间隙时间1 s、总时间15 min。将破碎液 于4℃、5000 r/min 条件下离心 15 min，收集上清液， 即为粗酶液，按2.3.1 所述测定酶活。 2.2.3. 酶活的测定方法 酵母 ALDH 酶活检测：配制 3mL 酶活性测定体 系，体系中含有1 mol/mL Tris-HCl (pH 8.0)、20 mmol/m LNAD+、3 mol/mLKC1、100 mmol/L 乙醛、 1 mol/L巯基乙醇(2-Me) 0.03 mL和10%吡唑 0.02 mL。 分别将酶活性测定体系和待测酶液在 25℃恒温水浴 箱中水浴 5 min；将待测酶液迅速加入酶活测定体系 中。立即放入紫外分光光度计中，在连续 5 min内。 每隔 1 min 读取340 nm 处的吸光度值。 2.2.4. 蛋白质含量测定方法 参照 Bradford 法，0~100 μg/mL 标准曲线的制作： 取6支10 mL 干净的具塞试管，按表1取样 。盖塞后， 将各试管中溶液用微型涡轮旋转器混合均匀，放置 2 min 后用 1 cm光经的比色皿在 595 nm波长下比色， 记录各管测定的吸光度A595 nm，并做标准曲线。 2.2.5. 柱层析处理 SephadexG-75 凝胶柱层析：将经过充分溶胀的 SephadexG-75 装柱，色谱柱直径 2.4 cm，柱 高20 cm。 0.05 mol/L pH 8.0的PBS 液进行平衡。平衡后，分别 取1 mL已经过透析处理的酶液和未经过透析处理的 酶液上样，0.05 mol/L pH 8.0 的PBS 液进行洗脱，流 速为 0.4 mL/min，观测洗脱峰，并进行收集。 3. 结果与讨论 3.1. 超声波破碎法提取因素的考察结果 试验在其他因素不变的条件下，对影响ALDH 提 取效果的料液比、提取液 pH、超声功率、超声全程 时间等因素分别进行了考察，对提取的粗酶液进行 ALDH 活性测定，以确定各影响因素的适宜水平。 3.2. 料液比对 ALDH 提取效果的影响 分别按照料液比(w/v)为1:1、1:2、1:3、l:4、1:5 的量加入酵母泥和 pH 8.0、0.05 mol/mL磷酸盐缓冲 溶液，进行超声提取，超声功率300 W，每超声 3 s Copyright © 2013 Hanspub 24  超声波破碎法从干酵母中提取乙醛脱氢酶及其分离纯化的研究 Ta bl e 1 . L9 (33) orthogonal tests 表1. L9 (33)正交实验表 序号 pH(A) 超声功率 (B)/W 超声时间 (C)/min ALDH 酶活 力(U/mL) 1 7.5(1) 250(1) 12(1) 2.99 2 7.5(1) 300(2) 16(2) 3.25 3 7.5(1) 350(3) 20(3) 3.11 4 8.0(2) 250(1) 16(2) 3.31 5 8.0(2) 300(2) 20(3) 3.48 6 8.0(2) 350(3) 12(1) 3.08 7 8.5(3) 250(1) 20(3) 2.58 8 8.5(3) 300(2) 12(1) 3.08 9 8.5(3) 350(3) 16(2) 2.84 K1 9.35 8.88 9.14 K2 9.87 9.80 9.40 K3 8.49 9.02 9.16 R 1.38 0.93 0.24 间歇 1 s，全程时间 15 min，所获得 ALDH 活力如图 1所示。 从图 1可以看出，在使用超声破碎法破碎酵母细 胞时，提取液较少会使细胞破碎不完全，ALDH 活力 较低；而提取液过多又会减少单位体积提取液中所含 的酶量，从而降低 ALDH 活力。当料液比为 1:4 时， 所获得的粗酶提取液的ALDH活力最高，即在此料液 比下提取ALDH，既可以充分破碎细胞，又可以获得 较高 ALDH 含量的粗酶提取液。 3.3. 样品处理量对 ALDH 提取效果的影响 由于超声破碎时所使用的是100 mL塑料离心管 以及所使用的超声变幅杆额定样品处理量范围(20 mL~100 mL)，对所处理的样品量有一定的限制。试验 分别取体积 20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL， 按照 1:4的比例用pH 为8.0 的0.05 mol/mL 磷酸盐缓 冲液，在冰浴条件下，对 ALDH进行超声破碎提取， 提取液中ALDH 活力的测定结果见图 2。 从图 3可以看出，在其他相同条件下进行超声破 碎提取时，样品处理量为 20 mL 提取到的 ALDH活力 最高，因为在此条件下，酵母细胞破碎较完全，因此 今后实验均采用20 mL 的样品处理量。 Figure 1. Impact of solid-liquid ratio on the extraction 图1. 料液比对提取效果的影响 Figure 2. Impact of sample handling capacity on the extraction 图2. 样品处理量对提取效果的影响 Figure 3. Impact of all ultrasonic time on the extraction 图3. 超声全程时间对提取效果的影响 3.4. 提取液 pH对ALDH 提取效果的影响 在其他条件不变，配置不同pH 值磷酸缓冲液， 对湿酵母细胞进行超声破碎，对提取出来的粗酶液进 行ALDH 活力测定，结果见图 4。 从图 4可以看出，低糖型酵母中 ALDH 提取的适 宜缓冲液 pH 范围为8.0，此时获得的 ALDH 活力最 高，升高或降低提取缓冲液的pH 值，会引起酶结构 的变化，从而导致 ALDH 活力的下降。 3.5. 超声功率对 ALDH 提取效果的影响 超声功率太小时无法实现细胞的完全破碎，但是 Copyright © 2013 Hanspub 25  超声波破碎法从干酵母中提取乙醛脱氢酶及其分离纯化的研究 Figure 4. Impact of pH on the extraction 图4. pH对提取效果的影响 如果功率太大则会由于高温的产生，对酶的活性造成 影响。因此，选取合适的超声功率很重要。在其他条 件不变，选用不同的超声功率对酵母进行超声破碎， 对提取出的粗酶液进行ALDH活性测定，结果如图 5 所示。 从图 5可以看出，超声功率不同，酵母中 ALDH 的提取结果差异较大。比较适宜于雪峰低 糖型酵母中 ALDH 提取的超声功率在 300 W。因 此今后的提取实验中，采用在超声功率 300 W下 进行试验。 3.6. 超声全程时间对 ALDH 提取效果的影响 在其他条件不变，实验选用不同的超声全程时 间，对不同超声全程时间下提取出的粗酶液进行 ALDH 活力测定，测定结果如图 3。 从图 3可以看出，选取不同的全程时间对雪峰低 糖型酵母细胞进行超声处理后，所得提取液的 ALDH 活力有很大差异，其中全程时间为 16 min 时，超声破 碎处理得到的ALDH 粗提液活力最高，实验初步确定 的最佳超声破碎全程时间为16 min。 3.7. 雪峰低糖型酵母中ALDH 提取工艺优化结果 根据单因素考察的结果综合分析后，以超声全程 时间、超声功率、溶液 pH 值这三个因素为考察对象， 选用 L9 (33)正交表进行3因素3水平正交设计，以 ADH 活力为指标，优化低糖型酵母中 ALDH 的提取 工艺，结果见表1。 由表 1极差分析结果可知，各因素对低糖型酵母 中乙醇脱氢酶提取结果影响的主次顺序为：提取缓冲 液pH 值的影响>超声功率的影响>超声全程时间的影 Figure 5. Impact of ultrasonic power on t he extraction 图5. 超声功率对提取效果的影响 响。因此得知，在 ALDH 提取中，影响提取效果的重 要因素是提取缓冲液的pH 值。根据正交试验优化组 合选定原则，本试验所得的雪峰低糖型酵母中乙醇脱 氢酶的最佳提取工艺为：A2B2C2 组合。即提取缓冲 液的 pH 值为8.0，超声功率 300 W，超声全程时间为 16 min。 该组合在正交试验表中未出现，需要进一步通过 试验进行验证。为验证最优组合的正确性，在最优提 取工艺条件下，重复三次进行实验，ALDH 活力高达 3.56 U/mL。可见极差分析得到的提取方案可行，可作 为低糖型酵母中ALDH 提取的最优方案。 3.8. 硫酸铵分级沉淀 3.8.1. 硫酸铵初步沉淀分离 取九组试管，每组四支(其中一支为空白对照，三 支做平行待测样)，每支试管中加入 5 mL粗酶提取液， 加入相应质量的固体硫酸铵粉末，分别制成饱和度为 0%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 的硫酸铵溶液，室温下静置 l h，10,000 r/min 离心 10 min，收集上清液，检测其中 ALDH活力，结果见表 2所示。 从表 2可以看出，硫酸铵的饱和度在 40%时ADH 活力开始显著下降，为了有效地对低糖型酵母中的乙 醛脱氢酶进行提取，实验确定采用 40%饱和度的硫酸 铵浓度进行初步除杂。 3.8.2. 硫酸铵进一步沉淀分离 方法：将已制备好的粗酶液分为六组，每组5 mL， 其中一组为对照，不加硫酸铵，其余 5组分别加入 1.215 g 粉末状固体硫酸铵，制成40%饱和度的硫酸铵 溶液，室温下静置 1 h，10,000 r/min 离心 10 min，收 Copyright © 2013 Hanspub 26  超声波破碎法从干酵母中提取乙醛脱氢酶及其分离纯化的研究 Copyright © 2013 Hanspub 27 Ta ble 2. Determination of enzyme activity after first precipitati on of am monium sulfate 表2. 硫酸铵初步沉淀后 ALDH 活力测定结果 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 硫酸铵饱和度(%) 0 10 20 25 30 35 40 45 50 粗酶液(mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 加入硫酸铵(g) 0 0.280 0.570 0.720 0.880 1.045 1.215 1.385 1.565 ALDH 活力(U/mL) 3.513 3.309 3.197 3.109 3.106 3.135 2.807 2.556 2.363 集上清。在此基础上，加入相应质量的粉末状固体硫 酸铵，分别配成饱和度为 40%、70%、75%、80%、 90%的硫酸铵溶液。室温下静置 1 h，10,000 r/min离 心10 min，收集沉淀，于每支试管中加入 5 mL 0.05 mol/L pH8.0 磷酸盐缓冲液，将沉淀溶解，测定 ALDH 活力与蛋白含量。结果如表3所示。 从表 3可以看出，40%饱和度的硫酸铵沉淀中 ALDH 活力很低，证明其中所含 ALDH 的量很少，大 部分乙醛脱氢酶分布于上清液中。用饱和度为 75%硫 酸铵再沉淀时，其 ALDH 活力大小与粗酶液中的 ALDH 活力相差不大，证明 ALDH 沉淀较完全。因此， 采用 75%饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀，既可以获得 较高的 ALDH 活力，又可以减少杂蛋白的共沉，提高 ALDH 纯化效率。 实验选用40%饱和度的硫酸铵进行初步沉淀，室 温下静置1 h，10,000 r/min 离心 10 min，收集上清， 加入相应质量的固体硫酸铵粉末，制成饱和度为 75% 硫酸铵溶液，进行二次沉淀，室温下静置1 h，10,000 r/min 离心l0 min，收集沉淀，加入5 mL 0.05 mol/L pH8.0 磷酸盐缓冲液进行溶解，得到盐析后的酶液。 3.9. 透析 选用分子量为 8000~10,000 的透析袋，装入 1/2 经硫酸铵二次沉淀处理后的酶液，进行透析，选用 50 mmol/L pH8.0 PBS 液做为透析液，透析 24 h，平均每 8h 更换一次透析液。 3.10. 柱层析结果 将经过充分溶胀的 SephadexG-75 装柱，色谱柱 直径 24 cm，柱高 20 cm，0.05mol/LpH 8.0 的PBS 液 进行平衡。平衡后，取 lmL已经过透析处理的酶液上 样，0.05 mol/LpH 8.0 的PBS 液进行洗脱，流速为 0.4 mL/ m in ，观测洗脱峰，并进行收集，结果见图 6。 从图 6可以看出，ALDH 透析液经过 Sephadex G-75 凝胶柱层析后，280 nm波长处检出两个明显的 蛋白质峰。收集出峰处各管的溶液，检测其酶活性， 图6中的 15~18 管均检测出有 ALDH活性，说明 ALDH 大部分集中在第一个蛋白吸收峰。 经过盐析，透析，柱层析分离纯化后，酶液的 ALDH 活力和比活力测定结果如表 4所示。 从表 4可以看出，从低糖型酵母中提取 ALDH 后， 经过盐析，透析，Sephadex G-75柱层析和经过盐析， 其纯化倍数可达 2.562，以及经过盐析和 Sephadex G-75 柱层析后，其纯化倍数可达 2.576。后者的纯化 倍数更高于前者，并且 ALDH 经过透析后比活力有所 降低，可能原因是 ALDH 长时间在盐溶液里容易失去 活力。 4. 结论 通过超声破碎法从酵母细胞中提取 ALDH并检 测所得产物的 ALDH 活力，并采用硫酸铵盐析沉淀 法、柱层析法对所得到的乙醇脱氢酶粗酶液分别进行 分离纯化，得以下结论： 1) 考察了料液比、样品处理量、提取液 pH、超 声功率、超声全程时间对低糖型酵母中 ALDH提取工 艺的影响，并就其中的主要影响因素进行了 L9(33)正 交试验。 提取低糖型干酵母中 ALDH 的最佳 工艺为：料液 比1:4、处 理量20 ml、提取缓冲液的 pH 值8.0、超 声 功率 300 W、超声全程时间16 min，在此最佳工艺下 获得的 ALDH 粗酶提取液的 ALDH 活力高达 3.56 U/mL。 2) 低糖型酵母ALDH 粗酶液采用 40%饱和度的 硫酸铵溶液进行初步除杂，75%饱和度的硫酸铵溶液 进行二次除杂，选用分子量为8000~10000 的透析袋 进行透析。将盐析液和透析液分别经Sephadex G-75  超声波破碎法从干酵母中提取乙醛脱氢酶及其分离纯化的研究 Ta ble 3. Determination of enzyme activity a fter second precipitation of ammonium sulfate 表3. 硫酸铵进一步沉淀后 ALDH 活力的测定结果 管号 1 2 3 4 5 6 硫酸铵饱和度（%） 0 40 70 75 80 90 粗酶液(mL) 5 5 5 5 5 5 加入硫酸铵(g) 0 1.215 1.145 1.365 1.59 2.095 ALDH 活力(U/mL) 3.762 0.295 2.643 2.740 2.248 2.075 比活力(U/mg) 0.491 0.071 1.005 1.079 0.848 0.737 Figure 6. Protein absorption peak of dialysis liquid 图6. 透析液的蛋白吸收峰 Table 4. The result of ALDH purification 表4. ALDH的纯化结果 粗酶液 盐析液 透析液 盐析液过柱后的酶液 透析析液过柱后的酶液 ALDH 活力(U/mL) 3.534 2.567 1.061 0.113 0.046 比活力(U/mL) 0.484 1.056 0.727 1.247 1.240 纯化倍数 0 2.182 1.501 2.576 2.562 色谱柱进行柱层析。经过盐析、透析、Sephadex G-75 柱层析后，其纯化倍数可达2.562，比活力达到1.24。 参考文献 (References) [1] Kelson, T.L., McVoy, J.R.S. and Rizzo, W.B. (1997) Human liver fatty aldehyde dehydrogenase:microsomal localization, pu- rification, and biochemical characterization. Biochimica et Bio- physica Acta (BBA), 1335, 99-110. [2] Moon, K.H., Abdelmegeed, M.A. and Song, B.J. 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