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Advances in Clinical Medicine
Vol. 14  No. 04 ( 2024 ), Article ID: 84525 , 8 pages
10.12677/acm.2024.1441126

铜负载葡萄糖氧化酶纳米药物用于肝癌的化学动力学治疗

吴婷婷，郝希伟*

青岛大学附属医院小儿外科，山东 青岛

收稿日期：2024年3月17日；录用日期：2024年4月11日；发布日期：2024年4月16日

摘要

目的：为了达到靶向肿瘤部位实现肝癌的精准治疗，设计合成一种负载葡萄糖氧化酶(GOx)和铜离子(Cu2+)的纳米药物(Cu@GoxNM)，通过化学动力学治疗达到对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：通过“一锅法”合成铜负载葡萄糖氧化酶的纳米药物，通过扫描电镜和元素映射检测相关元素来验证纳米药物的合成。验证该纳米药物的级联催化产生活性氧作用。通过MTT细胞毒活实验，细胞活性氧的检测和活死细胞染色实验来验证其对细胞的影响，由此来证明化学动力学治疗的效果。结果：成功合成了铜负载葡萄糖氧化酶的纳米药物Cu@GoxNM；Cu@GoxNM对HUH7细胞的促凋亡作用与其浓度呈正相关；与对照细胞相比Cu@GoxNM致HUH7细胞产生更多的活性氧并发生细胞凋亡。结论：Cu@GoxNM纳米药物能明显促进肝癌细胞的凋亡，其是通过产生过量的活性氧达到化学动力学疗法作用。

关键词

葡萄糖氧化酶，纳米药物，化学动力学疗法，肝癌

The Copper-Loaded Glucose Oxidase Nanomedicines for Chemodynamic Therapy of Hepatocellular Carcinoma

Tingting Wu, Xiwei Hao*

Department of Pediatric Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong

Received: Mar. 17th, 2024; accepted: Apr. 11th, 2024; published: Apr. 16th, 2024

ABSTRACT

Objective: In order to achieve precise treatment of liver cancer by targeting the tumour site, to design and synthesize a nanomedicine (Cu@GoxNM) loaded with glucose oxidase (GOx) and copper ions (Cu2+), which can kill the tumour cells through chemodynamic therapy. Methods: Synthesis of copper-loaded glucose oxidase nanomedicine by “one-pot method” was demonstrated by scanning electron microscopy (SEM) and elemental mapping for the detection of relevant elements. The cascade-catalyzed generation of reactive oxygen species by the nanomedicine was experimentally verified. The effects of the nanomedicine on cells were verified by MTT cytotoxicity assay, cellular reactive oxygen species assay, and staining assay of live and dead cells to demonstrate the effectiveness of chemodynamic therapy. Results: The copper-loaded glucose oxidase nanomedicine Cu@GoxNM was successfully synthesised; the pro-apoptotic effect of Cu@GoxNM on HUH7 cells was positively correlated with its concentration; Cu@GoxNM resulted in the production of more reactive oxygen species and apoptosis in HUH7 cells compared to control cells. Conclusion: Cu@GoxNM nanomedicine significantly promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells, and it might be the effect of chemodynamic therapy by generating excessive reactive oxygen species.

Keywords:Glucose Oxidase, Nanomedicines, Chemodynamic Therapy, Hepatocellular Carcinoma

Copyright © 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

肝细胞癌(HCC)是全球第六大最常见癌症 [1] 。据世界卫生组织称，到2030年，肝癌将导致超过100万人死亡。对于早期HCC患者，根治性切除联合靶向治疗等全身治疗是目前的标准治疗方法；而大多数HCC患者往往诊断时已属晚期，不适合手术治疗，预后和标准治疗效果均较差 [2] 。近年来，受到广泛关注的靶向药物制剂可最大限度地运送药物至靶区，使药物在靶区的浓度显著高于传统制剂 [3] ，这既能明显改善治疗效果，又能减少药物使用剂量，大大降低毒副作用，同时还便于控制给药的速度和方式，达到高效低毒精准治疗的作用 [4] 。

而纳米粒子有实现靶向肿瘤的优势，纳米尺寸的粒子可在血液中长时间循环，并可经“高渗透长滞留(Enhanced permeability and retention, EPR)效应富集于肿瘤组织 [5] 。纳米靶向药物制剂是一种纳米尺寸的靶向制剂，在其上修饰特定的靶向基团可以有效地通过EPR效应靶向肿瘤部位，实现药物在肿瘤部位的富集 [6] 。基于EPR效应的纳米药物制剂尺寸取决于肿瘤血管壁孔径，因此设计的纳米药物制剂的粒径通常在1 μm以下，尺寸越小越有利于在肿瘤组织中渗透扩散。但如果尺寸太小易被肝脏和肾脏清除，而粒径较大则易被网状内皮系统清除 [7] 。

铜作为参与能量转换、氧运输和细胞氧化代谢调节的必需酶的催化辅助因子，在细胞中发挥着重要作用 [8] 。细胞中铜的浓度受代谢需求和细胞环境变化的调节，太少或太多都会对细胞造成严重损害 [9] 。迄今为止，已提出许多策略来提高抗肿瘤疗效，例如光热疗法 [10] 、光动力疗法 [11] 、化学动力疗法(CDT) [12] 、和放射疗法 [13] 。特别是，CDT利用了肿瘤微环境(TME)产生剧毒活性氧(ROS)，无需外部能量即可诱导细胞死亡，由于癌细胞中过氧化氢(H2O2)水平较高，因此合成了各种纳米材料通过芬顿反应或类芬顿反应在弱酸性TME中产生高水平的·OH，这样大量活性氧在肿瘤细胞内堆积即诱导了细胞的死亡达到治疗效果 [11] 。

因此，本研究拟合成一种Cu负载GOx纳米药物Cu@GoxNM，其粒径小的尺寸特点可EPR效应可达到肿瘤细胞产生滞留，通过合成的表征，细胞外实验验证和细胞内实验检测，验证了Cu@GoxNM利用芬顿反应将细胞内的H2O2转化为羟基自由基(-OH)来杀死癌细胞。

2. 实验部分

2.1. 仪器和材料

1) 主要仪器：基因扩增仪(Mini 1620，杭州朗基科学仪器有限公司，中国)；扫描探针显微镜(CSPM 5500，广州本原纳米仪器公司，中国)；紫外可见分光光度计(UV-2600，岛津仪器有限公司，日本)；荧光光谱仪(F-7000，日立高新技术公司，日本)；多功能微孔板酶标仪(Synergy HTX，伯腾仪器有限公司，美国)；X射线衍射仪(Ultima IV，株式会社理学公司，日本)；台式低速冷冻离心机(TDL5M，湖南赫西仪器装备有限公司，中国)；二氧化碳细胞培养箱(HF-151，上海力康仪器有限公司，中国)；细胞计数仪(LUNA-IITM，Logos Biosystems公司，韩国)；激光共聚焦扫描显微镜(LSM 900 & Axio Imager M2，卡尔蔡司光学有限公司，德国)；生物显微镜(LEICA DM3000，徕卡仪器有限公司，德国)。

2) 主要试剂：GOx剂购自BBI生命科学有限公司(上海，中国)；CuCl2购自麦克林生化科技股份有限公司(上海，中国)；盐酸(HCl)、三水合乙酸钠(CH3COONa)和氯化钠(NaCl)购于国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)。本实验中使用的人肝癌细胞(HUH7细胞)购自普诺赛生命科技有限公司(武汉，中国)；DMEM培养基、胰蛋白酶-EDTA (0.25%)和青霉素/链霉素(Penicillin/streptomycin, P/S)购自普诺赛生命科技有限公司(武汉，中国)；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)购自普诺赛生命科技有限公司(武汉，中国)；二甲基亚砜(DMSO)购于国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)；Calcein AM/PI活/死细胞双染试剂盒购自翌圣生物科技有限公司(上海，中国)；1 × PBS缓冲液(0.01 M, pH 7.2~7.4)、活性氧检测试剂盒检测试剂盒购自索莱宝科技有限公司(北京，中国)；实验所用试剂纯度均为分析纯，无需进一步纯化即可使用。

2.2. 实验方法

1) 组装Cu@GoxNM将磷酸化线性模板5 μL (100 μM)和引物10 μL (100 μM)在1 × T4 DNA连接酶缓冲液中充分混合，在95℃下加热5分钟，然后在3小时内逐渐冷却至25℃，后进行滚环扩增反应，包含环状模板3 μL (10 μM)、dNTPs 5 μL (10 mM)、GOx 2.5 μL (16 mg/mL)和2 μL ϕ29 DNA聚合酶(10 U/μL)。后向反应体系中加入2 μL CuCl2。在25℃下进行12小时。孵育后，将混合物在65℃下处理10分钟(使ϕ29DP失活)。通过离心收集后并用双蒸馏H2O冲洗三次，离心沉淀，然后保存在4℃下备用。

2) 催化反应验证羟基自由基(-OH)的生成是通过652纳米波长处3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)吸光度的增加来测定的。在96孔板中，将谷胱甘肽(GSH)与不同浓度的Cu@GoxNM与C2H3NaO2-3H2O缓冲溶液混合，体系总体积为100 μL。然后将混合溶液在37℃黑暗中振荡30分钟后测吸光度。

3) 细胞毒活实验利用MTT细胞增殖检测试剂盒检测HUH7细胞的存活率。将HUH7细胞以每孔2 × 104个的细胞密度接种在96孔板中，置于含5% CO2的细胞培养箱中37℃孵育12 h。向各处理孔中分别加入含有PBS、和不同浓度的Cu@GoxNM细胞培养基，并孵育24 h。处理完毕后，向各孔中加入10 µL MTT，置于含5% CO2的细胞培养箱中37℃孵育4 h。随后，弃去培养基，加入100 μL DMSO并振荡15 min，以溶解生成的甲瓒。在多功能微孔板酶标仪中测量各孔在570 nm波长处的吸光度，以加药浓度为0的PBS处理孔为对照，计算细胞存活率。

4) 细胞活性氧和活死双染实验

以2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为活性氧(Reactive oxygen species, ROS)指示剂，利用活性氧检测试剂盒中检测HUH7细胞内ROS的生成效率。利用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒分析不同处理组的细胞存活情况。将HUH7细胞以每孔3 × 105个的细胞密度接种在共聚焦培养皿中，药物处理后收集各个共聚焦培养皿中的所有细胞，并用Calcein AM/PI工作液(含2 mM Calcein-AM和1.5 mM PI的1 × Assay Buffer)加到细胞中，对细胞进行染色15 min后，用PBS洗涤细胞，通过CLSM进行成像分析。

3. 结果

3.1. Cu@GoxNM的合成与表征

采用扫描电子显微镜(SEM)对Cu@GoxNM的形貌进行表征，如图1所示。可以观察到Cu@GoxNM平均直径约为400 nm，DNA纳米药物均表现出三维花瓣状结构，且大小和分布都均匀，表明将GOx和Cu的封装，均不会引起NFs有太大的尺寸和形貌的变化。且模拟肿瘤微环境下的pH值，通过不同的时间纳米药物开始裂解，方便后续释放Cu和GOx来发挥化学动力学治疗作用。

Figure 1. SEM images of Cu@GoxNM at pH 5.5 at different times (scale bar 1 μm)

图1. 不同时间在pH 5.5条件下的Cu@GoxNM的SEM图像(比例尺1 μm)

3.2. Cu@GoxNM细胞外产生-OH与其浓度成正比

通过测定Cu@GoxNM存在的条件下，催化葡萄糖氧化TMB的动力学曲线探究Cu@GoxNM的催化活性。如图2所示，葡萄糖模拟肿瘤细胞内高糖环境，当纳米药物浓度较低时，游离GOx和Cu2+催化TMB氧化的速率较低，将浓度逐渐升高则表现出越来越强的催化活性，表明药物通过物理吸附和配位作用与GOx、Cu2+结合后，在一定程度上增强了二者间的级联催化活性。基于铜离子类辣根过氧化物酶的性质，在同时加入葡萄糖，TMB和不同浓度Cu@GoxNM后，铜离子可以在葡萄糖与GOx反应产生的过氧化氢的存在下有效催化TMB的氧化，且产生的葡萄糖酸进一步加重肿瘤微环境中的酸性。Cu2+也会与过氧化氢反应生成-OH和Cu+同时也促进催化TMB的氧化。

3.3. Cu@GoxNM对肝癌细胞的促凋亡作用

如图3，不同浓度纳米花处理的肿瘤细胞的存活率随着浓度增加逐渐降低，这可能是由于消耗葡萄糖和Cu+生成可以形成级联反应能够促进Cu@GoxNM诱导芬顿反应生成活性氧，为了证实内化的

Figure 2. TMB dynamics curves after glucose reaction with different concentrations of Cu@GoxNM

图2. 不同浓度Cu@GoxNM的葡萄糖反应后的TMB动力学曲线

Cu@GoxNM可以通过类Fenton反应增加细胞内的ROS，使用氧化应激传感探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)研究了细胞内的活性氧水平(图4)。将Cu@GoxNM与HUH7共培养12小时，然后用2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色处理后的细胞，用CLSM观察ROS信号。与对照组组相比，Cu@GoxNM的荧光信号更亮，证实了·OH生成。结果表明，内化的Cu@GoxNM可催化细胞内葡萄糖和H2O2转化为羟自由基，从而降解纳米药物裂解并促进药物释放，这充分证明了化学动力学疗法的效果。如图5，观察活细胞和死细胞的分布情况，我们用Cu@GoxNM处理HUH7细胞12小时，然后用钙黄绿素乙酰氧甲基酯(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)染色。将对照组和处理组细胞进行荧光标记，Calcein-AM发绿色荧光(Ex = 490 nm, Em = 515 nm)，其能够轻易穿透活细胞膜，一旦进入细胞后，Calcein-AM (本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。碘化丙啶(Propidium iodide, PI)不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex = 535 nm, Em = 617 nm)，因此PI仅对死细胞染色。但Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。活细胞和死细胞分别被绿色和红色荧光染色，该结果证明了用PBS处理的细胞生长良好，而用活细胞和死细胞分别被绿色和红色荧光染色处理的细胞近80%的细胞死亡，这是由葡萄糖消耗、-OH生成的化学动力学疗法诱发的。

Figure 3. Viability of HUH7 cells after treatment with different concentrations of Cu@GoxNM

图3. 经不同浓度的Cu@GoxNM处理后HUH7细胞的存活率

Figure 4. CLSM images of ROS production in HUH7 cells after different treatments by using DCFH-DA as a probe

图4. 采用DCFH-DA作为探针检测经不同处理后HUH7细胞中生成ROS的CLSM图像

Figure 5. CLSM images of differently treated HUH7 cells subjected to Calcein-AM/PI colouring

图5. 不同处理的HUH7细胞进行Calcein-AM/PI染色的CLSM图像

4. 讨论

肝癌是全球最常见的癌症死因，也是五大致命癌症中唯一一种发病率逐年上升的癌症 [14] 。肝癌的预后很差。只有5%~15%的患者符合手术切除的条件，手术切除仅适用于早期患者，由于肝脏再生能力减弱，通常不伴有肝硬化；与左肝切除术相比，右肝切除术术后并发症的风险更高 [15] 。无论是目前的消融疗法还是化疗，都无法显著改善疾病的治疗效果，所以必须落脚于精准治疗，解决耐药和副作用一系列问题来辅助手术切除。

现阶段纳米药物(NM)广泛用于生物医学应用，它们具有独特的物理化学特征，包括较大的表面积与体积比、多种表面功能化可能性以及承载大量药物的能力，在此基础上可以与各种化疗药物结合以发挥作用。NM利用病理生理学特性，尤其是长效渗透性和保留(EPR)效应，定位于目标部位。对癌症来说，由于血管通透性增加后加上淋巴引流受损，EPR能够在静脉注射后在肿瘤中被动积聚 [16] [17] 。这种在病理部位的优先积聚除了经典的EPR特征之外，近几年被证明还依赖于跨血管内皮的主动转胞吞作用和作为储库的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的保留 [18] ，在过去几十年中已被广泛用于诊断、治疗纳米药物的开发。且相关药物的开发也不拘泥于化疗药物的使用，很多研究人员都研发出新型治疗方式，Wang等人探索了一种基于酸性/光敏树突状细胞(DC)的新抗原纳米疫苗，可将肿瘤免疫“冷”状态转变为“热”状态，他们提到肝细胞癌(HCC)通常以免疫“冷”状态出现，此后保护其免受肿瘤浸润淋巴细胞的溶细胞攻击，导致对免疫治疗的反应不佳。所以用抗原纳米疫苗来重塑肿瘤相关中性粒细胞以增强抗癌免疫反应，从而提高免疫治疗效率 [19] 。也有很多研究人员考虑治疗的想法是从改善化疗药物的耐药性，通过逆转耐药反应来增强抗肿瘤的效果。Tian的团队就考虑到索拉非尼介导的化疗是目前无法手术切除的HCC的首选，可显著提高患者的生存率。然而，其较差的水溶性限制了其生物利用度，长期单次使用并不能达到令人满意的HCC治疗效果。于是他们利用新型级联铜基金属有机框架(MOF)治疗性纳米催化剂，通过整合环氧合酶-2 (COX-2)抑制剂美洛昔康(Mel)和化疗药物索拉非尼(Sol)来扩增HCC治疗。这种纳米催化剂可以被GSH降解为类似芬顿的试剂，从而触发CDT。CDT介导的细胞毒性活性氧(ROS)可通过积累脂质过氧化物(LPO)来激活铁死亡，还会导致氧化应激扩增。属于联合了化疗和化学动力学疗法来进行治疗 [20] 。

本研究通过实验证明了CDT纳米药物的疗效优异，由此可以引发很多创新，比如与标志物结合观察药物在体内分布状况的同时可以用作诊断，比如于疗效不佳的化疗药物结合，通过相佐的作用来得到疗效互增的效果。

5. 结论

本研究成功制备了Cu@GoxNM纳米药物，且Cu@GoxNM能明显促进肝癌细胞HUH7的凋亡，通过实验验证是通过产生过量的活性氧达到了化学动力学疗法作用。

文章引用

吴婷婷,郝希伟. 铜负载葡萄糖氧化酶纳米药物用于肝癌的化学动力学治疗
The Copper-Loaded Glucose Oxidase Nanomedicines for Chemodynamic Therapy of Hepatocellular Carcinoma[J]. 临床医学进展, 2024, 14(04): 1063-1070. https://doi.org/10.12677/acm.2024.1441126

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    21. NOTES

    *通讯作者。

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