¹青岛大学医学部，山东 青岛

²青岛大学附属青岛市中心医院呼吸与危重症医学科，山东 青岛

收稿日期：2023年9月17日；录用日期：2023年10月11日；发布日期：2023年10月17日

摘要

目的：本研究旨在比较肺泡灌洗联合宏基因组二代测序(mNGS)与传统的病原检测方法在诊断肺癌合并耶氏肺孢子菌肺炎(PJP)方面的价值。方法：我们纳入了青岛大学附属青岛市中心医院2020年12月至2022年8月期间住院的17例肺癌患者的临床数据，这些患者通过mNGS辅助并经临床复合诊断为PJP。我们分析了这些患者的临床特征，并评估了mNGS在肺癌患者中诊断PJP的价值。结果：与1-3-β-D-葡聚糖测定和传统的病原菌涂片培养相比，mNGS对于耶氏肺孢子菌(Pj)的检出率明显更高。这表明mNGS可以作为辅助诊断肺癌患者PJP的工具。Pj序列数与CRP呈正相关(rs = 0.537, P = 0.026)。结论：肺泡灌洗联合mNGS在诊断肺癌患者PJP方面具有一定优势。相比传统的检测方法，mNGS更快速、检出率更高，并且在识别Pj共感染方面表现出明显的优越性。因此，mNGS在临床治疗上具有更大的指导作用，并可为患者预后带来一定的收益。

关键词

宏基因组二代测序，耶氏肺孢子菌肺炎，肺癌，免疫功能受损

Evaluation of the Clinical Value of mNGS in the Auxiliary Diagnosis of Pneumocystis jirovecii Pneumonia in 17 Patients with Lung Cancer

Luyao Chen¹, Binbin Qu², Yahui Xu², Chunling Zhang^2*

¹Medical College of Qingdao University, Qingdao Shandong

²Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Affiliated Qingdao Central Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong

Received: Sep. 17^th, 2023; accepted: Oct. 11^th, 2023; published: Oct. 17^th, 2023

ABSTRACT

Objective: This study aims to compare the value of bronchoalveolar lavage combined with metagenomic next-generation sequencing (mNGS) and traditional pathogen detection methods in diagnosing lung cancer complicated with Pneumocystis jirovecii pneumonia (PJP). Methods: We included clinical data from 17 hospitalized lung cancer patients at the Affiliated Qingdao Central Hospital of Qingdao University from December 2020 to August 2022. These patients were diagnosed with PJP through mNGS assistance and clinical composite diagnosis. We analyzed the clinical characteristics of these patients and evaluated the value of mNGS in diagnosing PJP in lung cancer patients. Results: Compared with 1-3-β-d-glucan assay and traditional pathogenic microorganism smear culture, mNGS showed a significantly higher detection rate for Pneumocystis jirovecii (Pj). This indicates that mNGS can be used as an auxiliary tool for diagnosing PJP in lung cancer patients. The number of Pj sequences was positively correlated with CRP levels (rs = 0.537, P = 0.026). Conclusion: Bronchoalveolar lavage combined with mNGS has certain advantages in diagnosing PJP in lung cancer patients. Compared to traditional detection methods, mNGS is faster, has a higher detection rate, and demonstrates significant superiority in identifying co-infections by Pj. Therefore, mNGS plays a greater guiding role in clinical treatment and can bring certain benefits to patient prognosis.

Keywords:Metagenomic Next-Generation Sequencing (mNGS), Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii) Pneumonia, Lung Cancer, Impaired Immune Function

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

耶氏肺孢子虫肺炎(PJP)常见于晚期人类免疫缺陷病毒(HIV)患者，但随着医疗技术的进步，免疫抑制的人群逐渐增加，非HIV PJP患者数量也呈现明显的上升趋势。与HIV-PJP相比，非HIV PJP更易导致肺泡损伤和呼吸衰竭，可迅速发展为重症肺炎，导致极高的死亡率 [1] [2] [3] 。肺癌是全球发病人数及死亡人数最高的肿瘤 [4] ，尽管由于新型靶向疗法的应用和规范医疗的普及，存活率有所提高，1年内生存率由30年前的20%左右提高至目前的30%以上 [5] 。但治疗引起的免疫功能低下所导致的肺炎同肺癌进展本身均影响患者的生存及预后 [6] 。基于非HIVPJP的非特异性、进展迅速且易合并混合感染特点，快速准确的病原体诊断和及时的治疗对于预后改善极为重要 [7] 。宏基因组二代测序(mNGS)作为一种无偏倚、高通量的病原检测方法，近些年越来越多地应用于临床肺部感染性疾病的诊断 [8] ，尤其在混合性、罕见性肺部感染病原微生物的检测中独具优势 [9] 。本研究分析了青岛大学附属青岛市中心医院收治的17例通过mNGS辅助且经临床复合诊断为PJP的肺癌患者的临床症状、常规生化检测、微生物培养和mNGS结果，评估与传统病原检测方法相比，肺泡灌洗联合mNGS对于PJP在肺癌患者中的诊断价值。此外，我们还旨在对肺癌合并PJP患者相关特点进行分析。

2. 资料与方法

2.1. 研究对象

2020年12月至2022年08月，在青岛大学附属青岛市中心医院住院治疗的17例患者符合以下入组标准：1) 年龄 > 18岁；2) 排除HIV感染；3) 在本院住院治疗；4) 经病理确诊为肺癌；5) 进行肺泡灌洗且灌洗液经mNGS检测检出耶氏肺孢子菌(Pj)序列并经临床复合诊断为PJP。

2.2. 研究方法

2.2.1. 临床数据收集

采用回顾性分析方法，收集并分析入组患者的各项临床资料，包括性别、年龄、基础疾病、症状、传统呼吸道标本病原体检测结果、宏基因组二代测序结果、实验室化验、影像学检查、治疗及预后等。

2.2.2. BALF采集及mNGS送检

所有患者均进行支气管镜检查，在病变部位行支气管肺泡灌洗，并按照标准流程留取灌洗液5~10 mL，然后将样本于24小时内专人送至第三方测序中心(因美纳-illumina)。将送检样本提取微生物群落DNA后，通过质量控制(QC)鉴定，将DNA随机片段化并制成测序文库，然后在NextSeqTM550Dx (因美纳-illumina)上进行测序。对于原始数据超过10万的样品，进行生物信息学分析以去除低质量和低复杂性的区域。使用Burrows-Wheeler比对将人源基因组序列去除，然后通过与NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)的四个微生物基因组数据库(包括病毒、细菌、真菌和寄生虫)比对进行分类和排列。

2.3. 统计分析

所有连续变量均表示为中位数，采用Mann-Whitney U检验比较两组间连续变量的差异，采用卡方检验比较两组间离散变量的差异，采用Spearman等级相关分析相关性。P值 < 0.05的连续变量具有统计学意义，所有检验均为双尾。所有统计分析均使用SPSS 26.0软件进行。

3. 结果

3.1. 基本信息

入组患者共17例。患者中13例为男性(76.47%)，4例为女性(23.53%)。中位年龄为63岁(47岁至76岁)，且均在3个月内进行过放化疗或免疫治疗，其中肺鳞癌4例，肺腺癌8例，肺小细胞癌4例，肺大细胞癌1例。

3.2. 临床特征、检查结果及预后

进行性呼吸困难(58.82%)、咳嗽(70.59%)、咳痰(70.59%)、发热(58.82%)是肺癌合并PJP患者的常见症状，其中发热均为中高热，咳痰均为咳少量粘痰。患者均有不同程度的血氧饱和度降低。其中15例患者入院后通过CD4+T细胞计数行免疫功能评估，其中9例CD4+T细胞计数 < 200/μL，水平中位数为161/μL (9~2702/μL)。CRP水平中位数为56.99 mg/L，(14.09~209.13 mg/L)、PCT水平中位数为0.225 ng/mL，(0.07~3.99 ng/mL)。PJP在影像学上13例呈双肺弥漫分布斑片影或磨玻璃影；其余呈间质性改变。所有患者在采样前均进行抗感染药物治疗，但仅有3例(17.65%)患者在采样前经验性应用抗肺孢子菌药物治疗。

3.3. mNGS

患者自出现相关症状至行支气管镜肺泡灌洗送检的中位天数为10天(4~66天)。在通过mNGS诊断为PJP的17例患者中，Pj DNA基因组的序列数从3到76540不等，Pj序列的水平中位数为371，丰度从0.2至100 (见图1)。个体间Pj序列存在较大差异，且不同个体的序列数与G试验数值、CD4+T细胞计数、CD8+T细胞计数、血氧饱和度、症状出现支气管镜灌洗送检天数、PCT均无明显相关性(P > 0.05)，与CRP呈正相关(P < 0.05) (见表1)。PJP常见于免疫低下患者，常并发混合感染，混合感染情况如下(见图2)，排除定植病原体后，ngs检出其他微生物情况如下(见图3)，Pj最常合并感染的3种病原体为EB病毒、巨细胞病毒、细环病毒。

图1. 17例患者Pj序列数及相对丰度

表1. 肺孢子菌序列与实验室检查相关性分析

图2. 17例肺癌合并耶氏肺孢子菌肺炎患者混合感染情况

图3. 通过mNGS识别出的共感染病原体情况

3.4. 血清1-3-β-D-葡聚糖、传统病原涂片及培养、mNGS对PJP诊断价值比较

我们比较了血清1-3-β-D-葡聚糖、病原体涂片及培养、mNGS在17例PJP患者中的诊断价值，其中1-3-β-D-葡聚糖检测阳性为9例(52.94%)。病原体涂片及培养仅有1例在痰液培养中检出酵母样真菌，1例在肺泡灌洗液涂片及培养中检出酵母样真菌，但均受限于实验室条件未行进一步区分，因此对临床指导作用较小。然而，我们通过mNGS在17例(100%)中患者均检测到Pj。因此研究表明，mNGS对耶氏肺孢子菌感染的检出率较高，这也证实了临床mNGS性能有助于感染诊断，可有效指导临床用药。

4. 讨论

PJP在过去常见于HIV患者，但由于免疫损害原因的流行，非HIV感染患者中的PJP发病率逐年增加 [10] 。相对于非HIV患者，患有PJP的患者通常年龄更大，病情进展更快，治疗开始更晚，且需要更多的重症监护和有创呼吸支持，因此死亡率更高 [2] ，所以早期诊断和治疗就变得非常重要。

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤 [4] ，尽管由于新型靶向疗法的应用和规范医疗的普及，存活率有所提高，1年内生存率由30年前的20%左右提高至目前的30%以上 [5] 。然而，肺癌治疗引起的免疫功能低下和肺炎本身对患者的生存和预后都有影响 [6] 。

然而，PJP的临床表现并不具有特异性，特别是在合并肺癌时症状更加隐匿，确诊需要依赖于传统检测方法，如培养、乌洛托品银染色、免疫荧光染色，以及1-3-β-D-葡聚糖检测可以提示耶氏肺孢子菌的存在 [11] 。传统的PJP诊断方法主要依赖于样本中生物体形态的染色和可视化，已经被证明不够敏感且存在偏见 [12] 。而血清-1-3-β-D-葡聚糖的测定虽然具有一定的敏感性，但其特异性不够 [13] 。由于传统方法诊断的不确定性和低效率，临床治疗经常会被延误，对患者的预后产生不良影响。因此，对于合并肺癌的PJP患者，一种准确率高、检测时间短、不带主观性的检测方法非常重要 [14] 。mNGS具备了上述优点，同时还具有高通量的特点，对于感染性疾病的准确诊断起着非常重要的作用 [15] 。此外，本研究发现与CRP呈正相关(rs = 0.537, P = 0.026)，可能意味着患者体内病原体载量越大，其致病力越强，肺部的炎症性损伤也更严重。

而与免疫功能正常的患者相比，肺癌放化疗后免疫功能低下的患者更容易发生混合感染，并且感染的病原体数量更多 [16] 。传统的病原学检测方法通常只能检测到单一的病原体，而mNGS由于其无偏倚的高通量技术，可以同时检测多种病原体，因此在合并感染的诊断中更具有优势 [17] [18] 。本研究发现，与CMTs相比，mNGS在识别混合感染和检测PJP合并感染的其他病原体方面具有更高的检出率和更广泛的病原体检测谱，这与之前的研究结果相似 [14] 。这些结果都表明，相比于CMTs，mNGS在检测混合肺部感染和PJP的共病原体方面具有更大的优势。

非HIV PJP患者的院内死亡率明显高于HIV患者，通常超过30%，包括肺癌在内的实体器官肿瘤患者合并PJP的死亡率甚至可以达到40%以上 [2] [3] [19] 。在我们的研究中，通过肺泡灌洗联合宏基因组二代测序技术进行早期诊断，肺癌合并PJP患者的院内死亡率为11.76%，这表明该辅助诊断方法确实对患者的治疗和预后有一定的好处。

我们的研究也有一些局限性。首先，作为一项单中心回顾性研究，由于入组患者较少，可能存在一定的偏倚，需要进一步开展多中心研究。其次，对于PJP的诊断，缺乏六胺银染色和PCR评估CMTs和mNGS的诊断价值，因此只能在讨论中通过已有文献补充相关信息。最后，由于研究中病例数量的限制，无法进一步探索针对于肺癌患者PJP诊断的mNGS序列阈值，需要进行进一步的研究。

总之，肺泡灌洗联合mNGS对于肺癌患者合并PJP的诊断具有一定的优势，它比传统检测方法更快，检出率更高，同时在识别PJP的共病原体方面表现出明显的优势，因此在临床治疗中具有更大的指导作用，并对患者的预后带来一定的好处。

声明

本试验获得伦理委员会批准(受理号为KY202206601)及受试者知情同意。

文章引用

陈璐瑶,曲斌斌,许亚慧,张春玲. mNGS辅助诊断耶氏肺孢子菌肺炎在17例肺癌患者中的临床价值评估
Evaluation of the Clinical Value of mNGS in the Auxiliary Diagnosis of Pneumocystis jirovecii Pneumonia in 17 Patients with Lung Cancer[J]. 临床医学进展, 2023, 13(10): 16135-16141. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.13102255

参考文献