通路分析提示钙信号转导通路与酒精依赖关联 Pathway Analysis Suggest the Calcium Signaling Pathway Associated with Alcohol Dependence

doi:10.12677/HJBM.2014.41001

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Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2014, 4, 1-6

http://dx.doi.org/10.12677/hjbm.2014.41001 Published Online January 2014 (http://www.hanspub.org/journal/hjbm.html)

Pathway Analysis Suggest the Calcium Signaling Pathway

Associated with Alc o ho l Dependenc e

Yanfang Guo

Institute of Bioinformatics, School of Basic Medical Sc ie nce, So ut he rn Me d ical University, Guangzhou

Email: guoyf@smu . edu .cn

Received: Jan. 4th, 2014; revised: Jan. 18th, 201 4; ac cepted : Jan. 23rd, 2014

stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. In accordance of the Creati ve Commons At-

guarded by law and by Hans as a guardi an .

Abstract: B ac kground: Alcohol dependence (AD) is a serious and common public health problem. A large number of

association studies were conducted to identify susceptibility genes of AD, but efforts to generate an integrate view of

accumulative genetic variants and pathways under alcohol drinking are lacking. Methods: We applied enrichment gene

set analysis to existing genetic association results to id entify pertinent pathwa ys to alcoho l dependence in this stud y. A

total of 1438 SNPs (P < 1.0 × 10−3) associated to alcohol drinking related-traits have been collected from 31 studies.

Results: The calcium signaling pathway (hsa04020) showed the most significant enrichmen t of associations (21 gene s)

to alcohol consumption phenotypes (P = 5.4 × 10−5) , a chi evi ng b o n fer ro ni P value of 0. 8 × 10−3 a nd F DR va l ue of 0.6 ×

10−2, respectively. Interestingly, the calcium signaling pathway was previously found to be essential to regulate brain

function. Genes in this pathway link to a depressive effect of alcohol consumption on the body. Conclusions: Our find-

ings, together with previous biological evidence suggest the importance of gene polymorphisms of calcium signaling

pathway to alcohol dependence susceptibility.

Keywords: Genome-Wide Association Study; Pathway Analysis; Alcohol Dependence

通路分析提示钙信号转导通路与酒精依赖关联

郭艳芳

南方医科大学基础医学院，广州

Email: guoyf@smu . edu .cn

收稿日期：2014年1月4日；修回日期：2014年1月18 日；录用日期：2014年1月23 日

摘要：背景：酒精依赖是一种严重而常见的复杂疾病，大量关联研究常致力寻找其易感基因，目前对已发现

的遗传变异还缺乏整体的分析和认识。方法：采用基因富集通路分析法对来自 31 项饮酒相关研究的 1438 个单

核苷酸多态性进行分析。结果：钙信号传导通路(hsa04020) (P = 5.4 × 10−5)显示出最显著的关联富集，经多重检

验校正后仍显著(bonferroni P = 0.8 × 10−3, FDR = 0.6 × 10−2)。有研究证实钙信号转导通路在脑功能调节中必不可

少，该通路中的基因与酒精对身体的抑郁作用有关。结论：钙信号转导通路可能对酒精依赖具有重要影响。

关键词：全基因组关联研究；通路分析；酒精依赖

1. 引言

酒精依赖是一种常见严重影响公众健康的疾病，

以心理和生理依赖为主要特点，具有显著的酒精成瘾

行为[1]，遗传率较高(40%~60%)[2]，其致病基因的鉴定

OPEN ACCESS 1

通路分析提示钙信号转导通路与酒精依赖关联

研究有助于提高人们对酒精依赖遗传机制的了解。

候选基因和全基因组关联研究常被用来鉴定与复

杂疾病关联的基因。与酒精依赖相关的研究已积累了超

过20 年，发现的这些基因主要参与酒精的分解代谢，

然而，已鉴定的基因仅能解释遗传变异不足5%，绝大

部分的遗传基因仍未知。对大量关联研究的结果观察发

现，尽管不同饮酒关联研究鉴定的基因不重复，但可能

位于同一生物学通路或者是功能相关。比如，ADH1B

基因和 ADH2基因分别在 McKay’s[3]和Takeuchi’s[4]的研

究中报道与饮酒相关，如果仅关注这两个单独的基因，

它们可能并不被认为相关，但如果从生物学意义上来说，

这两个基因都位于酒精代谢ADH 和ADLH 的通路中，

在这个通路中提高 ADH 活性或降低ALDH 活性的突变

都可能导致乙醇浓度的增加[5]。我们认为如果一条通路

中富集了与特定疾病相关的基因，相关通路可能在该疾

病的发病机制中起重要作用。通路分析法可挖掘 GWAS

数据检测疾病关联基因，该方法可补充常规单标记分析

的结果，检测通路中多个基因是否同时与疾病表型相

关[6]。最新的综述总结了目前已发表的与饮酒相关的基

因，包括来自 GWAS 和候选基因研究，却缺乏对这些

基因的相关关系以及整体的分析。本研究汇集目前已发

表的关联研究结果进行通路富集分析，旨在发现与酒精

依赖等性状相关的生物学通路。

2. 方法

2.1. 数据的整理与收集

与饮酒可能相关的遗传标记从已发表的 GWAS 和

候选基因关联研究结果收集而来，表型性状包括酒精依

赖，酒精戒断症状，酒精中毒(基于酒精依赖因子得分，

或酒精使用障碍因子得分，或饮用的重量)以及饮酒行为。

本研究的数据主要来自 GWASdb 数据库(更新于 2013年

10 月4日)[7]，该数据库中收集的至今已发表的与人类表

型可能关联的 SNP (P < 10−4)，不仅囊括了一般数据库的

GWAS 数据，还包含候选基因的数据，但不包含结构突

变数据，比如拷贝数变异。作为补充，我们还进行了

PubMed 搜索来获得最新发表的未及时入库到 GWASdb

的数据，以及有关饮酒的拷贝数变异数据。

2.2. 基因富集分析法

使用 SNPnexus 将收集到的SNP 注释到相应的基

因(Hg19 )[8]。SNPnexus是一个进行在线 SNP 功能注释

的Web 数据库，提供SNP 功能的全面注释，分为内

含子、5'端非编码区、3'端非编码区、5'端上游、3'端

下游、剪接位点或编码(同义和非同义)7 类。内含子

SNP 注释了与剪切位点的距离。编码 SNP 注释了其所

在cDNA 中的坐标、编码序列、氨基酸以及所产生的

多肽的改变。5'端上游和3'端下游是指距 UTR 20kb

范围内基因组。

使用生物信息学工具 DAVID (version 6.7)分析参

与基因编码的基因的功能富集[9]，参数设置如下：

similarity ter m o ver la p = 10，similarity threshold = 0.50，

initial group membership = 5 ，final group membership =

3，multiple linkage thr e s ho l d = 0.50 and EASE = 0.01。

DAVID 软件包含一组集成的生物学知识信息和工具，

对大型的基因或蛋白集进行超几何分布或 Fish 检验，

旨在系统地提取具有生物学意义且高度富集的生物

学通路。

3. 结果

3.1. 数据的收集和整理

共计收集到 1438 个可能与饮酒相关表型关联的

SN P ( P < 1.0 × 10-4)，分别来自 31 项不同的研究，其

中候选基因关联研究 10 项，G WA S 1 9项，拷贝数变

异研究 2项。图 1A 总结了与不同饮酒相关表型可能

关联的 SNP 数目，其中高达 67%的SNP 与酒精依赖

相关。841 个SNP 被注释到 636 个编码基因将用于后

续的分析。图 1B 展示了 SNP 功能分类的分布情况，

58%的SNP位于内含子区域。图 2展示了收集到的

SNP 的P值情况，在 3.6 × 10−211 至9.97 × 10−4范围之

内。

3.2. 基因富集分析

在所有的 KEGG 通路中，钙信号转导通路

(hsa04020)显著富集与饮酒关联的基因(P = 5.4 × 10−5)

(表1)。经多重检验校正后，仅有钙信号转导通路仍然

显著，bonferroni 和FDR 值分别为 0.008 和0.06。

钙信号转导通路包含176 个基因，富集了21个与

饮酒表型关联的基因(图3)。表 2列出了钙信号转导通

路中每个基因SNP 与饮酒关联的P值，其中最显著的

三个位点来自基因HRH1 (rs433303, P = 1.72 × 10−6)，

OPEN ACCESS

通路分析提示钙信号转导通路与酒精依赖关联

GRM5 (rs6483362, P = 4.53 × 10−6)，and PLCG2

(rs4312298, P = 1.72 × 10−6)。

使用 FASTSNP 软件(http:// fa s ts np.ibms .sinica.edu.tw)

分析了钙信号转导通路中与饮酒关联的 SNP 位点的潜

在功能[10]。潜在功能可推测的 SNP 位点包括rs9927767，

rs1042717，rs1042718 和rs17799872。SNP rs9927767

位于基因 ADCY9，此位点等位基因 T替换为A的改变

将减少转录因子 CP2 的结合位点。SNP rs1042717 和

8.1%

67.8%

0.4%

17.2%

1.2%

4.8%

Reported traits and SNPs

alcohol consumption (117)

Alcohol dependence (981)

Alcoholism (alcohol dependence factor score) (6)

Alcoholism (alcohol use disorder factor score) (6)

Alcoholism (heaviness of drinking) (248)

Alcoholism (18)

Drinking behavior (70)

13%

10%

11%

58%

SNP Classification

3'-Downstream

3'-UTR

5'-Upstream

5'-UTR

coding

intoric

Figure 1. Reported traits and functional category of collected S N Ps

图1. 收集的 SNP 相关的表型和功能分类

Figure 2. Genom ic distribution of P values of collected SNPs potentially ass ociat ed to alc oho l-related traits

图2. 饮酒相关表型关联的 SNP 位点的基因组分布和 P值

Tab le 1. Top enriched pathways for alcohol related-traits at p values ≤ 0.01

表1. 显著富集与饮酒表型相关基因的通路 p ≤ 0.01

KEGG_Pathway term Count % P value Fold Enr ichment Bon ferr oni FD R

hsa04020:Calcium signaling pathway 19 3.15 5.48E-05 2.97 0.007 0.06

hsa04540:Gap junction 10 1.65 4.57E-03 3.09 0.47 5.27

hsa04510:Focal adhe sion 16 2.65 5.78E-03 2.19 0.56 6.62

hsa0472 0 :Long-term potentiation 8 1.32 1.08E-02 3.23 0.79 12.13

01020 3040 50

genomi c coordi nat e

-log10P

123456789 1011121314 15 1617181920 2223

OPEN ACCESS 3

通路分析提示钙信号转导通路与酒精依赖关联

Figure 3. Functional interactions among the genes in the calcium signaling pathway

图3. 钙信号转导通路中的基因组互作。星形表示富集在此通路中与饮酒表型关联的 21 个基因

SNP rs1042718 都是同义的，位于 ADRB2基因，

rs1042718 位点等位基因 T替换为C的改变将减少

SF2/ASF 和Srp40 的外显子剪切增强子片段。此外，一

些SNP 位点位于基因3'端非编码区区域，包括GRIN2C

基因的rs9901283，GRIN2C基因的 rs9901283，ITPKB

基因的rs1050492和PLCG2基因的rs2206266，这些SNP

可能参与基因转录调节。

4. 讨论

GWAS 研究已成为鉴定人类复杂疾病(如酒精依

赖)基因的强大工具，但 GWAS 主要集中于最显著的

边际效应，并不考虑检测的基因的潜在功能和相互作

用，有研究关注基因的潜在功能仅限于个别的 GWAS

研究的候选基因集。本研究通过对现有的 GWAS研究

结果进行通路分析，首次提示钙信号转导通路中的基

因对酒精依赖可能有重要的作用。重要的是，在过去

的研究中，钙信号转导通路中的基因并没有一个达到

全基因组显著水平(P < 10 −8)，因此，钙信号转导通路

的重要作用直到基因富集分析研究中才被发现。

人类复杂疾病/性状的遗传研究中通路为基础的

方法越来越受到重视，因为它可以提供一组相关基因

中的多个突变线索，这些基因共同构成了生物通路或

模块[3] 。许多研究都采用通路为基础的方法，作为单

标记关联测试的补充，挖掘常见人类疾病的GWAS

数据集，如肥胖、骨质疏松症、癌症等。通路为基础

的策略也被用在与酒精依赖易感基因的四项研究中。

Joslyn 等人在 2010 年对包含 367 个家族史饮酒反应阳

性个体的 GWAS数据集进行了基因组富集分析[11]，与

此同时，以前的动物研究和候选基因研究都支持神经

信号功能基因的富集与酒精反应相关[12]。2011年，两

项研究分别对 48个基因进行了基因富集分析[13]，

Kendle 研究团队发现饮酒量与参与细胞粘附的通路

基因富集相关，Reimers 研究团队却发现酒精依赖相

关的基因富集在氨基酸变异和丁酸信令应激反应通

路中[14]。2012 年，Biernacka等人对 1165 名酒精依赖

病例和 1379 名对照的GWAS 数据进行基因富集分析

OPEN ACCESS

通路分析提示钙信号转导通路与酒精依赖关联

Tab le 2. Lists of the 21 enriched genes in Calcium signaling pathway

表2. 钙信号转导通路中富集的 21 个与饮酒可能相关的基因

Gene SNP P value SNP Region Reporte d tr aits

ADCY3 rs17799872 2.10E−03 3’UTR †

ADCY9 rs10775349 6.13E−04 Intronic †

rs99277 67 8.42E−04 Promot e r †

ADRB2 rs1042717 5.59E−05 Codin g ‡

rs10427 18 5.71E−05 Codin g ‡

CHRM5 rs80300 94 2.00E−04 Intronic

EGFR rs28772 60 4.70E−05 Intronic #

ERBB4 rs11885579 9.38E−04 Intronic †

rs13421 680 4.42E−04 Intronic †

GRIN2A rs7206714 1.69E−05 Intronic †

GRIN2C rs99012 83 9.43E−05 3’UTR †

rs11652 088 7.08E−05 Intronic †

GRIN2D rs34997741 4.46E−04 Intronic †

GRM5 rs13918 75 6.03E−04 Intronic †

rs64833 62 4.53E−06 Intronic †

HRH1

rs44313 7 1.80E−05 Intronic †

rs43330 3 1.72E−06 Intronic †

rs98228 71 6.31E−05 Intronic †

HTR7 rs11186320 7.92E−04 Intronic †

ITPKB rs1050492 8.29E−04 3’UTR †

NOS1 rs2293050 8.70E−05 Intronic

PDE1C rs1 3223 209 8.59E−04 Intronic †

PLCB1 rs22062 66 7.10E−04 3’UTR †

PLCG2 rs43122 98 7.00E−06 Intronic †

PRKCB rs22384 93 9.29E−04 Intronic †

RYR3 rs41443 33 1.96E−05 Intronic †

rs17236 010 9.61E−04 Intronic †

SLC8A1 rs9 7897 65 4.58E−04 Intronic †

SLC8A3 rs4 9027 78 2.91E−04 Intronic †

*No te: †a lcoho l de pend ence, ‡a lcoho l wi thdraw al s ympt oms, #Alcoho lism ( hea-

viness of drinking), ##alcohol consumption.

揭示“酮体的合成和降解”通路以及“神经活性配体

-受体相互作用”通路[15]。

然而，后续独立样本的研究并不能很好的重复之

前的有关酒精依赖通路分析中的结果，这可能多方面

的原因造成，最重要的两个方面的原因是单个 GWAS

研究的样本量有限，或者不同研究分析的候选基因不

同。在本研究中，我们并不涉及任一 GWAS研究或具

体的候选基因集，而是系统地分析了目前所有发表的

与饮酒相关的 GWAS 研究和候选基因研究的结果在

KEGG 数据库中所有约 200 条通路中富集情况。值得

注意的是，本研究发现显著富集的钙信号转导通路，

此前尚未被发现该通路与饮酒相关，并具有较大的遗

传效应。由此，知识驱动型通路分析，探讨了由以往

关联分析发现积累的基因集，可能是一种新的分析

GWAS 研究结果的方法，有助于揭示相互作用的通路

对人类重大复杂疾病的重要性。

钙离子 Ca ('2+)是调节细胞内很多生物调节过程

中的第二信使(例如收缩，分泌，突触传递，核孔调节，

转录等)。在心肌细胞及肌肉细胞中，钙离子('2+)浓度

的放松过程中收缩，低层次在高级别之间交替。钙是

参与神经递质的关键化学物质，神经系统内细胞间信

号释放的关键化学物质。过量或不足的钙都可能引发

各种疾病，包括抑郁症。钙信号传导通路的网络复杂

而精密，它参与神经元的活性和免疫系统[16]。该通路

的基因调节脑功能，尤其是在海马，应对压力事件，

它与焦虑和抑郁以及抗抑郁药[17]的药效相关。

钙信号转导通路的遗传变异与抑郁症关联是由

最近的一项 GWAS 通路富集分析报道的，该研究包括

1673例重性抑郁症患者和1721 例对照样本[18]。虽然

钙信号转导通路和酒精依赖之间的联系仍有待阐明，

以往的研究已证实饮酒对身体具有抑郁效果。据

TeensHealth.org 报道，酒精会降低中枢神经系统的兴

奋度，降低一个人的大脑接收信息的速度，从而导致

协调性受损，视力、听力和情绪和感官的变化。由酒

精引起这些变化可能引发或加剧抑郁的状态。所有这

些证据表明，钙信号转导通路与酒精依赖的相关不太

可能是由于随机因素造成。钙信号转导通路在酒精依

赖发病中的生物学机制有待进一步的功能研究。

总之，本研究首次发现钙信号传导通路生物学功

可能参与酒精依赖的分子机制，为进一步研究钙信号

转导通路在酒精依赖中的功能研究提供统计学依据，

从而有助于防治酒精依赖新方法的开发。

项目基金

高等学校博士学科点专项科研基金 No. 20124433

120006；广东省优秀青年人才培养项目 No. LYM11040；

南方医科大学“科研启动计划”基础研究前期启动项

目No. B1012075。

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