ABSTRACT

Main Content: As the host of a number of the new infectious diseases, so called the virus database, bat contains many species and distributes widely. The bats’ excreta pollutes water and foods, which can cause disease epidemics. Since the year of 2010, several national and international teams had discovered many new viruses by using metagenomics and PCR techniques specifying corresponding gene segments. Among them, coronavirus, enterovirus, and rotavirus relate to human diseases closely. Past reports mentioned that there were several strains of coronavirus and rotavirus had been isolated from the bats’ feces until today. Purpose: This article mainly focuses on the region area distribution of the viruses in bats’ feces, so that gives people some clues to study the region area distribution of viruses.

Keywords:Bats, Virus of Feces, Virus Isolation, PCR, Enterovirus, Rotavirus, Coronavirus

蝙蝠粪便携带冠状病毒、肠道病毒、轮状病毒的研究进展

潘虹¹，冯云^2*，董兴齐³

¹大理大学，云南 大理

²云南省地方病防治所病毒立克次体病防治科，云南 大理

³云南省传染病专科医院，云南 昆明

收稿日期：2019年10月30日；录用日期：2019年11月14日；发布日期：2019年11月21日

摘 要

主要内容：蝙蝠种类多、分布广，研究发现蝙蝠是具有“飞行能力的病毒库”，是多种人兽共患病和新发传染病的储存宿主。蝙蝠粪便污染水源、食物后会传播病原体，造成疾病流行。2010年以来国内外多个团队对蝙蝠肠道粪便标本做了宏基因组学以及PCR特异性扩增，从蝙蝠肠道中检测发现多种病毒，其中冠状病毒、肠道病毒、轮状病毒与人类疾病有密切关系，既往报道提示从蝙蝠粪便标本中分离到冠状病毒和轮状病毒，而未见肠道病毒分离的相关报道。目的：本文主要对蝙蝠肠道携带的病毒的地域分布进行描述以及整理，为今后对病毒在地域分布方面的研究提供线索。

关键词 :蝙蝠，粪便，病毒，聚合酶链式反应(PCR)，肠道病毒，轮状病毒，冠状病毒

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1. 引言

蝙蝠作为唯一能飞翔的哺乳动物有925种，仅次于啮齿动物居第二，我国各个地区均有蝙蝠存在，主要栖息地分布在长江以南气候温热，物产和物种丰富的海南、云南、广西等地区 [1]。蝙蝠是群居动物，一个洞穴可达数百万只，高密度的数量使病原体在种内和种间快速传播，并且种群数量大，能够淘汰一些对病毒敏感的个体，最终存活的蝙蝠对病毒耐受并持续排毒 [2]。冬眠是许多蝙蝠的特性，冬眠期的蝙蝠体温降低，生理机能下降，免疫系统迟钝，机体不排异病毒但是却持续排出病毒。蝙蝠飞行距离长，能够根据季节变化长途迁徙，容易传播病毒到别的地方 [3]。

2010年以来石正丽 [4]、梁杰 [5]、涂长春 [6]、Eric F. Donaldson [7]、陈刚 [8] 等国内外多个团队对蝙蝠直肠和粪便标本做了宏基因组学以及PCR特异性扩增，从蝙蝠直肠和粪便中发现的多种病毒鉴定为：昆虫病毒(包括浓核病毒科 [4] [6]、二顺反子病毒科 [4] [6]、杆状病毒科 [4] [6] )、脊椎动物病毒(包括冠状病毒科 [4] [5] [6]、细小病毒科 [4] [6] [7]、逆转录病毒科 [4] [6] )、植物病毒(包括番茄丛矮病毒科 [4] )、噬菌体(肌尾噬菌体科 [4] [6]、长尾噬菌体科 [4]、短尾噬菌体科 [4]、微小噬菌体科 [4]、丝杆噬菌体科 [4] )。哺乳动物病毒有：腺病毒属 [4] [6]、疱疹病毒属 [4] [6]、异样疱疹病毒属 [4] [6]、乳头瘤状病毒属 [4] [6]、正嗜肝病毒属 [6]、A型轮状病毒属 [6]、α冠状病毒属 [6]、β冠状病毒属 [6]、肠道病毒属 [6]、丙肝病毒属 [6] 等。其中冠状病毒、肠道病毒、轮状病毒与人类疾病有密切关系，既往报道提示从蝙蝠直肠和粪便标本中分离到一些冠状病毒 [6] 和轮状病毒 [6]，而未见肠道病毒分离的报道 [9] [10]。

2. 肠道病毒

肠道病毒(Enterovirus, EV)指脊髓灰质炎病毒(Poliovirus, PV)、柯萨奇病毒(coxsackievirus, CV)和埃可病毒(entericcytopathic human orphan virus, EHCO)及新型肠道病毒感染人引起多种临床表现，包括急性呼吸道疾病、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎、心肌炎、手足口病、新生儿多器官衰竭和急性迟缓性麻痹 [11]。肠道病毒主要经粪-口途径传播，部分经呼吸道传播以及接触体液传播。EV是无包膜的核衣壳包裹单股正链RNA病毒，主要衣壳蛋白是1A、1B、1C、1D分别称为VP4、VP2、VP3、VP1。

导致手足口病的肠道病毒以及导致婴幼儿严重腹泻危及生命的轮状病毒一直被世界关注。2013~2014年上海市的污水中人类肠道病毒的调查 [12] 研究表明，污水中分离的249株人类肠道病毒(Human enterovirus, HEV)中基因型多为柯萨奇B组病毒5型(coxsackie virus group B, CVB)和埃可病毒6型(entericcytopathic human orphan virus, EHCO)，这两种血清型的HEV一直都是世界优势血清型 [12] [13]。中国的CVB5分离株主要是C5-C84个基因亚型，而此次上海污水中分离出的毒株主要是形成了C6和C8基因亚型2个传播链。全球EHCO6根据核苷酸同源性分为A、B、C、D等4个基因型，此次上海市污水中分离出的9株属于C基因型的C3、C5型，其他34株属于D9基因亚型，与国内的流行基因型相符合。然而，HEV中的CVB5、ECHO4、ECHO6、ECHO7、ECHO11、ECHO30等是引起手足口病的主要病原体 [12] [14]。2010年Zhao Lili等 [15] 在蝙蝠粪便中发现细小核糖核酸病毒(Piconavirus, PiV)片段81 bp，却未获得核苷酸全序列；2012年Ge Xingyi [4] 等从蝙蝠粪便的宏基因学研究中发现了细小核糖核酸7个contig，片段大小为266 bp，但是也未获得细小核糖核酸病毒的全序。2012年杨凡力 [6] 等在蝙蝠直肠和粪便标本宏基因组研究中未发现细小核糖核酸病毒片段。2016年郑雪燕等 [9] 在蝙蝠直肠中也未检测出细小核糖核酸病毒。迄今为止，未从蝙蝠体内未分离出细小核糖核酸病毒 [9]。但是以上的研究只能说明蝙蝠体内细小核糖核酸病毒携带率低，所以仍然需要进一步研究关于蝙蝠直肠以及粪便是否携带细小核糖核酸病毒。

3. 轮状病毒

轮状病毒(Rotavirus，RV)经消化道传播，引起轮状病毒肠炎，是一种急性消化道传染病，主要发生在6个月~2岁的婴幼儿中，同时可引起成人腹泻，发病高峰期在秋季。轮状病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridea)轮状病毒属(Rotaviru)。轮状病毒根据其内衣壳蛋白VP6抗原性不同，将轮状病毒分为7个组，其中A、B、C组主要感染人类，其他四组D、E、F、G主要感染动物。A组以婴幼儿感染居多，B组成人感染居多，C组多为散发 [16]。A组轮状病毒RV-A根据VP7、VP4表面中和抗原的不同分为15个G血清型和至少23个P血清型，其中10个G血清型中可感染人(G1-G6、G8、G9、G10、G12)。分型基于分子生物学对VP4和VP7核苷酸的差异分为19个G基因型(包括14个G血清型)和27个P基因型(包括14个P血清型，1A，1B，2到14号) [17]。

早年轮状病毒的流行以G1型为主，近年来G9型的流行也呈上升趋势 [12]。世界范围内尤其是在北美、欧洲、澳大利亚 [16] [18] [19]，90%以上的轮状病毒流行株是G1P [8]、G2P [4]、G3P [8]、G4P [8]、G9P [8]。在非洲、亚洲、南美主要流行轮状病毒血清型 [20] [21] [22] 为G5、G6、G8。最近几年世界各地陆续发现G9型流行，有可能成为世界人轮状病毒(Human Rotavirus, HRV)优势流行株，而在中国轮状病毒流行基因型主要是G8、G9型 [23] [24]。2010年Esona等在非洲肯尼亚黄毛果蝠中首次发现A组轮状病毒但未分离鉴定该病毒 [25]。涂长春课题组2012年杨凡力 [6] 等首次从云南的蝙蝠粪便中分离出轮状病毒MSLH14株，2013年何彪等在云南勐远三叶蹄蝠标本中分离出第2株轮状病毒MYAS33株。MSLH14株是一个典型的重组毒株，其关键片段VP4、VP6、VP7有可能来自东南亚地区以及其他地区，跨物种、跨地域频繁传播，但是每个片段同源性未达到95%，说明该病毒重组时间发生在很久以前，在蝙蝠中存在已久，并且是一个猫/犬RVA的远亲病毒。轮状病毒毒株MYAS33 [26]，VP4和VP7基因与MSLH14不同，是一株新病毒，是首次发现的动物源性G3P [10] 型轮状病毒，与之前的MSLH14同源性达到89.6%，经过比对发现MYAS33与泰国清迈的一个严重腹泻的6岁儿童粪便中分离到的CMH079都是G3P [10] 型 [18]，认为MYAS33和CMH079存在遗传相关性。蝙蝠体内发现的3株轮状病毒，2株来自云南。董慧瑾等从广西农村一名腹泻儿童粪便中检测到一株少见的人感染M2-102毒株G3P [3] 型轮状病毒 [27]，进一步分析5条基因带(VP1、VP2、VP7、NSP4、NSP3)后发现与云南的蝙蝠RV毒株MYAS33亲缘关系近，处于同一进化支，VP6与人AU-1病毒株在同一进化支，进而推测出M2-102毒株是人病毒株AU-1与蝙蝠毒株MYAS33和猿猴株类似病毒经基因重配产生的的多种属来源的重配病毒株。2013年郑雪燕 [28] 等在勐远县山区捕捉30只三叶蹄蝠直肠标本中26只蝙蝠检测出感染A组轮状病毒序列，在分别提取30只蝙蝠肠道总RNA后扩增(Nonstructural Protein 5, NSP5)基因，结果在1只三叶蹄蝠肠道样品中扩增出NSP5基因全序列。2016年郑雪燕等 [9] 在海南海口、广东惠州、云付及广州蝙蝠长期监测点选取的9个蝙蝠自然栖息地采样520只蝙蝠，从6只小黄蝠直肠中检测出4株A组RV初步定为G3型，轮状病毒检出率为0.76%。轮状病毒在传播过程中经常发生基因重组，这些变异很有可能导致跨种传播，所以蝙蝠携带轮状病毒需要进一步研究。

4. 冠状病毒

冠状病毒(Coronavirus, CoV)主要引起呼吸道、肠道、肝脏和中枢系统疾病，是一类有囊膜的单股正链RNA病毒(25-31kb)，属于冠状病毒科(Coronaviridea)冠状病毒属，该病毒可以直接用其基因组RNA作为翻译蛋白质的模板，RNA有很高的重组率，RNA重组后序列变化导致翻译的氨基酸变化，抗原性也发生改变，所以冠状病毒容易发生变异 [29]。现在发现15个种只感染脊椎动物 [30]，和人与动物的很多疾病有关。冠状病毒基因组基本模式是包含至少6个开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)，5’和3’非编码区(Untranslated Region, UTR)位于两侧。冠状病毒根据抗原性不同分为α、β、γ、δ四个属，每个属根据pplab复制酶结构域不同分为不同物种。不同群的冠状病毒基因组结构各有特点，α冠状病毒结构相似，转录调控序列(Transcriptionregulatingsequence，TRS)均为CUAAAC，ORF1ah编码16个非结构蛋白(Nonstructural protein, NSP)，有2个木瓜蛋白酶位点，其中αCoV-A群在3’端有非结构蛋白NSP7，αCoV-B群不具备NSP7 [31]。

人类冠状病毒(Human Coronavirus, HCoV)HCoV-229E株和HCoV-OC43株是最早发现的和人类疾病有关的病毒，主要引起人普通感冒，4个病毒株HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU16引起的感染症状较轻 [32]，然后又发现严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus, SARS-CoV)与中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)会导致高致死性急性呼吸道综合征。2011年Christina Osborne等报道从2006年到2009年在美国科罗拉多州的21个采样点采集2属17种1044只蝙蝠，75只蝙蝠粪便样本中检测到α冠状病毒，各种蝙蝠的带毒率分别为大棕蝠12% (61/494)，长脚蝠8% (12/147)，小棕蝠3% (1/31)，西部长耳蝠2% (1/52)，该研究证明，α冠状病毒可以感染不同种蝙蝠，表现出进化的多样性 [33]。2007年Vijaykrishna等根据全基因组序列系统发育分析研究发现冠状病毒存在蝙蝠体内的时间比其它任何一种动物时间更久，蝙蝠可能是所有冠状病毒的自然宿主，不同种类的冠状病毒在不同蝙蝠种类中传播，从而感染给其他动物 [34]。β冠状病毒A群有2个木瓜蛋白酶水解位点，都有特定基因：血凝素酯酶(Hemagglutinin-esterase，HE)和非结构蛋白3 (Nonstructural Protein, NSP3) (其中病毒株HCoV-HKU1只有HE)。β冠状病毒的B群只有一个木瓜蛋白酶水解位点，在M和N基因之间含有几个小的开放阅读框，只有果蝠属冠状病毒Ro-BatCoV-HKU4株有2个下游基因非结构蛋白7a/7b [35]。β冠状病毒A群属的转录调控序列(transcription regulating sequences, TSR)是CUAAAC，而β冠状病毒属的TSR是ACGAAC，二者不同。2012年荷兰分离出感染人的冠状病毒毒株HCoV-EMC/2012与2株蝙蝠冠状病毒Ty-BatCoV-HKU4株和Ro-BatCoV-HKU4株，属于β冠状病毒C群 [29]。γ和δ冠状病毒与其他动物有关。2013年石正丽等在Nature发表文章，该研究成功分离鉴定到使用血管紧张素转换酶II (ACE2)作为受体的中华菊头蝠的蝙蝠源SARS样冠状病毒(bat SL-CoV-W1V1)，该实验表明菊头蝠是SARS-CoV自然宿主并且SARS-CoV直接感染人，其间并无中间宿主 [35] [36] [37] [38]。杨凡力 [10] 等在蝙蝠粪便病毒中扩增出冠状病毒(LYRa11株)，该病毒与SARS-like CoV Rs3367株在S基因中的受体结合基序(Recombination Binding motif, RBM)区域与SARS CoV具有几乎一致的相似性，在关键氨基酸位点479N和487T只观察到一个突变。最终推测出LYRa11株与Rs3367株有能力感染果子狸和人类，是由蝙蝠携带的SARS-like CoV过渡到能够感染人和果子狸的SARS CoV的中间病毒。2012年中东地区出现由MERS-CoV (HCoV-EMC)引起的中东呼吸综合征并且推测其来源于蝙蝠，HCoV-EMC株与蝙蝠来源的病毒株BtCoV-HKU4和BtCoV-HKU5遗传关系较近 [39]。

5. 蝙蝠粪便标本携带病毒的地域分布

从表1中可以看到，见表1，涂长春课题组2012年杨凡力 [6] 等首次蝙蝠直肠以及粪便中云南的蝙蝠粪便中分离出轮状病毒MSLH14株，2013年何彪等 [28] 在云南勐远三叶蹄蝠标本中分离出第2株轮状病毒MYAS33株。梁捷等 [5] 2014到2015年间在澳门地区采集蝙蝠的粪便、肛拭子、尿液样本，检测出α冠状病毒、β冠状病毒、副粘病毒、腺病毒、α冠状病毒、β冠状病毒、副粘病毒、腺病毒；其中蝙蝠优势种类和主要携带病毒蝙蝠是大蹄蝠(41.93%，421/1004)，4份检测出腺病毒阳性，菲菊头蝠(36.35%，356/1004) 2份检测出冠状病毒，1份检测出副粘病毒。该地检出率最高的病毒是腺病毒、冠状病毒、副粘病毒科。郑雪燕等 [9] 从海南海口、关东惠州、广州、云浮采集蝙蝠的粪便、肛拭子或直肠标本检测出疱疹病毒、腺病毒、乳头瘤状病毒、轮状病毒。此次蝙蝠优势种类是小黄蝠(34.04%，177/520)，普通长翼蝠(27.69%，144/520)，带毒蝙蝠以小黄蝠为主(阳性率2.90%，37/177)。当地检出率最高的病毒是疱疹病毒，腺病毒，乳头瘤状病毒。李兴宇等 [10] 2013年至2014年在辽宁、吉林、黑龙江省的16个市采集的蝙蝠，检测出布尼亚病毒、圆环病毒、副粘病毒科、α冠状病毒、β冠状病毒、星状病毒、水泡性病毒、环状病毒、细小病毒、蝙蝠心病毒。此次蝙蝠的优势种类是大足鼠耳蝠(31.86%，65/204)、东方蝙蝠(25.49%，52/204)，带毒蝙蝠以马铁菊头蝠(15.20%，31/204)为主。当地检出率最高的病毒是博卡病毒、蝙蝠心病毒、布尼亚病毒。陈清等 [10] 2007年至2008年在岳阳、邵阳、海口三地采集蝙蝠的直肠或粪便标本，检测出诺如病毒。此次蝙蝠优势种类为普通长翼蝠(58.26%，187/321)，带毒蝙蝠以普通长翼蝠为主(23.53%，44/187)，当地常见病毒是星状病毒(9.03%，29/321)。

表1. 中国蝙蝠粪便标本携带病毒的地域分布

在之前所有关于蝙蝠直肠及粪便组织中并未发现有细小病毒属的基因组，只是葛兴义等在宏基因组分析过程中发现过100contig的细小病毒基因片段，一直到2016年涂长春、李兴宇等在我国东三省蝙蝠中检测到细小病毒。轮状病毒毒株MYAS33在云南的边境镇中发现。在澳门地区发现了α冠状病毒和β冠状病毒。了解病毒的地域性分布对今后的病毒溯源有重要意义。

6. 展望

蝙蝠作为“会飞行的病毒库”，人类正从蝙蝠身上不断发现新病毒。消化道作为机体与外界潜在相通的腔道，在蝙蝠排便时有成千上万的病毒可能正在排到环境中，对蝙蝠粪便携带病毒的调查，既是一个认识蝙蝠与人类疾病关系的新视角，也是对长时间以来大量证据证明“蝙蝠携带病毒且与人类疾病密切相关”这一古老的主题添上了一笔。认识蝙蝠与人类疾病的关系，有助于人类今后防控疾病，也有助于促进人与自然和谐相处。

基金项目

国家自然科学基金(31560049)。

文章引用

潘 虹,冯 云,董兴齐. 蝙蝠粪便携带冠状病毒、肠道病毒、轮状病毒的研究进展
The Review of Coronavirus, Enterovirus, and Rotavirus Detected in Bats’ Feces[J]. 自然科学, 2019, 07(06): 596-603. https://doi.org/10.12677/OJNS.2019.76070

参考文献