ABSTRACT

Maize is a very important food crop and economic crop. In corn production, the main application is hybrids, and male sterility has gradually become the trend of hybrid seed production due to its own advantages. In recent decades, researchers have made unremitting efforts to study the male sterility mutants of maize nuclear nucleus, and have located, cloned and functionally studied male sterility genes. At present, sterility genes have been cloned. This article mainly reviews the location, cloning and function of maize nuclear male sterility genes, and briefly introduces the more commonly used gene mapping technology and the molecular markers involved in recent years.

Keywords:Maize, Nuclear Male Sterility, Gene Mapping, Gene Cloning, BSA, Molecular Markers

玉米细胞核雄性不育基因定位及克隆的 研究进展

马萌

华中农业大学，植物科学技术学院，湖北 武汉

收稿日期：2020年5月8日；录用日期：2020年5月22日；发布日期：2020年5月29日

摘 要

玉米是一种非常重要的粮食作物和经济作物，在玉米生产中，主要应用的是杂交种，而雄性不育因其自身的优势逐渐成为杂交制种应用的趋势。近几十年来，科研人员在对玉米细胞核雄性不育突变体的研究进行了持续不懈的努力，对雄性不育基因进行定位、克隆及功能研究，目前已经有不育基因被克隆出来。本文主要对玉米细胞核雄性不育基因定位克隆和功能等进行了综述，并简要的介绍近些年比较常用的基因定位技术以及涉及到的分子标记。

关键词 :玉米，细胞核雄性不育，基因定位，基因克隆，集团分离分析法，分子标记

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1. 引言

玉米(Zea mays)是一种相当重要的粮食作物，也是非常重要的经济作物。在玉米的种植中，应用的大多为杂交种。作物育种过程中普遍利用杂种优势，其可以明显的增加作物产量、质量和抗性等。在杂交制种过程中母本去雄是最关键的一个环节，目前常用的母本去雄技术有人工去雄、化学杀雄、机械去雄和雄性不育。其中人工去雄、化学杀雄和机械去雄成本比较高，而且去雄不及时不彻底，还会对母本造成一定程度的伤害。而雄性不育植株不需要去雄，成为杂交制种应用的趋势 [1]。

植物雄性不育(male sterility, MS)是指高等植物雄性器官存在发育异常，雄配子(花粉)不能正常行使功能，但雌性器官能接受正常雄配子，从而受精结实，并将雄性不育性性状遗传给后代的现象 [2]。按照遗传或起源，可以将雄性不育分为细胞核雄性不育、细胞质雄性不育和核质互作雄性不育三类 [1]。细胞核雄性不育(Genic Male Sterility, GMS)是指雄性不育是由核基因控制的，不受细胞质的母系遗传的影响，没有正反交的遗传效应。根据遗传特征可将细胞核雄性不育分为显性核雄性不育和隐性核雄性不育两类，目前报道的核不育材料大部分为隐性核不育类型。细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)是母系遗传，由线粒体或叶绿体基因控制。核质互作雄性不育，由细胞核基因和细胞质内的线粒体基因等共同控制 [3]。

现如今，在玉米的生产中，核质互作雄性不育材料应用的更为广泛，被广泛使用，这种材料是利用三系法生产杂交种，但是此类材料存在一定的缺点，例如：细胞质单一，败育不够彻底，需要特定的恢复基因，存在比较大的病原小种专化侵染风险。而细胞核雄性不育材料是非常好的雄性不育材料，细胞核雄性不育是由单基因控制的，不存在核质互作雄性不育材料的不足 [4]，如果能够得以应用将是杂交生产中的一大飞跃。

1921年Eyster首次发现玉米无花粉型雄性不育突变体ms1之后，陆续发现鉴定命名了40多个雄性不育突变体 [5]。其中隐性核不育突变体占绝大部分，成为研究的热点，而最终能够得以应用的也主要为隐性核不育突变体，据不完全统计，至少有15个玉米隐性核不育基因完成了克隆和功能分析(表1)，分别为Ms1 [6]、Ms7 [7]、Ms8 [8]、Ms9 [9]、Ms22/Msca1 [10]、Ms23 [11]、Ms26 [12]、Ms30 [13]、Ms32 [14]、Ms33 [15]、Ms45 [16]、Ocl4 [17]、Mac1 [18]、Ipe1 [19]、Apv1 [20]。基因定位中常用BSA技术进行初步定位，再利用相应的分子标记技术进行精细定位，近几年常用的分子标记有SSR、CAPS、SNP、InDel。

本文简要的对上述已完成克隆和功能分析的玉米隐性核不育基因进行综述，并简要的介绍近些年比较常用的基因定位技术以及涉及到的分子标记。为玉米细胞核雄性不育突变体的研究及相关基因的定位提供了一定的理论价值。

表1. 已克隆的玉米细胞核雄性不育基因

2. 已克隆玉米隐性核不育基因

2.1. Ms1

Ms1被定位在6号染色体长臂。Zhou等 [6] 将突变体ms1-6050与自交系昌7-2(C7-2)杂交，构建了F₂代分离群体。利用F₂代群体的218个雄性不育个体，对ms1位点进行遗传分析。已知ms1位点与位于6号染色体的Y1基因紧密连锁 [22]，筛选Y1基因附近位于玉米6号染色体6.02bin的4个多态性SSR分子标记，并进行PCR扩增以及凝胶电泳分析，表明4个多态性标记与Ms1基因紧密连锁。利用F₂代群体的654个雄性不育个体进行精细定位，基于B73基因组序列开发了8对与上述4对标记相邻的多态性标记，构建了ms1位点所在区间的连锁图谱。根据表型的数据，进行连锁交换分析，最终将ms1位点定位在sj10-sj30之间，遗传距离为233 kb。该区域有11个候选基因，其中GRMZM2G180319基因具有与花器官发育相关的功能，为Ms1基因。Ms1基因的长度为1286 bp，包括有2个外显子和1个内含子，编码1个218个氨基酸的蛋白。该蛋白中存在一个DUF260保守结构域，属于次生器官发育相关基因(Lateral Organ Boundary, LOB)家族。突变基因ms-6050在+468~+474处存在一个碱基的缺失，导致编码区移码突变，造成基因的翻译在+494处提前终止。基因在ms1-6050突变体中编码的蛋白少了74个氨基酸，从而造成其功能的丧失。

2.2. Ms7

Ms7被定位在7号染色体长臂。Zhang等 [7] 将突变体ms7gl1、ms7-6007分别与自交系昌7-2(C7-2)杂交，并借助分子标记辅助鉴定，F1后代均为雄性可育，F2代群体雄性可育植株与不育植株符合3:1分离比，表明ms7gl1和ms7-6007均为单基因隐性遗传。ms7-6007/ms7-6007纯合植株用ms7gl1/+杂合植株的花粉授粉，F1代群体雄性可育植株与不育植株符合1:1分离比，表明ms7-6007的突变基因与ms7gl1突变基因是等位基因。利用突变体ms7gl1与自交系昌7-2(C7-2)杂交得到的F2代群体的154个雄性不育个体进行初步定位，利用BSA技术，筛选SSR标记，并对突变位点进行遗传分析，有9对SSR标记与Ms7基因连锁，Ms7基因被初定位在SSR标记umc2617和bnlg1808之间，遗传区段为4.8 cM。利用F2代群体的611个雄性不育个体进行精细定位，在umc2617和bnlg1808之间设计了6对CAPS引物，将Ms7定位在EP299和EP302之间，遗传距离为180 kb。在这个区间中有6个候选基因，其中标记EP239与不育性状表现为共分离，该序列来源基因为GRMZM5G890224，该基因编码一个PHD-finger结构域的蛋白。Ms7基因全长2435 bp，由三个外显子和两个内含子组成，编码670个氨基酸蛋白质，第三个外显子编码的氨基酸能够形成保守的PHD-finger结构域。通过对突变体ms7-6007、ms7gl1中目的基因DNA进行测序，突变基因ms7-6007全长2453 bp，在第一个外显子的+22位点插入了3 bp，在第二个外显子的+814位点插入了7 bp，蛋白翻译发生移码在+1426处终止导致缺乏亮氨酸拉链区域和PHD结构域；突变基因ms7gl1全长3543 bp，在第三个外显子的+1179位点插入了1136 bp转座子(DTA_ZM00023)，翻译在+1225处提前终止，并导致缺乏亮氨酸拉链区域和PHD结构域。这些结果表明GRMZM5G890224为引起ms7突变体不育基因。

2.3. Ms9

Ms9被定位在1号染色体短臂。Albertsen等 [9] 利用由大约450个个体组成的小群体鉴定基因连锁的两侧标记，利用从小群体中鉴定的两侧标记和新设计的标记鉴定重组子，确定ms9基因在1号染色体的物理间隔。Ms9的一个候选基因被发现是一个R2/R3植物特异性myb转录因子。突变基因ms9-ref在第一个外显子中有4个碱基对插入，导致翻译移码突变。这种突变发生在R2结合域；突变基因ms9-AD62A在第三个外显子中有一个16-bp缺失，扰乱了R3结合结构域。

2.4. Ms22/Msca1

Ms22/Msca1被定位在7号染色体短臂。Chaubal等 [21] 利用msca1-ref等位基因，用标记物对该群体进行定位，并用跨越2个BAC(细菌人工染色体)克隆的标记pco144723和b49p15.f确定遗传距离为155 kb。BACs的测序和其他标记的发展将遗传距离缩小到9 kb。这个区域的序列显示只有一个开放的阅读框，编码一个植物特异性谷胱甘肽还蛋白基因。突变基因msca1-ref谷胱甘肽还蛋白基因缺失，有7823 bp缺失，谷胱甘肽下游4 kb处有1268 bp插入。对msca1-mg12等位基因的克隆和序列分析显示，谷胱甘肽基因3’区有490 bp的缺失。Msca1基因中存在一个氧化还原区的序列CCMC，不育植株缺少GSH结合位点，而在可育植株中存在的GSH结合区LPVVVGGRLLG在不育突变体中不存在。在mscal-6036等位基因的克隆和测序中，检测到了有850 bp的插入，这一插入创造了一个8 bp的宿主位点重复(GTCGAGA)，并且它似乎还包含小的完美的TIRs [10]。

2.5. Ms23

Ms23被定位在8号染色体短臂。Nan等 [11] 利用SNP-genotyping技术对Ms23进行高通量遗传定位，Ms23最初被定位在6号和8号染色体上。检测两个相关区域两侧的PCR标记，并确认该雄性不育表型与8号染色体上8.00~8.01 bins附近的多态性标记共同分离。利用ms23-ref、ms23-6027或ms23-6059突变体各250个以上雄性不育个体进行定位。Ms23被定位在8S染色体末端的0.75 mb范围内。该区域有15个候选基因，利用qTeller检索RNA序列数据，发现只有GRMZM2G021276，跨越位置95823到98367，编码预测的bHLH蛋白，显示tassel 特异表达。Ms23基因全长2361 bp，有四个外显子，编码365个氨基酸的bHLH蛋白。在突变基因ms23-ref中，整个基因被删除，这个删除包含高达96.5 kb。突变基因ms23-6027在1076位插入2-bp(AT)，使在预测的bHLH区域的正上游位置1091处有一个早期终止密码子，引起移码突变。Ms23编码一个花药特异性的、预测为绒毡层分化所需的碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子。RNA-seq和蛋白质组学数据以及酵母双杂交分析表明，Ms23与Ms32、bHLH122和bHLH51一起依次作为同二聚体或异二聚体来指导绒毡层发育。其中，Ms23是最早的作用因子，位于bHLH51和bHLH122的上游，控制着绒毡层的规格和成熟度。相比之下，Ms32是组成性的，独立调节的，在绒毡层分化中比Ms23晚。

2.6. Ms30

Ms30被定位在4号染色体长臂。Zhou等 [13] 将突变体ms30-6028与自交系昌7-2(C7-2)杂交，构建了F2代分离群体。利用F2代群体的118个雄性不育个体，利用BSA技术，按照maizeGDB中标记数据库信息，筛选SSR分子标记，对突变位点进行遗传分析，有5对多态性分子标记与ms30位点连锁，Ms30基因初步定位在umc1808和umc2046之间。另取F₂代群体284株，对其进行育性调查，雄性可育株与不育株比符合3:1的单基因分离比。从maizeGDB中检索到umc1808至umc2046之间的9对多态标记(包括umc1808和umc2046)，对该F₂群体进行了基因型鉴定，构建了ms30位点遗传连锁图谱，并根据单株的育性数据，Ms30被初定位在idp1991至tidp9194 之间，遗传距离为2.9 cM。对Ms30进行精细定位，调取B73基因组序列并设计了多态性标记ep462，将Ms30定位在ep462和tidp3747之间，遗传距离为41.2 kb。该区域有6个候选基因，其中一个预测为GDSL脂肪酶家族基因GRMZM2G174782具有与花器官发育相关的功能，为Ms30基因。该基因有2370 bp长，含有3个外显子和2个内含子，有1277bp的蛋白质编码区序列。DNA测序结果表明，突变基因ms30-6028的蛋白质编码序列有4处核苷酸存在插入或缺失，突变基因在1、2、4处分别插入1、3、9个碱基，在第3处突变缺失了4个碱基。

2.7. Ms32

Ms32被定位在2号染色体长臂。Chaubal [21] 等将突变基因ms32-ref初部定位在2号染色体UNC139标记的远端。Moon等 [14] 利用来自1:1分离群体的8个雄性可育个体和9个雄性不育个体的gDNA池，利用22对InDel引物进行初定位，遗传距离为10 cM，其中2号染色体上的引物对IDP792表现出多态性。利用249个雄性不育个体组成的更大的定位群体，利用BSA法，利用24对IDP引物进行定位，将Ms32定位在标记umc1049和JM16之间，遗传距离为0.5 mb。在该区域有15个候选基因。在GRMZM2G1633233基因模型中发现ms32-ref突变基因携带大于1.6 kb的缺失，GRMZM2G1633233基因的长度约为10 kb，包含四种带注释的转录类型，其中一种转录类型与bHLH蛋白的N-末端结构域和液泡ATP合酶亚基H的C-末端相似，而水稻、苞片和高粱基因组中bHLH基因和液泡ATP合酶亚单位H基因被注释为单独的基因。GRMZM2G1633233_T02和GRMZM2G1633233_T03对应于bHLH结构域，而GRMZM2G1633233_T04对应于液泡ATP合酶亚基，另外对EST序列和PlantGDB组装的唯一转录本研究，结果表明GRMZM2G1633233是两个基因的嵌合体，其中一个是Ms32。ms32-ref中的缺失被证实包括bHLH基因的C末端。GRMZM2G1633233是两个基因：GRMZM2G1633233_T02是编码bHLH蛋白的Ms32基因，GRMZM2G1633233_T04是液泡ATP合酶亚单位H基因。Ms32基因编码一种基本的螺旋–环–螺旋(bHLH)转录因子，在花药发育过程中起着重要的分裂和分化调控作用。Ms32基因由四个外显子和三个内含子构成。候选基因(GRMZM2G1633233_T02)由四个外显子组成，它们被预测编码219个氨基酸蛋白。ms32-ref中的缺失在第2外显子之后立即开始，并延伸到第4外显子之后，从而使N-末端bHLH域保持完整，只有该基因剩余的N-末端区域(外显子1和2)仍在ms32-ref中表达。

2.8. Ms33

Ms33被定位在2号染色体长臂。已知ms33位点位于2号染色体长臂 [22]。Zhang等 [15] 按照maizeGDB中标记数据库信息，筛选出5个在ms33位点呈多态性的SSR分子标记，利用228株雄性不育植株进行PCR扩增和凝胶电泳分析，检测不育基因与标记物之间的连锁反应。结果表明，这5个标记与ms33位点密切相关。利用从maizeGDB检索到的9对来自mmc0381到umc2214之间的多态性标记，对F₂群体的单株进行基因分型，构建了ms33位点所在区域的遗传连锁图谱。根据单株的育性资料，Ms33基因被初步定位在EP97和bnlg1893之间，遗传距离为11.5 cM。检索B73基因组序列，设计了4对多态性标记EP198、EP603、EP605和EP480。最后，Ms33被定位于EP603和EP605之间，遗传距离为349kb。该区间有15个候选基因，其中GRMZM2G070304基因为GPAT家族基因，具有与花器官发育相关的功能，为Ms33基因。该基因全长2198 bp，含有2个外显子和1个内含子。突变体ms33-6029中突变基因ms33-6029全长3566 bp，在第一个外显子+223处插入了一个长为1368 bp的转座子(DTA_ZM00216)，基因翻译在+288处提前终止。在野生型B73中，Ms33基因的蛋白质编码序列为1578 bp长。通过该基因的cDNA序列的模拟翻译，发现该基因编码525个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列和GenBank SwissProt蛋白质数据库的blastx分析显示，该蛋白质含有Lysophospholipidacyltransferases (LPLAT)保守结构域。在突变体ms33-6029中，由于转座子插入了Ms33基因序列的核苷酸223导致氨基酸75后的改变，编码的蛋白质仅包含95个氨基酸，并且突变基因编码的蛋白质不再具有任何功能域。该实验结果显示突变体中Ms33基因的序列的改变直接导致翻译氨基酸的序列变异并提前终止翻译，尤其会破坏基因的LPLAT结构域。

2.9. Ocl4

Ocl4被定位在1号染色体短臂。Ocl4基因中包括10个外显子，编码881个氨基酸的假定蛋白，包含HD-ZIP-IV蛋白的四个特征结构域，即home、leu-cine-zipper、START和HD-SAD结构域。突变基因ocl4-1在外显子6中插入了转座子Mu8，在玉米(TUSC)的先锋性状实用系统中发现，而突变基因ocl4-2在外显子5和内含子5的接合处插入了Mu8，源于生物膜突变型集合 [17]。

2.10. Mac1

Mac1被定位在10号染色体短臂。Sheridan [23] 等将Mac1定位到10S染色体，在遗传标记oy1和T9-10b之间。该基因被定位在标记TIDP8865和IDP8390之间，遗传距离为900 kb。该区域有14个候选基因，其中基因模型GRMZM2G027522与水稻TDL1A和拟南芥TPD1基因相似，缺失等位基因导致与mac1突变体有相似的表型，GRMZM2G027522模型为Mac1基因。利用引物P222、P223和P220、P223对突变基因mac1-1进行基因型鉴定，利用引物P222、P223、P258和P292对突变基因mac1-Y211进行基因型鉴定。Mac1基因中包括4个外显子和3个内含子；通过DNA序列分析，发现mac1-1等位基因中有一个1263 bp的缺失，从内含子2开始，延伸到外显子4；mac1-Y211等位基因内含子2中插入了4.9kb的自主MuDR元件 [18]。

2.11. Ipe1

Ipe1被定位在1号染色体短臂。Chen等 [19] 前期将Ipe1基因初步定位在SSR分子标记S1和S11之间。后期对Ipe1基因进行精细定位，开发了9对多态性InDel标记，利用F2群体的4021个突变植株，最终将目的基因组区域缩小到InDel标记S4和S8之间，遗传距离约290kb。该区域有6个候选基因，通过对ipe1基因组DNA进行测序以及利用基因特异性引物P123F和Mu1转座子特异引物I10R的组合，表明突变体GRMZM2G434500基因中Mu1转座子插入在了第三个外显子开始的第64个碱基对处。通过对ipe1-1、ipe1-2、ipe1-3基因组测序组测序进一步证明GRMZM2G434500为引起ipe1突变体不育基因。利用cDNA测序，表明Ipe1基因由三个外显子和两个内含子组成，编码一个含582个氨基酸蛋白。利用SMART进行蛋白质结构域分析以及与NCBI数据库中全长蛋白进行比对分析，表明在Ipe1基因N端氨基酸和C端氨基酸包含两个GMC氧化还原酶功能域，即Ipe1编码GMC氧化还原酶。

2.12. Apv1

Apv1被定位在10号染色体长臂。Zhang等 [20] 将突变体apv1与自交系B73杂交，F₁后代均为雄性可育，BC₁F₁(以突变体apv1为杂交亲本)中249个个体雄性可育植株与不育植株符合1:1分离比，F₂代群体中311个个体雄性可育植株与不育植株符合3:1分离比，表明apv1为单基因隐性遗传。利用F₂代群体的480个雄性不育个体进行初定位，设计了一系列多态性标记对，利用分子标记YS-38和YS-39将基因定位区域缩小到1.32 Mbps。利用2012年得到的BC₁F₁的不育个体组成的更大的定位群体进行精细定位，利用分子标记YS-48和YS-75将Apv1基因定位区域缩小到660 kb。有21个基因在这个区间中，而在减数分裂雄穗中表达的有5个基因，其中GRMZM5G830329在减数分裂雄穗中高表达。对目的基因进行DNA测序，apv1突变基因有848 bp的缺失，该缺失跨越以下两个相邻基因：GRMZM5G830329和GRMZM2G439268。该缺失始于GRMZM5G830329的外显子2，延伸至GRMZM2G439268的外显子1。利用CRISPR/Cas9对GRMZM5G830329基因和GRMZM2G439268基因敲除，并对GRMZM5G830329敲除和对GRMZM2G439268敲除个体花药使用I2-KI染色观察，前者不能观察到黑色染色的花粉粒，后者观察到有染色良好的花粉粒。GRMZM5G830329基因敲除系(ms/ms)与apv1(ms/+)的杂交以1:1的比例产生雄性不育和可育植株(v2 = 0.05，0.5 < P < 0.9)。这一结果证实了GRMZM5G830329的缺失导致apv1雄性不育，为Apv1。Apv1编码P450亚区CYP703A2-Zm的一个成员，CYP703A2-Zm含有530个氨基酸。

上述很多基因定位都用到了BSA这项技术，以及相关的分子标记技术，接下来简单介绍所用到的基因定位方法和分子标记技术。

3. BSA技术

BSA技术在基因定位的初步定位中广泛应用，上述基因的定位中大部分都应用了BSA技术，下面简要介绍最近大热的BSA技术

集团分离分析法(Bulk-segregant analysis, BSA)原理是：在目的基因表型存在差异的亲本后代中选择性状分离的的植株，构成两个亚组或群体；将每个群体的DNA进行混合，形成了两个性状相关的“基因池”；利用分子标记对这两个基因池进行分析，找到与目的基因性状连锁的分子标记；利用得到的分子标记，分析作图群体，分子标记和目的基因的连锁得到了进一步的检测，完成了标记在基因上的定位。特点是：利用特定的分离群体；只选择目的基因性状；不存在环境和人为因素的影响；省时省力 [24]。

步骤为：

1) 分别提取两个群体的DNA，得到了两个分离群体的DNA样品，按相同比例把各群体中各样本DNA混合；

2) 降低高群体基因组的复杂性，以获得复杂性降低的DNA样本；

3) 以同等比例混合降低复杂性的分离群体DNA，采用高通量测序方法进行测序；

4) 对两组群体DNA样本的测序结果进行比较，找到了序列标记，然后根据序列标记的多样性差异，检测出与性状相关的标记 [25]。

4. 分子标记

4.1. SSR标记

简单序列重复(Simple Sequence Repeats, SSR)即微卫星标记，又被称作简单序列重复标记。原理是：对重复序列两端特定短序列设计引物；进行PCR扩增；进行琼脂糖凝胶电泳；进行放射自显影；最终在其重复单位数不同的DNA区域中检测出多态性。特点是：共显性遗传；有简单的标记带型，记录的条带也比较一致且比较明确和客观；没有生物学方面的数量方面的限制；不需要很多DNA用量，且不需要很高的质量要求；每个位点都有很多种等位形式；多态性比较高；实验过程简单易操作。局限性是：建立、筛选基因组文库才能获得SSR标记，还需要测序、设计引物等，所需要实验过程多且复杂，费时费力 [26]。

4.2. CAPS标记

酶切扩增多态性(Cleaved Ampli fied Polymorphism Sequences, CAPS)技术又被称作PCR-RFLP法，综合了PCR技术和RFLP技术。原理是：设计特异性引物，利用PCR扩增某个基因或片段，利用特定的限制性内切酶切割扩增产物，利用凝胶电泳分离片段，然后进行RFLP分析，从而显示出扩增产物DNA片段的多态性。特异性PCR引物是根据已知位点的核苷酸序列而设计的，引物长度大概为19~27 bp。特点是：共显性；DNA用量少；所需引物较长；操作简单。局限性是：必须利用限制性内切酶筛选，费时费力；突变位点少 [27]。

4.3. SNP标记

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是指基因组中发生突变，该突变由单个核苷酸碱基的改变(包括单个碱基的缺失、插入、置换或颠换)引起的，从而引起基因组DNA序列的多态性。SNP标记是第三代DNA分子标记。特点是：二等位基因性；位点比较多，分布比较广；遗传稳定性高；多态性比较高；检测快速，能够进行自动化分析。局限性是：成本高，标记少 [28]。

4.4. InDel标记

InDel是指在亲缘关系较近的物种或同一物种的不同个体之间，在相同的基因位点的核酸序列中插入或缺失大小不同的DNA片段。InDel是一种同源基因进行序列比对而产生空位的现象。原理是：设计特异性引物，进行PCR扩增，进行凝胶电泳。特异性引物的设计需要依据插入/缺失位点两侧的序列而设计，这样才能得到多态性标记。根据多态性标记的长度不同，利用凝胶电泳进行分型。特点是：InDel标记准确性高和稳定性高；分布比较广，数量比较多；不会产生因为特异性和复杂性造成的分析歧义。局限性是：二等位基因性，没有很多的遗传信息量；对于基因组序列还没有完全测序的作物，设计开发引物比较难 [29]。

近些年来，众多学者对玉米细胞核雄性不育基因进行定位及克隆，他们大多采用BSA技术进行初步定位，将不育基因定位在具体的染色体的某一区段，并筛选分子标记，再利用筛选出的分子标记对单株进行鉴定，对不育基因进行精细定位，而近些年来使用的分子标记大多是SSR、CAPS、SNP、InDel。

5. 存在问题与展望

近些年来逐渐有玉米细胞核雄性不育基因被克隆出来，但是仍有大量的基因未被克隆出来，克隆出来的基因也很少得到应用，玉米细胞核雄性不育材料是一种非常好的材料，如果大量的得以应用，必然会对玉米的杂交制种有重要的意义。

本文总结了近些年已经克隆的细胞核雄性不育基因和相应的基因定位的方法等，以期望对之后的研究有一定的借鉴意义，希望更多的研究学者从事这方面的研究，更多的基因被克隆，而细胞核雄性不育也能更广泛的应用到实际生产当中，这需要更多的学者前仆后继的努力。

文章引用

马 萌. 玉米细胞核雄性不育基因定位及克隆的研究进展
Advances in Research on the Location and Cloning of Maize Nuclear Male Sterility Gene[J]. 农业科学, 2020, 10(05): 332-341. https://doi.org/10.12677/HJAS.2020.105049

参考文献