¹青岛大学附属医院心内科，山东 青岛

²日照市人民医院急诊科，山东 日照

³日照市人民医院麻醉科，山东 日照

⁴青岛大学附属心血管病医院，山东 青岛

收稿日期：2023年9月17日；录用日期：2023年10月11日；发布日期：2023年10月18日

摘要

目的：评估急性病毒性心肌炎(AVMC)患者外泌体circular RNA (circRNA)的表达差异并揭示其潜在功能。方法：于2021年7月至2023年3月在青岛大学附属医院采集9例临床确诊为AVMC的患者和9例健康对照(HC)的外周血。采用RNA高通量测序检测外泌体circRNA表达。我们进行了GO及KEGG富集分析预测circRNA在外泌体中的潜在分子、生物学功能和相关信号通路。我们选取了3个外泌体中差异性表达的circRNA进行了实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)对测序结果进行了验证。结果：以P < 0.05和Fold Change绝对值 > 2为截断值筛选具有差异性表达的circRNA。本研究共发现了外泌体中有84个差异性表达的circRNA，其中83个下调及1个上调。GO和KEGG富集分析结果表明，差异表达的circRNA可能与ATP酶活动、GTP酶结合、溶酶体膜、微管、内质网蛋白质加工等有关。PCR结果表明hsa_circ_0001546在AVMC患者中下调，与测序结果一致。结论：差异性表达的hsa_circ_0001546可能是AVMC的潜在诊断标志物；差异性表达的circRNA在AVMC中具有一定生物功能，可能参与AVMC的发病机制。

关键词

病毒性心肌炎，环状RNA，外泌体

Transcriptional and Functional Analysis of Plasma Exosomal circRNA in Acute Viral Myocarditis

Qi Zhang^1,2, Qinchao Wu¹, Yanyan Zhai³, Xianming Chu^1,4*

¹Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong

²Emergency Department, The People’s Hospital of Rizhao, Rizhao Shandong

³Anesthesiology Department, The People’s Hospital of Rizhao, Rizhao Shandong

⁴Department of Cardiology, The Affiliated Cardiovascular Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong

Received: Sep. 17^th, 2023; accepted: Oct. 11^th, 2023; published: Oct. 18^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To evaluate the differential expression profile of exosomal circular RNA (circRNA) in patients with acute viral myocarditis (AVMC) and to reveal its potential biological function. Methods: From July 2021 to March 2023, the peripheral blood of 9 patients clinically diagnosed with AVMC and 9 healthy controls (HC) were collected in the Affiliated Hospital of Qingdao University. CircRNA expression in exosomes was detected by high throughput RNA sequencing. We performed GO and KEGG functional analyses to predict the potential molecules, biological functions, and associated signaling pathways in exosomal circRNA. We selected three differentially expressed circRNAs in exosomes and performed quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) to verify the sequencing results. Results: circRNA with differential expression was screened with P < 0.05 and Fold Change absolute value > 2 as truncation values. In this study, 84 differentially expressed circRNAs were found in exosomes, of which 83 were down-regulated and 1 was up-regulated. GO and KEGG analysis showed that differentially expressed circRNA may be related to ATPase activity, GTPase binding, lysosomal membrane, microtubules and protein processing in endoplasmic reticulum. PCR results showed that hsa_circ_0001546 was down-regulated in AVMC patients, which is consistent with the sequencing results. Conclusion: The differentially expressed hsa_circ_0001546 may be potential diagnostic markers for AVMC. Differentially expressed circRNAs may have certain biological functions in AVMC and be involved in the pathogenesis of AVMC.

Keywords:Viral Myocarditis, Circular RNA, Exosome

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

心肌炎是由多种病因引起的心肌炎症，尤其是病毒感染，病毒感染引起的心肌炎被定义为病毒性心肌炎(VMC) [1] 。VMC会导致心力衰竭、心律失常，甚至心源性休克和死亡 [2] [3] 。然而，传统的诊断方法，包括血清心肌肌钙蛋白、心电图(ECG)、心脏磁共振成像(cMRI)和超声心动图，特异性和敏感性有限 [4] [5] [6] 。心肌活检是诊断心肌炎的金标准，但由于其对心脏的损害，在临床中的应用受到严格限制 [7] 。因此，迫切需要探索一种特异性和敏感性高的无创心肌炎诊断方法。

外泌体几乎可由所有细胞分泌，是通过向外出芽从质膜向外释放的直径约40~160 nm的细胞外囊泡，内部包含多种蛋白质及核酸成分，如mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等 [8] [9] 。外泌体富含于各种体液，由于具有双层结构，外泌体中的RNA可以免受RNA酶降解 [8] 。之前研究表明，circRNA在VMC中具有差异性表达 [10] ，但其含量在循环血液中较低且稳定性差，研究前景并不明朗 [11] 。近期有研究报道，外泌体具有保护心肌炎的作用 [12] [13] 。然而，目前尚不清楚哪个特定的外泌体成分具有保护功能。因此，本研究旨在探究外泌体circRNA对于AVMC的诊断价值及生物功能。

2. 方法

2.1. 入选病人及样本获取

于2021年7月至2023年3月在青岛大学附属医院采集9例AVMC患者外周血标本，同时采集9例健康对照标本。所有AVMC病例诊断参考2013年欧洲心脏病年会心肌炎诊断 [14] 。排除标准如下：冠状动脉疾病、瓣膜病、扩张型或肥厚型心肌病、先天性心脏病；自身免疫性疾病引起的心肌炎；以及接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗的AVMC患者。所有>18岁的患者均行冠状动脉造影或冠状动脉CT以排除冠心病的诊断。健康对照是年龄和性别与AVMC患者匹配的健康志愿者。AVMC患者的基本信息及临床特征见表1。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会(编号：QYFY WZLL 27489)批准，每位患者或其家长签署知情同意书。采集血样(10~15 ml)至EDTA抗凝管中。

表1. AVMC患者基本信息

2.2. 外泌体分离

在4℃条件下，通过3步离心从人血浆中分离出外泌体。首先将血样4000 g离心15 min后收集上清。然后将上清液10,000 g离心30 min。最后将外泌体在100,000 g超离心70 min。最后将外泌体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬，100,000 g离心70 min，去除可溶性和分泌蛋白。应用Qiagen试剂盒法提取外泌体中的RNA。

2.3. RNA测序

提取好的外泌体RNA样本干冰运送，进行质检，在保证提取的RNA浓度和纯度合格的情况下，使用测序仪novaseq PE150对外泌体中的circRNA进行测序。利用R语言limma包的分位数算法进行原始数据归一化，以Fold Change绝对值大于2、P值 < 0.05作为截断值，初步筛选在AVMC中具有差异性表达且有统计学意义的circRNA。

2.4. 功能分析

GO、KEGG富集分析用于预测差异性表达的circRNA的潜在生物学功能及所参与的信号通路，通过R语言的clusterProfiler包进行费歇尔精确检验从而对差异性表达的基因进行分析。

图1. 外泌体circRNA热图

2.5. PCR实验

为了验证测序结果，我们选择了3个下调的circRNA对9对样本进行了qRT-PCR验证实验。cDNA的合成使用Vazyme HiScript II cDNA Synthesis逆转录试剂体系。qRT-PCR采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit试剂盒(Accurate Biotechnology，中国湖南)。β-actin作为血清外泌体circRNA定量的不变对照。2^−ΔΔCT法测定相对表达量，所有的反应都进行了三次。circRNA引物序列如表2所示。

表2. qRT-PCR实验引物设计

2.6. 统计学方法

应用SPSS26.0软件包对资料进行分析，计量资料用均数 ± 标准差表示，两组的比较采用t检验；计数资料的比较采用卡方检验。P值 < 0.05视为差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 外泌体cirRNA的差异性表达

采用高通量测序对AVMC患者和HC组各4份样本进行分析。热图(图1)和火山图(图2)显示，两组间外泌体circRNA存在表达差异。以P < 0.05和Fold Change绝对值 > 2为临界值筛选具有差异性表达的circRNA。总共筛选出1个上调和83个下调的外泌体来源的circRNA。表3显示了1个显著上调和10个最显著下调的外泌体circRNA。

图2. 外泌体circRNA火山图

表3. AVMC患者外泌体表达谱排名前十位下调和上调差异的circRNA

3.2. 功能分析

我们应用GO和KEGG富集分析来预测外泌体中差异表达的circRNA的潜在生物学功能。GO分析包括细胞成分、分子功能和生物过程三个部分。生物过程中，富集程度最高的GO分析条目是“上皮管形成”、“心室发育”和“心脏隔膜形成”。细胞成分中排名前三位的条目是“液泡膜”、“微管”和“溶酶体膜”。在分子功能方面，“ATP酶活动”、“GTP酶结合”和“微管结合”是三个富集程度最高的条目。同时，KEGG通路中“内质网蛋白质加工”、“血脂及动脉粥样硬化”和“人类免疫缺陷病毒感染”等条目富集程度最高。图3和图4显示了差异性表达的外泌体circRNA富集程度最高的GO和KEGG条目。

图3. 外泌体circRNA GO分析

图4. 外泌体circRNA KEGG分析

3.3. PCR实验

PCR结果显示，hsa_circ:97347314-97350555表达上调，hsa_circ:154033791-154034967 (hsa_circ_0001546)表达下调。两组间hsa_circ:88905209-88965915的表达水平差异无统计学意义。hsa_circ:154033791-154034967 PCR结果与测序结果一致，而hsa_circ:97347314-97350555的表达与测序结果相反。详细信息如图5所示。

图5. qRT-PCR实验(*P < 0.05, ****P < 0.0001)

4. 讨论

根据WHO对心肌病的分类，心肌炎被定义为心肌的炎症性疾病 [14] 。心肌炎最常由病毒感染引起，可表现为急性心力衰竭、扩张型心肌病、心律失常，甚至心源性休克或心源性猝死 [15] 。然而，受限于现有的诊断工具，心肌炎的诊断相对困难，迫切需要特异性和敏感性良好的无创诊断方法 [4] [5] [6] 。此外，AVMC的调控机制尚未完全阐明。本研究首次证明血浆外泌体circRNA在AVMC中的差异表达谱和潜在功能。

AVMC的诊断具有挑战性，是一种排除性诊断 [16] 。AVMC与急性冠状动脉综合征、非缺血性心肌病、瓣膜病、心包炎等有相似的临床特征。这些疾病均可引起胸痛、胸闷等不适，肌钙蛋白、肌酸激酶等心肌酶升高，ST段偏离、Q波形成等心电图改变 [2] [3] 。然而，传统的诊断工具在特异性或敏感性方面受到限制。在过去的几十年里，cMRI已经成为一种安全、无创的诊断急性心肌炎炎症、水肿和坏死的工具。然而，由于cMRI成本高、便利性差，其临床应用也受到限制 [17] [18] 。心内膜心肌活检仍然是AVMC诊断的金标准，但由于其具有侵袭性损伤，其临床应用受到极大限制 [7] 。目前迫切需要寻找一种新的AVMC诊断生物标志物。

CircRNA是通过反向剪接(back-splicing)机制产生的，即RNA的3’端和5’端直接通过共价键结合，形成环状结构 [19] [20] 。有研究发现circHIPK2通过海绵性吸附miR-485-5p调控ATG101的表达，从而诱导自噬和细胞凋亡，加速心肌损伤 [21] 。在一些病毒感染中，circRNA与免疫反应之间的关系已逐渐得到证实。Y. Grace Chen等报道了核酸传感器RIG-I对circRNA的识别激活了先天免疫反应，并证实转染外源性circRNA的细胞增强了对病毒感染的保护作用 [22] 。我们的研究表明，AVMC患者和HC对照之间外泌体circRNA的表达谱存在显著差异。我们在外泌体中发现了84个具有显著差异的circRNA，其中1个上调，83个下调。之前有研究证实的病毒感染后反式作用蛋白因子90/110 (NF90/110)的核输出导致circRNA水平降低 [23] ，我们的研究结果与之是相吻合的。这些具有差异性表达的circRNA可能是AVMC潜在的诊断生物标志物，但其诊断价值有待进一步扩大样本量进行PCR验证。

研究发现，血清中circRNA在心肌炎患者中存在差异表达 [10] 。然而，游离circRNA在循环中是不稳定的，很容易被核糖核酸酶分解。外泌体在心血管领域引起了相当大的兴趣。外泌体的内容物包括蛋白质、脂质和RNA，在心血管疾病的发生发展中起重要作用。由于外泌体脂质双分子层对酶降解的保护作用，外泌体中存在的circRNA相对稳定。此外，外泌体具有良好的生物相容性，不会被巨噬细胞吞噬。外泌体广泛存在于各种体液中，如血液、唾液、尿液和脑脊液 [8] 。与游离circRNA相比，外泌体circRNA丰富了标本采集的途径，降低了采集标本的难度，这一点有待于在其他体液中进一步验证。

接下来，我们使用GO和KEGG富集分析来预测外泌体中差异性表达的circRNA的潜在生物学功能。富集最多的条目包括ATP酶活动、GTP酶结合、溶酶体膜、微管、内质网蛋白质加工。

综上所述，我们的研究结果首次证明了血浆外泌体circRNA在AVMC患者与HC之间存在差异性表达，可能具有潜在的诊断价值。此外，这些外泌体来源的circRNA可能具有一定的生物学功能，参与了AVMC的发病机制。然而，本研究存在一定的局限性。我们初步推测了血浆外泌体circRNA的潜在生物功能，外泌体circRNA在AVMC中的准确调控机制有待进一步研究。本研究筛选出的差异性表达的外泌体circRNA有待PCR实验进行进一步验证。

5. 结论

差异性表达的hsa_circ_0001546可能是AVMC的潜在诊断标志物；差异性表达的circRNA在AVMC中具有一定生物功能，可能参与AVMC的发病机制。

致谢

感谢所有参与研究的人员提供的宝贵数据，感谢褚现明教授的严格指导。

基金项目

本项研究由国家自然科学基金面上项目(82172574)，山东自然科学基金面上项目(ZR2020MH016)及山东省高等医学教育研究中心科研规划课题(YJKT202171)支持。

文章引用

张 琦,吴钦超,翟艳艳,褚现明. 急性病毒性心肌炎血浆外泌体Circular RNA的转录及功能分析
Transcriptional and Functional Analysis of Plasma Exosomal circRNA in Acute Viral Myocarditis[J]. 临床医学进展, 2023, 13(10): 16339-16348. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.13102286

参考文献