¹作物代谢调控与代谢工程实验室，湖南农业大学农学院，湖南 长沙

²作物表观遗传调控与发育湖南省重点实验室，湖南农业大学农学院，湖南 长沙

收稿日期：2024年4月26日；录用日期：2024年5月24日；发布日期：2024年5月31日

摘要

为了探究β-罗勒烯对烟田烟蚜种群的控制效果及最佳施用浓度，在室内条件下分析了不同浓度β-罗勒烯对烟蚜种群数量、种群增长率、干扰作用控制指数以及趋避效果的影响。通过田间药效试验分析了β-罗勒烯及70%吡虫啉水分散粒剂对烟蚜种群数量的影响。室内试验结果表明，10 mM β-罗勒烯对烟蚜种群控制效果最佳，相较于对照，施用β-罗勒烯后12 d每株烤烟上烟蚜密度减少81.7头/株。田间药效试验结果表明，β-罗勒烯能有效抑制田间烟蚜种群数量，综合效果优于化学农药。进一步的RT-qPCR分析结果表明，β-罗勒烯处理能显著提高烤烟植株中水杨酸途径指示基因PR1和茉莉酸/乙烯途径指示基因PDF1.2的表达量，这些说明β-罗勒烯能通过同时激活多条防御途径以促进烤烟植株对烟蚜的防御能力。研究结果表明10 mM β-罗勒烯可用于对烟田烟蚜的控制，本研究为烟田绿色防控烟蚜提供了新的途径。

关键词

β-罗勒烯，植物通讯，烟蚜，种群控制，抗性基因

Research on the Control Effect of β-Ocimene on Myzus persicae Population

Hongjiang Li^1,2*, Gang Lin^1,2,, Zhonglong Yang^1,2, Ying Ruan^1,2, Chunlin Liu^1,2#

¹Crop Metabolic Regulation and Metabolic Engineering Laboratory, College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha Hunan

²Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Epigenetic Regulation and Development, College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha Hunan

Received: Apr. 26^th, 2024; accepted: May 24^th, 2024; published: May 31^st, 2024

ABSTRACT

To investigate β-ocimene control effect and optimal application concentration of β-ocimene on the population of Myzus persicae, we investigated the impact of different concentrations of β-ocimene on the population size, population growth rate, repellency rate, and disturbance control index on Myzus persicae was analyzed under laboratory conditions. Under field conditions β-ocimene on the population quantity of Myzus persicae and its impact on the agronomic traits of flue-cured tobacco under the control of β-ocimene. The results are as follows: Through indoor experiments study 10 mM β-ocimene has the best control effect on the Myzus persicae population. Within 12 days, the number of adults decreased by 81.7 heads/plant compared to the control group. The results of the field experiment: Compared to the control β-ocimene can effectively inhibit the population of Myzus persicae in the field. The RT-qPCR analysis results indicate that, β-ocimene treatment with β-ocimene, the expression levels of the salicylic acid pathway marker gene PR1 and the jasmonic acid/ethylene pathway marker gene PDF1.2 in flue-cured tobacco plants were significantly increased, indicating that β-ocimene can promote the defense ability of flue-cured tobacco plants against Myzus persicae by simultaneously activating multiple defense pathways. The research results indicate that 10 mM β-ocimene can be used for controlling Myzus persicae in tobacco fields, our study provides new insights for the prevention and control of Myzus persicae in the field.

Keywords:β-Ocimene, Plant Communication, Myzus persicae, Population Control, Resistance Genes

Copyright © 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

烟蚜(Myzus persicae)又称桃蚜，是烟草重要害虫之一 ‎[1] ，其危害时间长、发生数量大，常密集在烟叶背面或叶心上。烟蚜通过吸食烟株韧皮部汁液直接对烟株产生危害，同时烟蚜还分泌蜜露，导致烟叶发生煤污病，使烤烟的产量与质量下降。此外，烟蚜还能够传播病毒病，病毒病的发生将造成巨大的经济损失 ‎[2] ‎[3] ‎[4] ，因此烟蚜的有效防治对烤烟生产至关重要。

目前，在烤烟生产过程中，化学农药的大范围使用导致烟蚜抗药性增强、资源浪费以及农药残留等问题日益凸显 ‎[5] ，化学农药在施用的过程中仅有1%左右为有效喷洒，其余99%则释放至非目标土壤、水体和大气中，最终被人类和其他生物体吸收。农药的使用已经严重危害人类健康，如何有效降低化学农药使用量已经成为全世界面临的一个共同难题 ‎[6] ‎[7] 。针对这些问题近年来生物防控开始兴起，其中利用烟蚜天敌对烟蚜进行防控是一个行之有效的方法 ‎[8] ‎[9] ，但生物防控见效相对较慢、使用不太方便 ‎[5] ，现在烟草生产上亟需更为简便、有效和无农残的烟蚜防治新方法。β-罗勒烯是一种植物通讯信号分子，由植物体内提取而来，具有绿色无污染的特点，它能诱导植株产生防御反应，促使植株进入防御戒备状态，有利于植株更快、更有效的抵御外界生物胁迫 ‎[10] ‎[11] 。Kishimoto K等 ‎[12] 通过研究发现，野生烟草在受到不同昆虫取食后，罗勒烯的释放量会显著升高；Kessler A等 ‎[13] 经过试验发现，表达罗勒烯合成酶的烟草能够吸引更多的蚜虫天敌，并且能够抑制蚜虫的生长发育；Kang等通过外源施加β-罗勒烯的方式诱导大白菜对蚜虫产生抗性，蚜虫在取食大白菜后，生长发育会受到抑制，个体变小、繁殖能力下降 ‎[14] 。桂茜等 ‎[15] 发现经β-罗勒烯诱导的拟南芥在接种斜纹夜蛾后，斜纹夜蛾会展现出较强的拒食性，体重显著降低，拒食率显著增加，拟南芥相关防御基因的表达量显著提高 ‎[10] ‎[16] 。以上研究均表明，β-罗勒烯在绿色防控方面有着巨大的应用潜力和优势，但能否通过外源施加β-罗勒烯，诱导烟草对烟蚜产生抗性的研究还未曾出现。为此，本研究将通过外源施加β-罗勒烯的方式，分析不同β-浓度罗勒烯对烟蚜种群的控制效果，同时通过RT-qPCR分析烟株体内抗性基因的表达情况，最后通过田间药效试验分析β-罗勒烯对烟蚜的防治效果，旨在为进一步丰富绿色防控手段，实现烤烟绿色生产提供科学的参考。

2. 材料与方法

2.1. 供试材料

供试烤烟品种为“云烟87”(湖南农业大学农学院烟草工程重点实验室馈赠)，盆栽种植于湖南农业大学农学院生物测定中心温室内，待烟株长至五叶一心后备用。

烟蚜采自湖南农业大学浏阳烟草实验基地(湖南省浏阳市永安镇永和村，经度：E113.85˚，纬度：N28.29˚)，在室温中以烤烟植株饲养繁殖多代后供试。

2.2. 供试试剂

82% β-罗勒烯(德国Sigma公司)；70%吡虫啉水分散粒剂(河北中保绿农作物有限公司)；无水乙醇(天津市化工三厂有限公司)；Eastep^TM Super总RNA提取试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)；cDNA反转录试剂盒(上海赛默飞世尔科技公司)。

2.3. 试验仪器

仪器：10 L干燥罐(常德比克曼生物科技有限公司)；载玻片(常德比克曼生物科技有限公司)；Light Cycler^® 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。

2.4. 试验方法

2.4.1. β-罗勒烯诱导烟株防控烟蚜的抗性检测

试验方法参考刘梅 ‎[17] 、覃韧 ‎[18] 的方法。试验设置4个处理：分别为5、10、15 mM β-罗勒烯诱导处理及对照(未经β-罗勒烯诱导)，每个处理设置3组重复，每组重复3株烟。将烟株放入干燥罐内，分别暴露于浓度为0、5、10、15 mM的β-罗勒烯中，处理6 h。处理结束后，挑选活力相近的2龄若蚜，分别接入各处理烟株上，每株烟苗接入10头若蚜，接虫部位统一为倒数第二片叶背面，随后将接种有烟蚜的材料放入养虫罩中，在温度为25℃ ± 1℃，RH为60%~70%，光周期为16 L：8D的条件下生长。从接虫后第4 d开始，每隔2 d对各处理烟蚜的数量进行一次统计，直到第12 d。根据公式1、2、3分别计算出各处理，烟蚜种群增长率 ‎[19] 、烟蚜的趋避率 ‎[20] 、以及干扰作用控制指数 ‎[21] ，探究不同浓度β-罗勒烯对烟蚜种群的影响。

$种群增长率=\frac{\ln 第n天烟蚜种群数量-\ln 烟蚜初始种群数量}{试验开始至检测当日的天数}\times 100\%$ (1)

$驱避率=\frac{对照平均虫口数-处理平均虫口数}{对照平均虫口数+处理平均虫口数}\times 100\%$ (2)

$干扰作用控制指数(IIPC)=\frac{处理虫口数}{对照虫口数}$ (3)

2.4.2. 抗性基因表达量检测

烟株经β-罗勒烯诱导处理(处理方式同1.3.1)后，分别收集各处理烟株的叶片，按照Trizol法分别提取叶片总RNA，反转录为cDNA。利用premier primer5软件设计抗性基因PR1和PDF1.2的实时定量PCR (Quanlitlitative Real-Time PCR, qRT-PCR)引物，以Actin作为内参基因，按照Light Cycler^® 480 SYBR Green I Msater qPCR试剂盒的操作说明配置反应体系，使用Light Cycler^® 480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应。根据2^−∆∆Ct法对各处理PR1和PDF1.2的相对表达量进行计算 ‎[22] ，探究β-罗勒烯对烟株体内抗性基因表达情况的影响。所用引物如下表1：

表1. 引物与序列

2.4.3. 田间药效试验

试验设置在长沙市浏阳烟草试验基地，试验田面积为1800 m² (60 m × 30 m)，长条型，施肥条件均一致。设置3个处理，以施加β-罗勒烯的田块为处理组，不施加β-罗勒烯和化学农药的田块为空白对照，施用化学农药的田块作为化学药剂对照组。每个处理各设置3个重复，共9个小区，每个小区100 m²。于烟株上烟蚜发生初期(2023年4月10日)，开始施用β-罗勒烯和化学农药，间隔两周施用一次，在整个防控期内分别施用4次β-罗勒烯和4次化学农药。于第一次施用β-罗勒烯和化学农药后7 d，开始对各处理烟蚜进行统计，间隔7 d。

采用五点取样法，在每个小区四周和中心取5个点调查，每个点随机调查5株烤烟，调查时均选取每株烤烟倒1~5片叶上的烟蚜进行统计。统计结束后，根据公式4，分别计算出不同处理烟蚜的虫口减少率。

$虫口减少率=\frac{对照烟蚜种群数量-处理烟蚜种群数量}{对照烟蚜种群数量}\times 100\%$ (4)

2.5. 数据分析

采用Origin 2022、Excel 2010和SPSS 23软件进行作图、数据统计分析、单因素方差分析(p = 0.05) LSD法比较，数据均用平均值±标准误进行表示。

3. 结果与分析

3.1. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群数量的影响

见表2，外源施加β-罗勒烯对烟蚜种群数量具有显著的控制效果，于接虫后第12 d，对各处理烟蚜数量进行统计发现，对照组烟蚜数量为124.7头/株；经5、10、15 mM β-罗勒烯诱导后烟蚜数量分别为76.0、43.0、44.0头/株，相比对照分别减少了48.7、81.7、80.7头/株。据此推断10 mM β-罗勒烯对烟蚜种群数量的控制效果最佳，见图1。

表2. β-罗勒烯对烟蚜种群数量的影响

注：表中同一时间图注上不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。

图1. 接虫后12 d各处理蚜虫数量

3.2. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群增长率的影响

图2. 经不同浓度β-罗勒烯处理后烟蚜种群增长率

见图2：外源施加β-罗勒烯对烟蚜的种群增长率具有显著的抑制效果。随着β-罗勒烯浓度的增加，增长率整体呈下降趋势。12 d内，对照组烟蚜种群增长率为21.03%；经5、10、15 mM β-罗勒烯诱导后，烟蚜种群增长率分别为16.90%、12.16%和12.35%，相比对照分别下降了4.13、8.87、8.68个百分点。终上所述，10 mM β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群增长率的抑制效果最大。

3.3. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜驱避率的影响

见图3：本研究测试β-罗勒烯三种浓度处理中，5 mM对烟蚜的趋避率影响最小；15 mM对烟蚜趋避率的影响次之；10 mM对烟蚜趋避率的影响最大，其中10 mM和15 mM β-罗勒烯对烟蚜趋避率无显著性差异。最大趋避率出现在经10 mM β-罗勒烯诱导后第10 d为50.97%，最小趋避率为5 mM β-罗勒烯诱导后第6 d仅为11.89%。综上所述10 mM β-罗勒烯对烟蚜驱避效果最佳。

图3. 经不同浓度β-罗勒烯处理后烟株对烟蚜的驱避率

3.4. β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜种群的干扰效果

图4. 不同浓度β-罗勒烯对烟蚜种群干扰作用控制指数的影响

见图4：本研究测试β-罗勒烯三种浓度处理中，5 mM对烟蚜种群的干扰效果最小；15 mM对烟蚜种群的干扰效果次之；10 mM对烟蚜种群的干扰效果最大。接入烟蚜后第10 d，三个处理对烟蚜的干扰效果均达到最佳，分别为0.61、0.32和0.33。表示烟蚜种群数量仅为对照组的61%、32%、33%。综上所述，10 mM β-罗勒烯对烟蚜种群的干扰效果最佳。

3.5. β-罗勒烯诱导烟株提高抗性基因的表达

前面试验结果表明，烟株经10 mM β-罗勒烯诱导后对烟蚜种群的控制效果最佳。故以10 mM β-罗勒烯处理的烟株作为处理组，未经β-罗勒烯处理的烟株作为对照组。通过对比发现，经β-罗勒烯诱导后，烟株体内水杨酸(SA)防御途径指示基因PR1的表达量相较于对照提高了9倍；茉莉酸/乙烯(JA/ET)防御途径指示基因PDF1.2的表达量相较于对照提高了1.5倍(见图5)，PR1和PDF1.2表达同时提高，暗示着β-罗勒烯能够解除SA防御途径与JA/ET防御途径之间的拮抗。以上结果表明，β-罗勒烯诱导能够启动烟株自身防御反应，从而增强烟株对烟蚜取食的抗性。

图5. 抗性基因相对表达情况

3.6. 田间施用β-罗勒烯对烟蚜种群数量的影响

表3. 不同处理不同时期烟蚜虫口减少率

注：表中同一时间图注上不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。

根据室内盆栽试验结果，将以10 mM β-罗勒烯用于大田，吡虫啉配制成500倍液后用于大田。见表3，在整个调查期间，处理组与化学试剂对照组烟蚜数量均低于对照组，施用β-罗勒烯后，烟蚜数量相比对照减少了58.67~65.95%；施用化学农药后，烟蚜数量相比对照减少了49.46%~83.97%。β-罗勒烯在整个防控期间内效果较为稳定波动较小，施用化学农药效果波动较大。化学农药能迅速灭杀烟蚜，在施用初期，烟蚜数量迅速减少，效果较为显著，但随着时间的推移以及降雨等天气情况的影响，药效逐渐降低，烟蚜数量开始回升；施用β-罗勒烯后，烟株自身防御体系被激活，此期间不会因外界环境变化而影响防治效果，烟蚜数量从一开始就显著降低，整个防治过程波动较小，效果稳定。综上所述，施用β-罗勒烯及化学农药均能有效控制烟蚜的种群数量，但施用β-罗勒烯效果更加稳定且符合烤烟绿色发展理念。

4. 结论

通过室内盆栽试验确定，烟株经10 mM β-罗勒烯诱导后，对烟蚜展现出的抗性最强。烟株经10 mM β-罗勒烯诱导后，烟蚜密度减少了81.7头/株、种群增长率减少了8.87个百分点；通过进一步分子水平检测发现，烟株体内水杨酸防御途径指示基因PR1与茉莉酸/乙烯防御途径指示基因PDF1.2的表达量分别上升了9倍和1.5倍。以10 mM β-罗勒烯用于大田，在整个防控期间内，烟蚜数量减少了58.67%~65.95%，相较于化学农药效果更加稳定且更加绿色环保。基于本研究的数据得出结论，β-罗勒烯可作为一种新型的烟蚜防控试剂，建议浓度为10 mM。

5. 讨论

通过室内盆栽试验发现，β-罗勒烯对烟蚜种群影响较大，烟蚜种群数量、种群增长率均显著降低，这些结果与Kang等的结论相近 ‎[14] ，此外，烟株经β-罗勒烯诱导后，对烟蚜具有显著的趋避作用。分子水平检测显示，经β-罗勒烯诱导后，烟株体内抗性基因PR1及PDF1.2的表达量极显著上升，这与刘春林报道的结果一致 ‎[23] 。烟株经β-罗勒烯诱导后所展现出的抗性，与PR1及PDF1.2表达量的上调密切相关，这与Shonle的结论一致 ‎[24] 。PR1与PDF1.2分别作为SA防御途径及JA防御途径的指示基因，其表达量的提升预示着两条防御信号通路同时被激活，而SA信号传导途径参与了由烟蚜取食诱导的植物防御反应 ‎[25] ，据此分析，SA防御途径被激活，可能是β-罗勒烯诱导烟株对烟蚜产生抗性的主要原因。以上结果表明β-罗勒烯在防控蚜虫方面存在着巨大潜力。

项目基金

湖南省烟草公司长沙市公司项目“罗勒烯防控烟草病毒病的应用与研究”(CS2023KJ02)；湖南省教育厅项目(20K070)。

文章引用

李宏江,林 钢,杨忠龙,阮 颖,刘春林. β-罗勒烯对烟蚜种群的防控效果
Research on the Control Effect of β-Ocimene on Myzus persicae Population[J]. 农业科学, 2024, 14(05): 614-623. https://doi.org/10.12677/hjas.2024.145078

参考文献