Botanical Research 植物学研究, 201 4, 3, 1-9 http://dx.doi.org/10.12677/br.2014.31001 Published Online January 2014 (http://www.hanspub.org/journal/br.html) OPEN ACCESS 1 The Applications of Chloroplast Genome Analysis in Plant System Development Hui Zhou1, Shengli Jin2, Gang Li1, Lei Zhang1, Rui Qin1, Hong Liu1* 1Eng ineering Resear ch Center of Protection and Utilization for Biological Resources in Minority Regions, South-Central University for Nationalities, Wuhan 2State Key Laboratory of Hybrid Rice, Colleg e of Life Science, Wuhan Universi ty, Wuhan Email: *liuhong@mail.scuec.edu.cn Received: Oct. 8th, 2013; revised : Nov. 12th, 2013; accepted: Nov. 25th, 2013 Copyright © 2014 Hui Zhou et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the ori gina l work i s prop erly cited. In accordance of the Creative Commons Attribution License all Copyrights © 2014 are res erved fo r Ha n s an d th e owner of t h e int ell e c tu a l prop er ty Hui Zhou et a l. All Copyright © 2014 are guarded by law and by Hans as a guardian. Abstract: Chloroplast is a specific organelle structure of green plants and algae microorganisms, which is widely used in comparative genomics and plant system development. In this paper, according to the charac- teristics of chlor oplast genome, we analyzed the applications of chloroplast genes including encoding genes: rbcL, makt, rps4 and Ndhhf; non-coding region interval sequences: trnF-L, rps4-trns and psbA-trnH; non-coding introns: rpl16 and rps16. We also analyzed the principle, metho d, application, advantages and disadvantages of chloropla st DNA technologie s in plant s yst em development . Keywords: Chloropla st Genome; P lant System Development ; DNA Analysis T echnology 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 周 会1，荆胜利 2，李 刚1，张 磊1，覃 瑞1，刘 虹1* 1中南民族大学，南方少数民族地区生物资源保护及综合利用工程中心，武汉 2武汉大学生命科学学院，杂交水稻国家重点实验室，武汉 Email: *liuhong@mail.scuec.edu.cn 收稿日期：2013年10 月8日；修回日期：2013年11 月12日；录用日期：2013年11 月25 日 摘 要：叶绿体是所有绿色植物和藻类微生物特有的细胞器结构，其基因组信息被广泛运用于比较基 因组学和植物系统发育研究。本文对叶绿体基因组的结构特征，包括编码区基因如 rbcL、makt、rps4 和Ndhhf 等叶绿体基因，非编码区中的间隔序列 trnF-L、rps4-trns 和psbA-trnH 等以及内含子 rpl16、 rps16 等在内的叶绿体基因组应用于植物系统发育方面研究概况与进展进行了概述，探讨了叶绿体各 种DNA 分析技术的原理、方法、应用及其优缺点，并展望了叶绿体基因组分析在植物系统发育中的 应用前景。 关键词：叶绿体基因组；植物系统发育；DNA 分析技术 1. 引言 当前，在对植物系统发育研究中，主要从传粉方 式、繁育、化石以及分子水平上对包括叶绿体，线粒 体与核基因组的分析比较来进行。由于叶绿体基因组 (chloroplastDNA, cpDNA)是仅次于核基因组的第二大 *通讯作者。 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 OPEN ACCESS 2 基因组且叶绿体的核酸置换率适中，故植物叶绿体基 因组在种及种以上较高阶元的系统发育研究有着显 著的优势，加上叶绿体基因组较小，均为闭环的双链 DNA，总量约占植物总 DNA 量的 10%~20%，长度在 120~210 kb 之间[1]，在分子水平上差异明显，多为单 拷贝序列，在序列与结构上都是相当保守的，分子性 状的同源关系更容易确定。此外 cpDNA 的编码区和 非编码区的分子进化速度差异显著，具有独立的进化 路线，可适用于不同层次的系统学研究，不依赖其他 数据就可以用于构建系统进化树，从而保证了类群间 的可比性。 2. 在植物系统发育方面常用的叶绿体 DNA 分析技术 2.1. cpDNA 的限制性内切酶酶切图谱分析法 大多数叶绿体(高等植物叶绿体)基因组长度变异 主要由 2个反向重复序列(inverted repeats, IR)引起的。 这2个反向重复序列长约 22~25 kb，并将整个 cpDNA 分为一个长单拷贝区(large single copy, LSC)和一个短 单拷贝区(small single copy, SSC)[2]，由于不同物种的 cpDNA 识别特定限制性内切酶的位点位置不同，所以 得到的片段长度不同，通过比较，可用来研究物种间 的亲缘关系。植物 cpDNA 的所有酶切位点位置的简 图的研究，通过将植物的叶绿体中提取和纯化的 cpDNA 分别用不同的限制性内切酶消化，并用凝胶电 泳分离消解 DNA 片段，然后比较不同个体、群体或 种间的差异，再依据这些数据构建系统进化树。对于 那些不易提纯 cpDNA 的植物的研究，采取从叶片中 提取总 DNA 的方法，同样地用限制性内切酶消化并 凝胶电泳，将分离的 DNA 片段转移到滤膜上，与含 有叶绿体基因的片段(即探针)杂交，最后比较杂交带 谱的差异进而构建系统进化树。因为叶绿体基因组相 对较小，易于提纯，异质性弱，并且在进化上比较保 守，所以 cpDNA 限制性酶切图谱分析法在不同的植 物演化水平上都得到了广泛的应用，为探讨植物间的 亲缘关系提供了极珍贵的信息。 Kato 等[3]用7种限制性内切酶构建了红小豆 (Vigna umbellate)的限制性内切酶图谱，发现它的杂草 型类群在大单拷贝区由于重复序列分子内重组导致 了一个 96bp 的缺失，这在遗传学上研究植物系统进 化有着重要意义。彭隽敏等[4]对云南小麦、西藏半野 生小麦及普通小麦的酶切图谱作了分析，结果表明它 们之间虽属于不同的亚种，形态差异明显，但是它们 的cpDNA 的进化仍然处于同一水平，这为研究它们 之间的亲缘关系提供了有力的依据，同时也说明了 cpDNA 在进化上比较保守，不易发生变异。另外，此 方法还可用于证实天然准性杂种和研究多倍体的起 源。Kim 等[5]对Krigia 属做的酶切图谱表明二倍体 K. biflora 和四倍体 K. montata 可能是六倍体 K. montata 的亲本种，并通过ITS 序列证明了此观点，从而弄清 了该物种的起源途径。 2.2. DNA 杂交技术 不同物种 DNA 之间退火的不同程度可用来衡量 DNA 的同源性，从而推导物种间的亲缘关系。DNA 杂交可分为滤膜杂交和溶液杂交两种。由于液相杂交 比较简便，快捷，在植物系统学研究中应用较多。在 溶液中 DNA分子的热稳定性或熔解温度(Tm)与两条 子链的互补性成正相关关系，且杂交 DNA 分子的 Tm 值低于同源 DNA 分子的，通过测定同源 DNA 分子和 杂交 DNA 分子的 Tm值，就可推测和比较不同类群 DNA 间相同序列区域所占的比例，进而判断它们之间 亲缘关系的远近[1]。因而 cpDNA 杂交技术可应用于推 测植物科、属、种的系统发育及种的分化形成时期等 方面的研究。将待测物种 cpDNA 提取出来，经过适 当的酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片 段分开；然后将凝胶上的 DNA 片段转移到硝酸纤维 素膜上；再用放射性同位素标记的另一物种 cpDNA 片段作为探针与硝酸纤维素膜上的 DNA 进行杂交， 然后再测定它们之间的 Tm 值，比较数据。 通过来自一种叶绿体基因组的克隆片段与另一 种结合在滤膜上的 DNA进行的异源滤膜杂交，发现 碧冬茄属和芸苔属的叶绿体基因组内没有重排，而绿 豆属的基因组中有一个约 50 kb 的倒位[6]。Palmer等 利用 DNA 杂交技术发现，在豆科蝶形花亚科的 6个 族和 12 个属中都有一个 50 kb的大倒位，禾本科的 3 个属都有一个 20 kb 的倒位，菊科的 6个属都有一个 30 kb 的倒位[7]。但由于该技术实验步骤繁琐，获得的 杂交资料难以定性，很难排除错配、插入和丢失等因 素的影响，且对 DNA 样品量的要求大，又因为存在 同位素的安全性问题，所以应用受到限制。 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 OPEN ACCESS 3 2.3. 核酸顺序分析 核酸分子包含着生物遗传信息的同时也记载着 生物进化的历史，即核酸结构不仅指导生物的形态建 成和个体发育，而且还能够反映生物之间的亲缘关系。 这种技术是生物遗传物质最全面，最彻底的比较，可 用于任何等级水平(包括科级，属级，种级等)亲缘关 系的研究。通过生成互相独立的若干组带放射性标记 的寡核苷酸(每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机 终止于特定的一种或者多种残基上)，由于 DNA 上的 每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述 每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸 的长度由某一种特定碱基在原 DNA 全片段上的位置 决定。在可区分长度仅差一个核苷酸的不同 DNA 分 子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把 几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道 上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出 DNA 上的 核苷酸顺序，因此 DNA序列分析是检测遗传物质变 异最直接的方法。 俸宇星等[8]测定了悬铃木科(Platanaceae)和金镂 梅科(Hamamelidaceae)5 个亚科 6个代表种的 rbcL 基 因序列，对低等金镂梅植物及新近的相关类群进行了 分子系统发育分析，获得了四个最简约树，简约树的 步长为 893，其 CI 值和 RI值分别为 0.558 和0.591， 为金镂梅科植物的系统发育研究提供了依据。张文衡[9] 对广义川续目(Dipsacaless)的21 种植物 cpDNA 的 trnL-F 区进行了测序，并建立了系统发育树状图，结 果显示，败酱科、川续断科、双参属、刺参属和广义 忍冬科的 4个属(双盾木属 Dipelta、虫胃实属 Kolkwitzia、六道木属 Abelia 和北极花属 Linnaea)形成 了一个单系群；双参属和川续断科之间有着更近的关 系，并建议将其作为一个亚科置于川续断科；广义忍 冬科为一多系类群。Zhang 等[10]利用新一代测序技术 对六种木本竹类的叶绿体全基因组进行了测序，并结 合已测序的 18 个禾本科叶绿体全基因组进行了系统 发育分析，以此评估叶绿体系统发育基因组学在竹亚 科植物系统发育重建中的有效性。研究结果在叶绿体 基因组水平上证实了禾本科BEP分支中竹亚科和早 熟禾亚科为姊妹关系。与传统的分子系统学研究结果 相比，Zeng 等[11]利用叶绿体全基因组序列所构建的系 统发育树在竹亚科内部具有更高的分辨率和支持率。 由此可见核酸顺序分析对揭示植物系统进化的分子 规律有着极其重要的作用。但是这是一项相当艰巨的 工作且 DNA 测序工作的难易程度及成本与片段长度 有密切关系，在短时间内还很难广泛地应用到植物系 统学研究上，但是随着新一代测序技术的发展，测序 技术的产业化，成本降低，相信伴随着测序技术的发 展，叶绿体系统发育基因组学在低阶元系统分类中的 应用价值将得到更多的体现。 2.4. RFLP 分析 RFLP 分析即限制性内切酶酶切片段长度多态 性分析指用限制性内切酶处理不同生物个体的 DNA 所产生的大分子片段的大小差异，是目前植物 系统发育研究中使用较多的一种 DNA 分析技术。植 物在长期进化过程中，种属间甚至品种间同源 DNA 序列上的限制性内切酶识别位点不同或者由于点突 变、重组等原因，引起限制性内切酶识别位点上核 苷酸的替换、插入或缺失变化从而引起DNA 线性分 子某一特定内切酶的识别位点发生变化，通过处理 可得到限制性内切酶酶切片段长度多态性。此技术 需将待研究的植物 cpDNA 经适当的限制性内切酶切 割成不同的限制性片段，再通过凝胶电泳，由于不 同大小的DNA 片段在凝胶上的泳动速率不同，在凝 胶上便形成了连续涂片，然后经Southern 杂交、放 射自显影得到DNA 的RFLP。由于RFLP 来源于基 因组 DNA 的变异、不受显隐性关系、环境条件和发 育阶段的影响，具有稳定遗传和特异性的特点，可 以获得能够反映种属遗传差异的大量多态性，故可 用来研究植物类群特别是属间、种间甚至品种间的 亲缘关系、系统发育和演化[1]。 Remiaw[12]利用 RFLP 分析技术证明：如果利用总 的cpDNA 作探针，与消化的总基因组进行 southern 杂交，可对 cpDNA的保守区和可变区同时进行分析， 从而能获得丰富的多态性，可为各种水平上的系统重 建提供信息。Wattier 等[13]用标记的总 cpDNA 作探针， 对Ceramium 属的两种红藻做 RFLP 分析，在种内发 现了 cpDNA 存在多态性，并在种的水平上对两种红 藻进行了系统发育研究。近年来，已有多项研究运用 cpDNA-RFLP 分析来探索微进化过程，包括被子植物 的遗传结构、杂种地带、种系地理学等方面。 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 OPEN ACCESS 4 2.5. PCR-RFLP 分析 根据保守序列设计出通用引物再通过 PCR 反应 扩增出特定基因，然后酶切纯化扩增片段。由于扩增 的长度不大，经溴化已锭染色即可观察到限制性片段 长度多态性。根据需要可选择少数基因或个别基因， 用尽可能多的酶进行酶切，以获得单一基因的多限制 性内切酶酶切片段长度多态性信息，根据需要有时可 通过切点的拼接读出完整的基因序列。也可选择较多 的基因，用少量的酶分析可获得多基因的限制性内切 酶片段长度多态性信息。从代表性角度看，多基因分 析方法优于单一基因序列分析的方法。 Wang Xi ao -ru 等[14]对松科 7属、38种植物的 4个 cpDNA 基因进行 PCR-RFLP 分析，提示了很多重要 类群的系统位置并构建了系统树。Ciprian 等运用 PCR-RFLP 方法对猕猴桃属 20 个种群的5个cpDNA 基因进行了研究，发现至少有 3个物种起源于种间的 自然杂交[15]。由于 PCR-RFLP 分析不需提纯 cpDNA， 且不需要使用放射性元素或其它标记物，不受同位素 半衰期的限制，从而减少实验室的污染；需要的植物 材料很少，提取小于 50 mg 的植物材料中的总 DNA 即可满足 PCR 的需要量，20~25 个循环，从理论上 就可以将靶序列扩增约 104 倍，即可检测出在总 DNA 中仅存在 1/1013量的单拷贝序列；其次对植物材料要 求不高，新鲜的叶片、快速干燥的叶片或保存较好的 化石均可以用于总 DNA的提取；再者扩增产物的特 异性高，使得分析结果更为可靠。故此技术是目前叶 绿体 DNA系统学分析中使用最广泛的，也是遗传研 究、物种鉴别、种间杂种品系鉴定、物种混杂分析等 的有力工具。 2.6. 微卫星序列分析 真核生物基因组中，微卫星(短序列)是一类由 1~6 个碱基为重复单位串联而成的短片段，长度一般小于 100 bp，整个基因组都有分布，其上各位点不同等位 基因的重复单位的数目高度变异，而且重复单位的序 列可能也不完全相同，因而微卫星序列有高度的多态 性。微卫星序列分析一般采用聚合酶链反应扩增相应 的cpDNA 的微卫星 DNA，扩增产物经纯化、测序反 应、上机测序等步骤进行序列分析，得到微卫星序列 多态性。微卫星序列分析在区别亲缘关系很近的基因 型上优势明显：1) 不需要用限制性酶切分析长度变化 可直接可以在胶上显示出来。2) 在同一凝胶泳道上可 对几个位点同时分析，而得出叶绿体单元型数据。3) 叶绿体单元型和微卫星等位基因可通过荧光标记的 多重 PCR 同时分析及对单亲遗传标记和双亲遗传标 记同时进行分析，在对种群间基因流动、渐渗杂交、 多倍体起源等方面起着重要作用。但是微卫星序列在 叶绿体细胞器基因组中比较罕见，进一步广泛应用受 到引物设计的限制，需以叶绿体微卫星序列两侧的共 有序列作为引物队，从而在不同的植物之间扩增出叶 绿体微卫星序列，当然还有其他的方法。再者由于单 核苷酸重复序列引起的长度多态性不一定适合于探 索物种之间的系统发育关系，特别是当物种本身在该 区域内存在高突变率或为平行演化时。 kurt 等[16]设计了10 对共有序列的引物队，其中 8 对引物在双子叶被子植物中普遍适用，并且揭示了叶绿 体微卫星序列在烟草(Nicotiana spp.)、番 茄 (Lycoper sicon spp.)、猕猴桃(Actinidia spp.)等各属植物种间、种内的多 态性，这表明以 cpDNA 微卫星序列两侧的共有序列作 为通用引物是可行的。Provan 等[17]在单子叶植物水稻 cpDNA 完全测序的基础上，设计了 6对引物，对 6种 野生型水稻类群和 12种栽培型水稻类群的微卫星序列 进行了分析，在种内水平上同样探测到显著的长度多态 性。 2.7. DNA 单链构像多态性(SSCP)分析 由于 DNA 链的碱基顺序不同，单链DNA 在自然 状态下会折叠弯曲形成一定的空间结构，不同物种的 cpDNA 的单链形成不同的空间结构，显示出多态性。 在SSCP 分析中，设计特异引物后用 PCR技术定点扩 增基因组上的某一目的序列，再将扩增片段变性处理 成为单链 DNA，最后进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电 泳。如果被扩增的目的片段任意一条 DNA 链中的碱 基序列发生变化，则可能会由于这种变化而影响其构 像和电泳迁移率使其带纹出现在电泳图谱不同位置， 从而显示不同生物个体的DNA 多态性。虽然 PCR-SSCP 分析是当前真核基因突变分析的一种十分 灵敏的方法，但是该技术比较复杂，对操作人员的技 术要求较高，故目前在叶绿体 DNA 系统学研究中还 没有得到很广泛应用。 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 OPEN ACCESS 5 对Bostrychia moritziana、B.tenuissim a、Caloglossa leprieurii 这3种热带红藻叶绿体 DNA 中编码 Rubisc o 大、小亚基基因之间的间隔区序列进行 PCR-SSLP 分 析，揭示了该序列在它们种内和种群内的多态性，并 且从地理学上构建了 C. leprieurii 的单元型多样性[18]。 Isoda 等对松科的A. veitchii 和A. homolepis的叶绿体 基因进行了 PCR -SSCP 分析，并配合其它的分子标记 技术，得出 A. veitchii 和A. homolepis能够产生自然杂 种的结论，并提出应该重新考虑它们间的系统关系[19]。 3. 叶绿体基因组系统发育分析常用序列 3.1. 叶绿体编码区基因分析 3.1.1. rbcL 基因 高等植物的 rbcL 基因在结构上和原核生物基因 相似，由 5'非编码区、编码区和 3'非编码区三部分组 成。5'非编码区具有可以和叶绿体 16SrRNA 3'端附近 互补的 SD序列；3'非编码区具反向重复序列，能形 成典型的茎环结构作为转录终止信号[20]；编码 1,5-二 磷酸核酮羧化酶/氧化酶的大亚基，以单拷贝的形式存 在，不发生基因转变，长达 1.4 kb，能提供较多的分 子性状，且由于核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶 (Rubisco)在光合作用中所起的关键作用，rbcL 基因的 进化速率慢[21]，比较适合远缘间及科级以上分类群的 系统关系的研究。Chase 等对 499 种种子植物的 rbcL 基因序列进行了分析，从而对整个种子植物进行系统 进行重建，他们构建的分支图为将来利用分子或非分 子性状重建系统发育提供了一个有用的框架[22]。 3.1.2. matK 基因 matK 基因编码酪氨酸蛋白激酶，是位于 trnk 基 因(叶绿体tRNA 编码基因)的内含子内的单一拷贝序 列，长约1500 个bp，参与RNA 转录中Ⅱ型内含子的 剪切。到目前为止，该基因被认为是所有编码蛋白基 因中进化速率最快的基因，且其序列变异较为均一， 在构建系统树时不必对不同类型的变异进行加权，极 大的增强了分子系统树的可靠性，在被子植物科、属 水平的近缘关系研究中已被使用[23]。此外，matK 基 因的 3'端较保守，而5'端相对多变，因此，3'端可用 于科间水平分析，而 5'端可用于科内、属间，甚至种 间的系统发育研究，整个基因均可以用来做多水平的 系统发育分析。吴世安等[24]对黄精族(Polygonateae)6 属13种的 matK 基因进行了 PCR-RFLP 分析，结果表 明：trnK 基因的 PCR 产物在各类群间几乎不存在长 度变异，均约 2600 bp，而rpl16 基因则在各属之间及 黄精属内表现出长度变异，变异范围在1140~1320 bp 之间；限制性酶切位点同源性分析显示，黄精属、鹿 药属、竹根七属和舞鹤草属组成的狭义黄精族与铃兰 族中的铃兰属有较近的亲缘关系，并支持了将扭柄花 属和万寿竹属从广义百合科黄精族中分出来的观点； 在狭义黄精族之内，鹿药属与舞鹤草属组成一支，黄 精属与竹根七属组成另一支，为探讨黄精族内属间的 系统演化关系提供了分子生物学上的依据。何兴金 等[25]对国产葱属(Allium)9 个组中的 18 个代表种的 matK 扩增产物进行了酶切分析，共获得 303 个酶切变 异位点，其中 163 个为信息位点。通过 PAUP (Ver- sion3.1.1)软件对所得的数据进一步分析表明：葱属可 分为 6个亚属级的分类阶元，对宽叶组的划分是合理 的；根茎组、单生组和洋葱组均是不自然的分类群， 得出应对该属下分类系统做相应的调整的结论[1]。 3.1.3. rps4基因 rps4 基因，长约600 bp，合成叶绿体中核糖核蛋 体小亚基(30 s)，与邻近的 rps4-trnS 基因间隔区片段 进化都较快，比较适合探讨属下等级的亲缘关系。 Nadot 等[26]选择了 39 种禾本科植物，28 种其他的单 子叶植物、11 种双子叶植物等，分别用这些植物的 rps4 基因进行了序列分析，并构建了系统树，结果发 现rps4 基因树和 rbcL 基因树是一致的，并证明了 rps4 基因在禾本科甚至在单子叶植物目级系统学研究中 都是一个很好的工具。 3.1.4. atpB 基因 atpB 基因是光合作用中的重要基因，编码ATP 合酶的 β亚基，进化速率与 rbcL 非常相似，其长度约 为1.5 kb，对其测序方便且能提供足够的系统发育信 息，适合于较高分类阶元的系统关系研究[27]。崔杰等[28] 在甜菜中扩增到一段全长为 2293 bp含有atpB 完整基 因的序列，其中包括 1497 bp 的编码区序列，推测其 编码 498 个氨基酸，并建立了氨基酸序列的系统进化 树[29]。 3.1.5. infA 基因 infA 基因是一个极其活跃的基因，编码一个约 70 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 OPEN ACCESS 6 个氨基酸的蛋白质翻译起始因子 IF1 (细胞器中蛋白 质翻译起始的重要组分)，参与核糖体蛋白 50S 亚基的 合成的 rpl36 基因，其变异率比 infA 基因低。由于其 基因收到的选择压力小，变异快，适合研究低阶元的 系统发育过程。刘畅等[30]利用小麦叶绿体基因组中 infA-rpL36 区域的序列设计引物，对小麦族的 12 个二 倍体和多倍体的物种进行了 infA 和rpl36 序列测定、 系统树的建立和分析。 3.1.6. nd hhF基因 ndhhF基因编码叶绿体中电子传递系统组分[31]， 通过异源杂交实验发现，在地钱，烟草和水稻上， cpDNA分子分别有 6个和7个基因与人的线粒体上的 DANH 脱氢酶亚基 ND1，2，3，4，4l，5和6的基因 同源。通过 Northern 杂交证明 ndhhF基因是活跃转录 的，可能编码了一些有功能的 NADH-泛醌氧化还原 酶，推测这些酶是属于叶绿体呼吸电子传递链的。由 于该基因与光合作用有关，受到的选择压力大，进化 速率较慢，因此在属以上的系统学研究中有一定的应 用价值[1]。 此外： trnK[31]，转录翻译系统基因，编码一种 tRNA， 适用于种以下的低阶元的系统发育研究[32]。 psbA 光合作用系统的基因，编码光系统 II 蛋白复 合体的中心重要组成部分，广泛使用于较高水平如属 以上水平的分子系统发育关系的比较[33]。 psbB，光合作用系统的基因，编码光系统 II 蛋白 复合体的组分。 ndhF，编码电子传递系统组分。 rps12和rps7，编码核糖核蛋白体小亚基组分， 通过烟草叶绿体相关序列设计引物，从杨树的叶绿体 基因组中克隆出 2个相邻的 DNA 片段，分析发现， 这2个DNA片段含有核糖体蛋白 3′rps12、rps7基因 和NADH 脱氢酶第二亚基 ndhB 基因片段。用 DNAMAN 等软件，将扩增的杨树叶绿体 DNA 片段与 烟草、拟南芥、玉米和黑松的相关序列进行比较，表 明所扩增的片段具有较高的保守性，尤其是在这 3个 基因的编码区，同源性都在 90%以上，插入或缺失常 发生在基因间隔区，同源性约 80%；对其编码区所推 导的氨基酸序列进行了比较，同源性均在 92%以上[34]。 ndhB[34]，编码电子传递系统组分。当然其它一些 基因在系统学中也有较好的应用。 3.2. 叶绿体非编码区基因 3.2.1. 间隔区序列 间隔区序列由于不受功能的限制，受到的选择压 力小，变异速度快，其进化速率约为编码区的 10 倍 左右[35]，因此对其扩增片段采用多重酶切等，则可产 生更丰富的多态性，从而确定种间、种内类群的关系。 如trnL-F 间隔区，在被子植物科下水平的系统学 研究中，trn L -F 间隔区的使用频率较高，它包含 trnL 内含子和 trnL-trnF 基因间隔区序列，尽管只有 800~1000 bp的长度，由于不受功能的限制，受外界 选择压力小，进化速率相对较快，可较好地用于属间 或属下等亲缘关系和系统位置的研究[36]。王玉金等[37] 测定了菊科风菊属 5个亚属 37 种植物和川木香属的 1 种样品的 trnL–F 序列，长度在 773~838 bp 之间，排 序后长 859 bp，当空位作缺失处理时，变异位点仅为 82 个，其中信息位点 21个(2.44%)，建了一个初步代 表整个属下形态的分类系统。侯鑫等[38]对小叶、中间 和柠条锦鸡儿的 trnL-F 片段进行直接测序，长度为 1009~1021 bp，对位排列后长度为 1053 bp，包括87 个变异位点，其中 54 个为信息位点，中间锦鸡儿与 小叶的序列完全一致，而与柠条有明显差异，据此进 行了它们的种间关系分析。 rps4-trnS 基因间隔区，该片段进化较快，比较适 合于研究属下等级的亲缘关系。陆树刚等[39]对篦齿蕨 及其近缘类群的 rps4-trnS 区的序列进行 PCR 扩增和 序列测定，对位排列后序列长度为 1278 bp，其中 525 个可变位点，312 个信息位点，探讨了篦齿蕨属的系 统位置。 psbA-trnH片段是位于叶绿体 DNA基因组上 psbA 和trnH 基因之间的一段长约 300 bp 的非编码序列， 其进化速率大大快于 matK 基因，可用于植物属间及 种间的系统发育研究[40]，孙华钦等[41]对不同类群薯蓣 种的 psbA-trnH 基因间区进行 PCR 扩增并测序，获得 了该区间的完整序列，在种间具有明显的较大差异， 并进行了分子系统学分析。 atpB-rbcL 间隔区在系统分析中也能有较好的应 用，可用于种属间系统发育的研究[42]，刘明珍等[43] 应用 atpB-rbcL 间隔区序列来评价蓝药蓼和大铜钱叶 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 OPEN ACCESS 7 蓼2个物种的亲缘关系和属的归属，发现该片段为 753~902 bp，种间差异很大，存在丰富的系统发育变 异位点，其中变异位点为 196 个，非信息位点 145 个， 用最大简约法寻找得到 1棵最简约树。 petG-trnP，一段位于 petG (细胞色素 b/f复合物) 和trnP (脯氨酸转运 RNA)基因之间的长约 320 bp 的 间隔序列，且 trn W (色氨酸转运 RNA，74bp)分隔成 两部分，已被广泛地应用于植物属间及种间的系统发 育研究[44]。 此外，petD-rpoA，trnD-Y，trnS-G，trnT-L 等大 量的非编码区在系统学上均有较好的应用，多被运用 于分子系统学方面。 3.2.2. 内含子 内含子不直接参与编码，收到的功能限制小，选 择压力小，进化速率快，相对于编码区而言可用于较 低阶元的研究。 rpl16：约 1000 kb，编码叶绿体中的核糖体蛋白， 其内含子序列的差异主要体现在长度上，由于 rpl16 在cpDNA 中被认为是进化最快的 DNA 片段之一，通 常用于科间和属间的分析[45,46]。杨俊波等应用 rpl16 等4个DNA 片段对山茶属的 21 种植物进行序列测定 和分析，建立的分子系统树支持山茶属为一单系这一 结论[47]。 rps16：编码核糖体蛋白 S16，位于植物 cpDNA 大单拷贝区，rps16 内含子一般适用于较高分类阶元 的系统发育研究[48]。在前人的基础之上，董文攀从不 同亚科不同属不同种上对叶绿体整个基因组进行了 系统的研究，从单个基因到整个叶绿体基因组，研究 出21 对叶绿体通用引物，并通过分析蜡梅科叶绿体 基因组的进化，探讨了被子植物叶绿体基因组插入/ 缺失、短片段倒位与重复等微结构变异式样，同时在 不同分类水平上探讨蜡梅科叶绿体基因组序列分化 [49]。 4. 叶绿体基因组用于植物系统 发育发展前景 分子生物学技术发展迅速，新的技术和方法层出 不穷，适于叶绿体基因研究植物系统发育的 DNA 分 析技术将会更多，实用性会更强，这将会为研究植物 的系统发育做出更大贡献。同时也需要研究者依据需 要结合各种技术的应用特点和使用范围，选择合适的 方法，以便得到最佳效果。但也存在许多问题。首先， 虽相同 cpDNA序列在不同类群间的进化速率有差异， 但序列本身在植物系统学研究中总有一相对稳定的 适用范围，这使其涵盖的研究内容和层次有限。其次， 虽然基因之间在序列变异方面存在较大差异，但一个 或少数几个基因片段提供的系统发育信息有限，构建 的系统树可能反映的仅仅是该片段的基因树，因在许 多情况下基因树并不等同于物种树，不一定代表真正 的物种系统发育关系。分子片段仅是分类群诸多性状 的一个来源，它虽然能为分类群的系统重建提供不可 忽视的信息，但并不能完全地反映其真实地历史演化。 再者，叶绿体基因组是母性遗传的，只能够帮助推断 杂交物种形成的母系来源并不能单靠叶绿体基因组 来解释种群间的杂交现象，虽然有越来越多的叶绿体 被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系，但只 有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信 息、传统的形态及生理特征结合起来，获得更多的信 息，才能更接近系统发育的真相[50]。将具有单亲遗传 特性的叶绿体和线粒体基因组与具有双亲遗传特性 的核基因组联系起来，有利于构建更加全面的系统进 化树。一般情况下，核基因树与叶绿体基因树是一致 的，但有时也会出现系统树冲突现象。由于核基因是 双亲遗传的，利用其序列变异探讨植物的系统发育过 程，特别是解决网状进化问题具有明显的优势，这在 一定程度上弥补了单遗传基因的不足，因此对于遗传 背景不同、进化速率不同的基因或 DNA 片段进行综 合分析，可望对所研究类群的系统发育提供更佳全面 的信息。 随着分子系统发育研究方法的深入，生物学家已 将生物信息大分子看作重要的演化依据，并在不断寻 找新的、检测功能良好的分子标记及检测手段，随着 技术的不断进步，来自分子方法的数据可能成为系统 学研究最主要的数据来源，并将引起分类、系统、发 育和进化研究中的又一次革命性的变化，而且关于种 群遗传结构方面的研究必将为保护生物学提供遗传 变异证据，在生物多样性的研究和保护中起到重要指 导作用[51]。 叶绿体编码区的变化会带来很大的表型改变，进 化速度较慢适用于较高阶元科、目乃至更高的系统发 叶绿体基因组分析在植物系统发育中的应用 OPEN ACCESS 8 育学研究；而非编码区的突变给表型带来的影响很小， 进化速度较快，适用于较低阶元种、属的系统发育学 研究，而其它各种 DNA序列虽已得到越来越广泛的 应用，但由于受许多因素如杂交和渗入、谱系分选、 水平转移、重组、位点间互作及致同进化等影响，使 得基于单一遗传位点 DNA 片段构建的基因树并不必 然与物种的真实进化途径相一致。另外叶绿体是母系 遗传，用叶绿体全基因组的结果更可能代表全基因组 (物种)的进化关系。基于上述特点，叶绿体基因组分 析在植物系统发育研究中成为不可或缺的研究内容。 新一代高通量测序技术给大量测定叶绿体基因组带 来了机遇，利用新一代测序技术高通量的优点，可在 较短时间内实现多个物种叶绿体基因组测序，为比较 叶绿体基因组学和系统发育叶绿体基因组学研究提 供更多的数据。本实验室在前人做的基础上对国内国 外34 个红花品种的叶绿体基因组进行了 PCR 扩増， 发现各个品种之间存在差异，可能预示着前人发现的 21 对引物不仅可用于高级元系统发育分析，也可用于 某些种的低级元分析如品种与品种之间。同时，还对 猕猴桃的不同品种进行了扩增分析，对前人的实验结 论进行了验证。 线粒体和叶绿体都具有内共生起源，所含的基因 数量少，无内含子，有自己的遗传物质和遗传体系， 母系遗传，为细胞提供能量的同时还参与诸如细胞分 化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细 胞生长和细胞周期的能力。与呼吸相关的基因可保持 一定的稳定性，虽然目前受技术的限制，随着技术的 不断更新，其在植物系统方面的应用范围将不断扩大。 本实验室也正致力于此方面的研究。 项目基金 湖北省自然科学基金(2010CDZ011)。 参考文献 (References) [1] 李健仔, 李思光, 罗玉萍, 万璐 (2002) 叶绿体 DNA 分析技 术及其在植物系统学研究中的应用. 江西科学 , 3, 183-189. 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