¹上海应用技术大学生态技术与工程学院，上海

²上海弘路建设发展有限公司，上海

³上海应用技术大学化学与环境工程学院，上海

收稿日期：2021年6月6日；录用日期：2021年7月22日；发布日期：2021年7月29日

摘要

目的：《中国药典》2015年版中将毛兰素含量定为鼓槌石斛品质的判断指标，论文采用高效液相色谱法测量39种石斛属中具有抗癌作用的毛兰素的含量。方法：采用Shim-pack GIS C18色谱柱(4.6 × 250 mm, 5 μm)，以乙腈–三氟乙酸水溶液(pH = 3.25)为流动相，流速1.5 ml/min (水相0.9 ml/min，有机相0.6 ml/min)，检测波长232 nm，柱温25℃，进样量20 μl。结论：39种石斛仅在鼓槌石斛中检测到毛兰素，含量为0.047%；本检测方法准确，快速，重复性好，适合石斛属植物毛兰素的含量鉴别分析。

关键词

石斛，高效液相色谱法，毛兰素，抗癌作用，品质鉴别分析

Quality Identification Analysis of Dendrobium Based on the Content of Erianin

Qingjun Huang¹, Zhenghui Wan², Jinwen Huang³, Fanhong Wu³

¹Ecological Technique and Engineering College, Shanghai Institute of Technology, Shanghai

²Shanghai Honglu Construction Development Company, Shanghai

³School of Chemical and Environmental Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai

Received: Jun. 6^th, 2021; accepted: Jul. 22^nd, 2021; published: Jul. 29^th, 2021

ABSTRACT

Objective: In the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia, the content of erianin was specified as a judgment indicator of the quality of Dendrobium chrysotoxum. This paper determinates the content of erianin which has anticancer effect in 39 species of Dendrobium by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: The samples were separated on Shim-pack GIS C18 column (4.6 * 250 mm; 5 μm) using a mobile phase consisting of trifluoroacetic acid-acetonitrile (pH = 3.25) at a flow rate of 1.5 mL/min (aqueous phase: 0.9 ml/min, organic phase: 0.6 ml/min) and detected at 232 nm, and the column temperature was kept at 25˚C. The injection volume was 20 μL. Conclusion: Among the 17 species of Dendrobium determined, erianin was detected only in Dendrobium chrysotoxum and the content was 0.047%. This method is accurate, rapid and suitable for the identification and analysis of the content of erianin in Dendrobium.

Keywords:Dendrobium, High Performance Liquid Chromatography, Erianin, Anti-Cancer Activity, Quality Identification Analysis

Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

石斛属(Dendrobium)植物为兰科最大属之一，石斛为石斛属植物统称，在中国约有74种及2个变种，主要产于秦岭以南诸省，其中尤以云南为多 [1]。石斛为多年生附生草本植物，多生于岩石或密林树干上。近年来野生石斛资源遭到过度挖掘，使得野生石斛处于濒危状态。

石斛作为我国传统的药用及观赏植物，有着悠久的应用历史。在不同时期，药用石斛的品种范围有所变化。石斛始载于《神农本草经》，因其具有多重药用功效而被历代医学家推崇 [2]。《中华人民共和国药典》2015年版中收录了金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl)，鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl)，流苏石斛(Dendrobium fimbriatum Hook)的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎 [3]。因此，从广义上的《中国药典》以及长期的认知上看，常见的石斛均被认为是药用植物 [4]。近20年来，国内外学者大量研究表明石斛属植物，含有多糖、生物碱、菲类、联苄类、香豆素、氨基酸等多种具有药理活性的化学成分，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、调节血糖、抗炎等作用。

毛兰素{C18H22O5,2-甲氧基-5-[2-(3,4,5-三甲氧基–苯基)–乙基]–苯酚}为分离自鼓槌石斛中的一种低分子量天然产物 [5]，其相对分子量为318.36，属于联苄类化合物。《中国药典》2015年版中将毛兰素含量定为鼓槌石斛品质的判断指标，含量不能低于0.03% [3]。邓同兴等 [6] 研究发现毛兰素可在体外诱导人肺癌A549细胞凋亡。苏鹏等 [7] 研究表明毛兰素能诱导人肝癌Huh7细胞凋亡并使其细胞周期阻滞于G2/M期，从而起到抑制其增殖作用。Sun等 [8] 研究发现毛兰素对人乳腺癌T47D细胞增殖有明显的抑制作用，能激活免疫逃逸信号通路来诱导T47D细胞凋亡、抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)表达，并导致细胞周期停滞，且毛兰素不影响正常乳腺上皮MCF10A细胞的增殖。毛兰素通过多机制、多层面起到抑制肿瘤的效果，在临床治疗方向有很大的应用前景 [9]。本研究试图建立高效液相色谱法对39种石斛中毛兰素含量进行检测，揭示毛兰素在这39种石斛中的分布情况，为石斛属植物的品质鉴定，繁育栽培、育种选种以及石斛属植物的开发及可持续利用提供化学成分依据。

2. 材料、试剂与仪器

39种健康无病害的石斛鲜茎段，产地为云南或四川；毛兰素标准品HPLC纯度 ≥ 98%，；水，乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯；LC-20A HPLC仪(SPD-20A紫外检测器，双泵)。

3. 方法与结果

3.1. 色谱条件

色谱柱为Shim-pack GIS C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm)，流动相为乙腈-三氟乙酸水溶液(pH = 3.25)，流速1.5 ml/min (水相0.9 ml/min，有机相0.6 ml/min)，检测波长232 nm，进样量20 μl，柱温25℃。在上述条件下毛兰素保留时间约为21 min，如图1所示。

图1. 毛兰素标准品(a)、鼓槌石斛(b)的HPLC图；1.毛兰素峰

3.2. 标准品溶液制备

精密称取毛兰素标准品10.13 mg，加入10 ml无水乙醇，配制成浓度为1.013 mg/ml的标准品溶液。

3.3. 供试品溶液制备

取所收集的39种石斛健康无病害的石斛鲜茎段，去除叶片及叶鞘，将茎洗净并剪成小段，放于70℃鼓风干燥箱中干燥后粉碎，过40目筛，取250 mg粉末，加入10 ml无水乙醇，超声处理45 min (功率250 W频率45 kHz)，冷却后用无水乙醇补足失重，作为供试品溶液。

3.4. 方法学考察

3.4.1. 线性关系考察

将2.2项下标准品溶液梯度稀释，将得到的梯度浓度标准品溶液，在2.1项下色谱条件连续进样6次，如表1所示，以进样毛兰素浓度X (mg/ml)为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明毛兰素浓度在0.00395703~0.126625 mg/ml范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y = 33462744.98X − 5801.6243，R² = 0.99975 (n = 6)。

表1. 线性关系

3.4.2. 精密度试验

将2.2项下毛兰素标准品溶液稀释三倍，在2.1项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算得RSD为0.41% (n = 6)，如表2所示。

表2. 精密度测定结果

3.4.3. 重复性试验

精密称取六份鼓槌石斛样品，每份250 mg，按2.3项下制成供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，RSD = 2.6% (n = 6)，表明本法重复性良好(见表3)。

表3. 重复性试验结果

3.4.4. 稳定性试验

取一份样品按2.3项下制成供试品溶液，将20 μl样品溶液在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分别注入液相色谱仪，记录峰面积，RSD = 2.3% (n = 6)，样品在10 h内稳定性良好(见表4)。

表4. 稳定性试验结果

3.4.5. 加标回收率试验

分别精密吸取已知含量的供试品溶液六份，每份1 ml，分别精密加入毛兰素标准品溶液1 ml，加甲醇稀释至4 ml，注入液相色谱仪，计算回收率，平均回收率为99.96%，RSD = 1.6% (n = 6)，结果表明本法具有较好的回收率(见表5)。

表5. 加样回收率试验结果

3.4.6. 样品测定

将2.4.3项中的平均峰面积代入回归方程，计算得本试验所用的鼓槌石斛中毛兰素(以干燥品计)含量为0.047%。所检测的39种石斛毛兰素检出率如表6所示。

表6. 39种石斛中毛兰素含量测定

4. 讨论

本实验中流动相采用乙腈–磷酸溶液和乙腈–三氟乙酸水溶液，将毛兰素标准品注入液相色谱后，前者毛兰素峰出现较大前沿峰，且峰宽较大，稳定性差；后者只有将三氟乙酸水溶液pH调至3.25时所得毛兰素峰峰形最好，理论塔板数达8600以上，且分离度高，故选择后者作为流动相。超声时间分别采用了15 min、45 min和60 min，结果显示超声15 min毛兰素提取率明显低于45 min，超声60 min和超声45 min提取率差别不大，为保证药材的提取率以及经济性和简易性，故选择超声45 min。另外，本研究中溶剂选择无水乙醇，而《中国药典》2015版中测量毛兰素的方法使用的溶剂为甲醇，由于毛兰素在甲醇及无水乙醇中的溶解度没有差别，考虑到本次试验所测石斛品种较多，所以选择更加经济的无水乙醇作为溶剂。

本研究所测39种石斛中，仅在鼓槌石斛中检测到含量为0.047%的毛兰素，其毛兰素含量高于《中国药典》2015年版中0.03%品质判断指标；其余38种石斛均未检出。部分结果与同类研究存在差异。夏克中等 [10] 在云南产的鼓槌石斛中检出毛兰素含量高于0.16%；本次试验中在金钗石斛和铁皮石斛中均未检测到毛兰素，但有研究报道在铁皮石斛和金钗石斛中发现毛兰素 [11] [12]。造成这些差异的原因可能有多种情况。陈晓梅等 [13] 报道了石斛中联苄类成分受到栽培方式、生长环境等的影响；龚庆芳等 [14] [15] 研究表明铁皮石斛和鼓槌石斛中毛兰素含量受产地和光照强度的影响；杨虹等 [16] 测量了不同采收时期的鼓槌石斛中毛兰素的含量，发现采收时期不同的鼓槌石斛中毛兰素含量差异巨大。显然，石斛中毛兰素的含量受到多方面因素的影响，是由其基因(不同种及品种)和环境(生长条件、生长期及生长年限等)互相作用的结果。所以，在鉴别或培养优质石斛时，首先需要注意种间差异；其次，即使筛选出优良的石斛，也需要比较不同品种在不同环境以及不同生长年限下的品质差异，只有这样才能真正全面而客观地评价石斛品质。

基金项目

上海应用技术大学协同创新基金(XTCX2018-3)。

文章引用

黄清俊,万正辉,黄金文,吴范宏. 基于毛兰素含量为指标的石斛属植物品质鉴别分析
Quality Identification Analysis of Dendrobium Based on the Content of Erianin[J]. 植物学研究, 2021, 10(04): 560-567. https://doi.org/10.12677/BR.2021.104070

参考文献