黑龙江中医药大学附属第一医院肛肠科，黑龙江 哈尔滨

收稿日期：2022年1月9日；录用日期：2022年2月3日；发布日期：2022年2月10日

摘要

目的：观察溃结灵IV号保留灌肠对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠黏膜claudin-2、ZO-1、ICAM-1、TLR2基因表达的影响，探讨其治疗UC的可能机制。方法：实验于2015年6~8月在哈尔滨工业大学生命科学与工程学院实验室进行。SD大鼠60只，留取10只作为空白对照(BC)组，其余大鼠利用TNBS溶液灌肠法诱导制作UC大鼠模型，造模后随机分为模型对照(MC)组，溃结灵IV号低剂量(LD)组、中剂量(MD)组、高剂量(HD)组和阳性对照组美沙拉嗓(PC)组。HD、MD、LD组分別采用溃结灵IV号高(40 g/kg)、中(20 g/kg)、低(10 g/kg) 3个剂量保留灌肠给药，PC组使用美沙拉嗪(0.4 g/kg)进行灌肠给药，BC组及MC组给等体积的蒸馏水，检测大鼠结肠黏膜claudin-2、ZO-1、ICAM-1、TLR2基因表达，观察溃结灵IV号保留灌肠对TNBS诱导的UC大鼠结肠组织的影响。结果：1) 闭合蛋白-2 (claudin-2)，mRNA的表达：经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在200 bp至250 bp位置可见电泳条带(Cldn2 244 bp)。结果表明溃结灵IV号高剂量、中剂量组及美沙拉嗪组claudin-2的mRNA表达明显增强，与空白组的表达接近，甚至略强于空白组的表达，模型组、溃结灵IV号高低剂量组claudin-2的mRNA略有的表达，表达不明显。2) 细胞粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule, ICAM-1) mRNA的表达：经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在200 bp至250 bp位置可见电泳条带(ICAM-1 211 bp)。结果表明正常组ICAM-1的mRNA表达不明，美沙拉嗪组ICAM-1的mRNA表达较正常组弱，溃结灵IV号高剂量、中剂量、低剂量及模型组ICAM-1的mRNA表达明显增强，明显高于空白组的表达。3) TLR2 (toll样受体2, Toll-like receptors 2) mRNA的表达：经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在200 bp至250 bp位置可见电泳条带(TLR2 246 bp)。结果表明正常组TLR2的mRNA表达较弱，美沙拉嗪组、溃结灵IV号高剂量、中剂量组TLR2的mRNA表达较模型组和溃结灵IV号低剂量组明显减弱，模型组和溃结灵IV号低剂量组TLR2的mRNA表达明显增强，明显高于正常组的表达。

关键词

溃结灵IV号，Claudin-2，ZO-1，ICAM-1，TLR2，美沙拉嗪

Effect of Kuijieling IV on the Expression of Claudin-2, ZO-1, ICAM-1 and TLR2 Genes in Colonic Mucosa of Rats with Ulcerative Colitis

Ningning Song, Limin Cheng^*, Xiaoxia Song, Aifeng Huang

Anorectal Department, The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang

Received: Jan. 9^th, 2022; accepted: Feb. 3^rd, 2022; published: Feb. 10^th, 2022

ABSTRACT

Objective: To observe the gene expression of claudin-2, ZO-1, ICAM-1 and TLR2 of Kuijieling IV retention enema p-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)-induced ulcerative colitis (UC) rats and explore the possible mechanism of its treatment of UC. Methods: The experiment was conducted in the laboratory of School of Life Science and Engineering, Harbin Institute of Technology from June to August 2015. Sixty SD rats were used, and 10 were used as the blank control (BC) group. The remaining rats were induced by TNBS solution enema to make UC rat models. After modeling, they were randomly divided into model control (MC) group and Kuijieling IV No. low-dose (LD) group, middle-dose (MD) group, high-dose (HD) group and positive control group Mesalah (PC) group. HD, MD, and LD groups were administered with Kuijieling IV high (40 g/kg), medium (20 g/kg), and low (10 g/kg) three-dose retention enema, and PC group used mesalazine (0.4 g/kg) for enema administration, BC group and MC group were given equal volume of distilled water to detect the gene expression of claudin-2, ZO-1, ICAM-1, and TLR2 in rat colonic mucosa. Observe Kuijieling IV retention enema for TNBS Effect of induced colonic tissue in UC rats. Results: 1) Expression of claudin-2 (claudin-2) mRNA: After PCR amplification and agarose gel electrophoresis, electrophoretic bands (Cldn2 244 bp) were visible from 200 bp to 250 bp. The results showed that the expression of claudin-2 mRNA of Kuijieling IV high-dose, middle-dose group and mesalazine group was significantly enhanced, which was close to the expression of the blank group, and even slightly stronger than that of the blank group. The model group, Kuijieling IV The mRNA of claudin-2 in the high and low dose group was slightly expressed, but the expression was not obvious. 2) mRNA expression of intercellular adhesion molecule-1 (intercellular adhesion molecule, ICAM-1): after PCR amplification and agarose gel electrophoresis, an electrophoretic band (ICAM-1 211 bp) can be seen at 200 bp to 250 bp. The results showed that the mRNA expression of ICAM-1 in the normal group was unknown, and the mRNA expression of ICAM-1 in the mesalazine group was weaker than that in the normal group. The high-, medium-, and low-dose Kuijieling IV was significantly expressed in the model group, obviously higher than the expression of the blank group. 3) TLR2 (toll-like receptors 2, Toll-like receptors 2) mRNA expression: After PCR amplification and agarose gel electrophoresis, the electrophoretic band (TLR2 246 bp) can be seen at 200 bp to 250 bp. The results showed that the mRNA expression of TLR2 in the normal group was weak. The mRNA expression of TLR2 in the mesalazine group, Kuijieling IV high-dose, and medium-dose group was significantly weaker than that in the model group and Kuijieling IV low-dose group. The expression of TLR2 mRNA in the low-dose group of Kuijieling IV was significantly enhanced, which was significantly higher than that in the normal group.

Keywords:Kuijieling IV, Claudin-2, ZO-1, ICAM-1, TLR2, Mesalazine

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1. 前言

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，常累及结直肠黏膜和黏膜下层，以连续性、弥漫性炎症改变为特点，临床主要表现为腹泻、腹痛和黏液脓血便，并可出现严重并发症。其病程迁延，易反复发作，且有癌变倾向，被WHO列为现代难治病之一 [1]。随着经济社会的快速发展，UC的发病率呈大幅度上升，对患者造成了极大的痛苦，严重影响工作和生活质量。然而，UC的发病机制尚不清楚，所以，对于UC的发病机制及其治疗的研究意义重大。溃结灵IV号是黑龙江中医药大学附属第一医院肛肠科研制的用于保留灌肠治疗UC患者，有多年的临床经验，治疗效果显著，尤其适用于溃疡性乙状结肠、直肠炎的治疗。本实验通过三硝基苯磺酸(TNBS)诱导制作UC模型大鼠，观察溃结灵IV号对UC模型大鼠的保护作用，探讨其作用机制，为日后的临床应用提供可靠的依据。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 实验动物

健康SD大鼠共60只，体重180~220 g之间，雌雄各半。由黑龙江中医药大学实验动物中心繁殖提供，合格证号：SCXK (黑) 2008004。

2.1.2. 药物

溃结灵IV号组成：白头翁12 g，黄连12 g，穿山龙12 g，地榆炭15 g，赤石脂15 g，马齿苋12 g，黄柏12 g，大黄10 g，黄芪10 g，肉豆蔻10 g，由黑龙江中医药大学附属第一医院提供。美沙拉嗪肠溶片：葵花药业佳木斯鹿灵制药有限公司。

2.1.3. 试剂

焦碳酸二乙酷(DEPC)、硼酸(Borieacid)、Tris碱、乙二胺四乙酸(EDTA)、琼脂糖(Agarose)、溴化乙啶、总RNA提取试剂盒(Sangon RNA Kit)、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (两步法逆转录试剂盒)，Fermentas公司，SYBR Green PCR Master Mix (Applied Bio systems)引物采premier 5.0设计，购自北京市赛百盛公司。

2.1.4. 仪器

neAm5700 p TaqMAN PCR仪，美国Applied Biosystems公司；凝胶图像分析仪，Image Master VDS，美国pharmacia Biotech公司；高速冷冻离心机，德国BACKMAN公司；紫外线分光光度计，德国BACKMAN公司DU640型；恒温恒湿箱SPX-150 C型，上海博迅有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂OYY-III-5型。

2.2. 实验方法

2.2.1. 动物分组

动物分组：60只SD大鼠适应性喂养1周后，体重180~220 g之间，随机选取10只作为空白对照(BC)组，其余大鼠进行造模，分为模型对照(MC)组，溃结灵IV号高剂量(HD)组、中剂量(MD)组、低剂量(LD)组和阳性对照组美沙拉嗪(PC)组，每组20只。

2.2.2. 造模方法

使用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导法 [2] [3] [4]，138只SD大鼠，造模前禁食24小时，用乙醚麻醉，将橡胶管(直径2 mm)轻轻由肛门插入，深度为8 cm，推入TNBS溶液(原液与无水乙醇1:1混合)按体重给药，剂量为100 mg/kg，给药后捏紧肛门平放5 min即可，给药后常规饲养。

2.2.3. 给药方法

造模后第2天，LD组、MD组、HD组予溃结灵IV号分别按10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg剂量由肛门保留灌肠，PC组予美沙拉嗪按0.4 g/kg由肛门灌肠给药，BC组及MC组给等体积的蒸馏水，每天给药1次，称体质量1次。

2.3. 检测方法

mRNA表达：1) 总RNA提取：取300 mg组织，放到1.5 ml EP管中，加入1 ml Isogen冰上匀浆，室温静置5分钟加0.2 ml氯仿，快速剧烈摇动约30秒，温静置5分钟，12,000×g，4℃离心，15分钟，离心后，吸取上层无色水相，移入另一个EP管中(0.5 ml)。加0.5 ml异丙醇，轻轻上下翻转5回，室温静置10分钟。12,000×g，4℃离心，15分钟。离心后确认管底部有微量RNA沉淀。弃上清，将EP管倒置约2分钟，干燥RNA沉淀，但不可干燥过度。加75%乙醇1 ml，−20℃保存30分钟以上。振荡混合，12,000×g，4℃离心，3分钟。离心后弃上清，EP管倒置在滤纸上，室温干燥RNA沉淀5~10分钟。沉淀溶于20 μl或50 μl DEPC水，室温孵育3~5分钟。2) RNA浓度测定：调零、测量，逆转录反应条件：42℃：50分钟；70℃：10分钟；−20℃冰箱保存，长期−70℃保存。3) 引物序列：根据美国基因生物库提供基因核酸序列，选取G + C含量约50%的无发卡结构相互间无同源序列两段特异性保守序列，由premier5.0设计软件设计，由北京赛百盛公司合成。4) 逆转录聚合酶链反应RT-PCR：引物稀释：通常购入的引物(primer)为50 µM，需用MilliQ水稀释成10 µM。首先，引物离心后，用DEPC水或双蒸水稀释成10倍母液，再取5 μl母液加入45 μl DEPC水或双蒸水10倍稀释成操作液。5) PCR循环。6) 凝胶电泳：样本孔：取PCR产物10 μl加6 × Loading Buffer 2 μl (PCR产物:Loading Buffer = 5:1，可自行调整剂量)，混合后取10 μl。Mark孔：取10 μl Mark。2%琼脂糖凝胶电泳120 V 100 mA 30 min；溴化乙锭染色。7) 凝胶成像。

3. 结果

3.1. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜TLR2 (Toll样受体2，Toll-Like Receptors 2) mRNA的表达

经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在200 bp至250 bp位置可见电泳条带(TLR2 246 bp)。结果表明正常组TLR2的mRNA表达较弱，美沙拉嗪组、溃结灵IV号高剂量、中剂量组TLR2的mRNA表达较模型组和溃结灵IV号低剂量组明显减弱，模型组和溃结灵IV号低剂量组TLR2的mRNA表达明显增强，明显高于正常组的表达(见图1)。

图1. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜TLR2的表达

3.2. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜闭合蛋白-2 (Claudin-2) mRNA的表达

经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在200 bp至250 bp位置可见电泳条带(Cldn2 244 bp)。结果表明溃结灵IV号高剂量、中剂量组及美沙拉嗪组claudin-2的mRNA表达明显增强，与空白组的表达接近，甚至略强于空白组的表达，模型组、溃结灵IV号高低剂量组claudin-2的mRNA略有的表达，表达不明显(见图2)。

图2. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜闭合蛋白-2 (claudin-2) mRNA的表达

3.3. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜细胞粘附分子-1 (Intercellular Adhesion Molecule, ICAM-1) mRNA的表达影响

经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在200 bp至250 bp位置可见电泳条带(ICAM-1 211 bp)。结果表明正常组ICAM-1的mRNA表达不明，美沙拉嗪组ICAM-1的mRNA 表达较正常组弱，溃结灵IV号高剂量、中剂量、低剂量及模型组ICAM-1的mRNA表达明显增强，明显高去强于空白组的表达(见图3)。

3.4. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜TLR2 (Toll样受体2，Toll-Like Receptors 2) mRNA 的表达

经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在200 bp至250 bp位置可见电泳条带(TLR2 246 bp)。结果表明正常组TLR2的mRNA表达较弱，美沙拉嗪组、溃结灵IV号高剂量、中剂量组TLR2的mRNA表达较模型组和溃结灵IV号低剂量组明显减弱，模型组和溃结灵IV号低剂量组TLR2的mRNA表达明显增强，明显高于正常组的表达(见图4)。

图3. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜细胞粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule, ICAM-1) mRNA的表达影响

图4. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜TLR2 (toll样受体2，Toll-like receptors2) mRNA的表达

3.5. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜带状闭合蛋白-1 (Zonula Occludeus, ZO-1, Tight Junction Protein 1, Tjp1) mRNA的表达

经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在150 bp至200 bp位置可见电泳条带(ZO-1 174 bp)，结果表明正常组ZO-1的mRNA表达强，美沙拉嗪组、溃结灵IV号高剂量、中剂量组ZO-1的mRNA表达与正常组相似，也是强表达，溃结灵IV号低剂量组及模型组ZO-1的mRNA表达明显减弱，仅有少量表达(见图5)。

4. 结论

Claudin是细胞间紧密连接的主要功能蛋白，通过细胞屏障、细胞旁路转运和信号转导保持了细胞内环境的平衡。Claudin蛋白在急性胆源性感染肠黏膜屏障功能的进展中发挥重要作用 [5] [6]。Claudin蛋白是机体内构成紧密连接的最主要的功能分子，可维持紧密连接特有的栅栏功能和机械屏障功能，其异常表达可导致紧密连接破坏，导致包括过敏性疾病、遗传性疾病和先天性疾病各个系统的感染性疾病及肿瘤等多种疾病的发生。研究中发现使用美沙拉嗪保留灌肠后claudin-2的mRNA表达增强，说明紧密连接蛋白claudin-2可以作为溃疡性结肠炎肠道机械屏障保护作用的观测指标，中药溃结灵IV号能够增强UC大鼠结肠粘claudin-2的mRNA表达，溃结灵IV号具有保护溃疡性结肠炎结肠粘膜机械屏障的功能。claudin-2在UC中的研究较少，临床中尚未见报道。本实验中发现claudin-2可以作为检测结肠机械屏障功能的检测指标。

图5. 溃结灵IV号对UC大鼠结肠粘膜带状闭合蛋白-1 (zonula occludeus, ZO-1, tight junction protein 1, Tjp1) mRNA的表达

ZO-1 (zonula occludens-1)是构成肠道紧密连接的重要成分之一，是最早发现与紧密连接相关的蛋白 [7] [8] [9]，研究发现正常组ZO-1的mRNA表达强，造模21天后，UC大鼠结肠粘膜中ZO-1的mRNA表达明显减弱，仅有少量表达，UC大鼠用药保留灌肠21天后，美沙拉嗪组、溃结灵IV号组ZO-1的mRNA表达与正常组相似，也是强表达。说明中药溃结灵IV号对溃疡性结肠炎有机械屏障保护功能。

细胞间粘附分子(ICAM-1)，又称CD54，是免疫球蛋白超家族中的单链跨膜球蛋白，它是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白，参与肠道上皮细胞的屏障保护作用，其表达受多种因素的影响，如自身免疫病、创伤、白血病及细胞因子等。在本研究中发现经过美沙拉嗪的治疗，结肠粘膜中ICAM-1的mRNA表达明显下降，证明ICAM-1参与肠道上皮细胞的屏障保护作用，ICAM-1在溃疡性结肠炎的发生发展中起重要作用，溃结灵IV号组及模型组ICAM-1的mRNA表达明显增强，明显强于正常组的表达。

Toll样受体(TLRs)是天然免疫系统中的一种细胞跨膜糖蛋白，通过对病原微生物的识别触发信号转导通路从而激活免疫系统。研究发现TLRs与溃疡性结肠炎关系密切，是研究UC发病机理的一个新的靶点。我们研究发现治疗后的美沙拉嗪组、溃结灵IV号高剂量、中剂量组结肠粘膜中TLR2的mRNA表达较模型组和溃结灵IV号低剂量组明显减弱，模型组和溃结灵IV号低剂量组TLR2的mRNA表达明显增强，明显强于正常组的表达。说明TLR2与溃疡性结肠炎关系密切，炎症越重TLR2的表达越显著，而中药溃结灵IV号能够抑制TLR2的表达。

总体来看，溃结灵IV号以白头翁为君药，黄连、黄柏为臣药，地榆炭、赤石脂、穿山龙、大黄为佐药，黄芪、肉豆蔻、马齿苋为使药，诸药合用，具有增强免疫力、抗菌、抗病毒，抗溃疡等作用。溃结灵IV号通过改善基因表达，恢复肠道上皮细胞的屏障保护功能，减轻肠道炎症反应，对于溃疡性结肠炎的治疗提供理论指导。

基金项目

黑龙江省自然科学基金项目(H201480)；黑龙江省教育厅面上项目(12521503)。

文章引用

宋宁宁,程丽敏,宋晓霞,黄爱凤. 溃结灵IV号对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜Claudin-2、ZO-1、ICAM-1、TLR2基因表达的影响
Effect of Kuijieling IV on the Expression of Claudin-2, ZO-1, ICAM-1 and TLR2 Genes in Colonic Mucosa of Rats with Ulcerative Colitis[J]. 临床医学进展, 2022, 12(02): 838-845. https://doi.org/10.12677/ACM.2022.122121

参考文献