新疆维吾尔自治区人民医院脊柱二科，新疆 乌鲁木齐

收稿日期：2023年9月19日；录用日期：2023年10月12日；发布日期：2023年10月19日

摘要

目的：探讨Rho-Rock信号通路阻断剂Fasdiual对脊髓损伤(SCI)大鼠神经功能修复的作用。方法：选取8周龄SD (Sprague-Dawley)雄性大鼠36只，采用改良Allen打击法制备脊髓损伤(SCI)大鼠模型后根据实验干预措施随机分组，A组为BMSCs移植组、B组为BMSCs移植 + Fasdiual组、C组为BMSCs移植 + 生长因子组。于SCI术后4周采用BBB (Basso-Beattie-Bresnahan)评分法对SCI大鼠下肢运动功能恢复评分后取脊髓损伤节段制备标本，采用免疫组织化学染色观察对比两组神经干样细胞特性表达蛋白NF200、NSE及胶质细胞GFAP的阳性表达。结果：SCI术后4周各组大鼠下肢运动功能评分均有明显改善，B、C两组SCI大鼠下肢运动功能评分均优于A组，差异有统计学意义(P < 0.05)，B组评分优于A组，两组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)；SCI大鼠脊髓标本免疫组化结果显示NF200、NSE在B、C组表达量均高于A组，差异有统计学意义(P < 0.05)，GFAP在A组的表达量高于B、C组，差异均有统计学意义(P < 0.05)。结论：Rho-Rock抑制剂Fasdiual联合骨髓间充质干细胞定向移植后可促进损伤脊髓的修复，促进SCI大鼠神经功能的恢复。

关键词

脊髓损伤，信号通路，骨髓间充质干细胞，细胞分化

Effect of Rho-Rock Signaling Pathway Blocker on Neurological Recovery in Rats with Spinal Cord Injury

Shuwen Zhang, Hao Wang^*

Second Department of Spine, People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi Xinjiang

Received: Sep. 19^th, 2023; accepted: Oct. 12^th, 2023; published: Oct. 19^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To investigate the effect of the blocker of Rho-Rock signaling pathway (Fasdiual) on neurological function in rats with spinal cord injury (SCI). Methods: Thirty-six Sprague-Dawley (SD) male rats aged 8 weeks were selected and prepared by a modified Allen method for spinal cord injury (SCI) and randomly divided into groups according to experimental interventions. Group A is BMSCs transplantation group, and group B is BMSCs transplantation with Fasdiual group, C group is BMSCs transplantation with growth factor group. After 4 weeks of SCI, BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) scoring method was used to evaluate the recovery of lower extremity motor function of SCI rats. Immunohistochemical staining was used to observe the positive expression of protein NF200, NSE of neural stem cells and GFAP of glial. Results: The motor function scores of lower extremities were significantly improved in all groups after 4 weeks of SCI. The scores of lower extremity motor function of SCI rats in both groups were significantly better than those in group A (P < 0.05). The score of group B was better than that of the group A, there was a statistically significant difference between the two groups (P < 0.05). The immunohistochemistry results of the spinal cord specimens of SCI rats showed that the expression levels of NF200 and NSE in group B and C were higher than those in group A, statistical significance (P < 0.05). The expression of GFAP in group A was higher than that in group B and C. The difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion: Rho-Rock blocker Fasdiual combined with bone marrow mesenchymal stem cells can promote the repair of injured spinal cord and promote the recovery of neurological function in SCI rats.

Keywords:Spinal Cord Injury, Signal Pathway, Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation

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1. 引言

脊髓损伤是严重的神经系统创伤，治疗困难、致残率高，一直是世界性难题，而且交通伤、坠落伤、高能量损伤造成脊髓损伤的病例逐年增加 [1] ，干细胞移植可促进损伤脊髓内轴突的再生，改善神经功能障碍，具有广阔的应用前景 [2] [3] 。骨髓间质干细胞(BMSCs)移植治疗脊髓损伤大鼠的实验研究发现移植组取得良好的疗效，相关文献分析认为神经干样细胞移植与BMSCs相比能获得更好的疗效，因此体外诱导后移植更适用于脊髓损伤患者 [3] [4] [5] 。相关文献认为其中Ras同源基因-Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-Rock)信号通路是中枢神经系统中普遍存在的一条通路，是介导抑制性信号阻断中枢神经细胞再生的最终途径 [6] 。彭涛等 [7] 研究结果首次证实了Rock抑制剂盐酸法舒地尔可以在体外快速、高效诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化，同时能够提高诱导后的成活率。因此本研究通过对抑制Rho-Rock信号通路及生长因子应用联合BMSCs定向移植，探讨其对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的作用。

2. 对象与方法

2.1. 材料验动物

成年SD雄性大鼠，体质量150~200 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。主要试剂：胎牛血清、低糖DMEM培养基、PBS缓冲液、双抗、0.5%胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；NSE抗体、GFAP抗体及四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗兔IgG抗体、二脒基苯基吲哚(DAPI)复染液购自武汉博士德公司，NF200抗体购自北京博奥森公司。本研究新疆维吾尔自治区人民医院动物伦理委员会批准(编号：IACUC20161208-05)。

2.2. BMSCs的分离、提取及培养

无菌条件下取3周龄重约100 g雄性SD大鼠双侧股骨及胫骨置于5%双抗的DMEM中，反复冲洗骨髓腔，吹打成单细胞悬液，清洗、离心细胞2次。含体积分数12%胎牛血清的DMEM制作单细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，24 h半量换液，以后每3 d换液，当细胞生长至80%~90%时进行1:3传代，第3代细胞已经去除非贴壁的骨髓造血干细胞，得到纯化的BMSCs，移植备用。

2.3. BMSCs移植及组织免疫组化观察

采用改良Allen打击法制作SCI大鼠模型后局部移植第3代BMSCs，A组在模型制作成功后连续5 d腹腔注射1 ml生理盐水，B组在模型制作成功后连续5 d注射Fasdiual (0.85 mg/kg)，C组在模型制作成功后连续额5 d腹腔注射促神经营养因子(成纤维细胞生长因子 + 表皮生长因子)。术后4周在行SCI大鼠后肢BBB运动功能评分后处死取脊髓标本固定、脱水、包埋、制片后备用。烤片、脱蜡、脱水、孵育、抗原修复、山羊血清封闭、滴加一抗4℃过夜、二抗孵育、DAB显色、苏木素染色反蓝、脱水，透明、封片后显微镜下拍照并观察NF200、NSE及GFAP的阳性表达。

2.4. 统计分析

应用SPSS 17.0统计软件分析，服从正态分布的计量资料以均数 ± 标准差( $\text{<mover accent="true"> x <mo> ¯ </mo> </mover>}\pm \text{s}$ )表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

BBB评分结果为各组SCI大鼠术后1 d BBB评分分别为(0.58 ± 0.55)、(0.61 ± 0.44)、(0.60 ± 0.36)分，各组之间差异无统计学意义(P > 0.05)，术后4 w各组SCI大鼠运动功能均有明显改善，各组治疗前后差异均有统计学意义(P < 0.05)；B、C两组SCI大鼠运动功能评分分别为(11.23 ± 0.76)、(9.84 ± 1.12)分，两组相比差异有统计学意义(P < 0.05)，分别与A组(6.81 ± 1.31)分比较，差异均有统计学意义(P < 0.05)，结果见表1。

表1. SCI大鼠术后1 d、4 w点BBB评分

注：与A组同时间点比较，^aP < 0.05；与B同时间点比较，^bP < 0.05；与C组同时间点比较，^cP < 0.05。

SCI大鼠脊髓标本免疫组化染色结果显示NF200、NSE、GFAP在各组均有阳性表达，半定量分析结果显示NF200、NSE在B、C组阳性表达明显高于A组，组件比较差异均有统计学意义(P < 0.05)，B、C两组之间比较NF200、NSE阳性表达差异无统计学意义(P > 0.05)；GFAP在A组阳性表达高于B、C两组，组件比较差异均有统计学意义(P < 0.05)，B、C两组比较差异无统计学意义(P > 0.05)，见图1。半定量分析见表2。

图1. NF200、NSE、GFAP免疫组化结果

表2. NF200、NSE、GFAP半定量分析

注：与A组相比^aP < 0.05，与B组相比^bP < 0.05，与C组相比^cP < 0.05。

4. 讨论

骨髓间充质干细胞作为“种子细胞”具有取材方便，易于体外培养增殖，不引起免疫排斥反应等优点，并且具有定向分化为神经干样细胞的潜能 [8] 。骨髓间充质干细胞诱导为神经干样细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究表明神经干样细胞移植组疗效优于骨髓间充质干细胞移植组，因此通常选择骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经干样细胞后再移植治疗脊髓损伤 [9] 。诱导骨髓间充质干细胞向神经干样细胞分化的方法较多，主要包括抗氧化剂等化学诱导法，生长因子和改变骨髓间充质干细胞所处微环境共培养法和分步诱导、慢病毒转染的方法，尽管存在多种不同诱导方法，但普遍存在着定向分化效率低、分化稳定性参差不齐的缺点 [10] 。骨髓间充质干细胞的定向诱导分化受多种信号通路的调节，相关研究表明主要包括Notch信号通路、BMP信号通路、Wnt信号通路、Ca²⁺/CaM信号通路等 [11] [12] [13] 。脊髓损伤可引起多条信号通路的激活，各通路之间存在一定联系，相关文献认为其中Rho-Rock信号通路是中枢神经系统中普遍存在的一条通路，是介导抑制性信号阻断中枢神经细胞再生的最终途径，抑制Rho-Rock信号通路可以促进SCI大鼠神经功能的恢复 [6] 。

本研究BBB评分结果表明三组SCI大鼠双后肢运动功能均有改善，B、C两组BBB评分高于A组，结果表明BMSCs移植可改善SCI大鼠双下肢功能，给予Rho-Rock抑制剂及生长因子能够促进SCI大鼠双下肢功能的恢复，且B组SCI大鼠术后4周BBB评分高于C组，表明阻断Rho-Rock信号通路对SCI大鼠双后肢功能恢复的效果优于生长因子的应用。SCI大鼠脊髓标本的免疫组化结果显示三组BMSCs诱导后均表达NF200、NSE，且B、C组表达量高于A组，GFAP表达量B、C组低于A组，结果表明Fasdiual在动物体内实验具有促进神经干样细胞表达的作用。BMSCs移植到动物体内具有分泌神经营养因子、抑制炎症、促进轴突再生及神经通路重建等作用 [14] ，可以促进SCI大鼠脊髓功能的恢复。Fasdiual与BMSCs联合应用能提高BMSCs向神经干样细胞分化的作用，同时可减少星形胶质细胞的特异性标记物GFAP的表达，GFAP在缺氧缺血后的反应性胶质细胞中明显表达，反映中枢受损后的严重程度，同时反映受损区域无菌性炎性改变。

Rho-Rock信号通路包括三种成分：Rho蛋白、Rho激酶及Rho激酶的效应分子，主要参与了调控细胞骨架形成、增殖、迁移及基因转录和凋亡等功能，主要通过小G蛋白GDP-GTP之间的转换，来调节细胞内肌动蛋白的合成、降解、移动和收缩等，因此对细胞的分裂、黏附、收缩、迁移和分泌活动具有非常重要的调节作用，并且相关文献指出Rho及其相关分子在神经系统的发育过程轴突生长、分化、延伸及突触的形成过程中均能起到重要作用，Rho蛋白及其相关的信号分子能介导硫酸软骨素蛋白多糖对神经元的抑制作用，因此抑制Rho蛋白及其下游因子可以促进脊髓损伤后神经功能的恢复 [15] 。相关研究通过体外诱导方式证实Rock抑制剂盐酸法舒地尔具有快速、高效诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化的作用，并且能够提高诱导后的成活率 [7] ，本研究通过两种不同治疗方式均能有效改善SCI大鼠神经功能，且Fasdiual应用疗效优于生长因子，笔者推测其主要原因可能与抑制Rho-Rock信号通路后可减少受损脊髓局部神经细胞的凋亡及促进了抑制细胞的诱导分化有关，还需进一步研究证实。

总而言之，本研究证实应用Rho-Rock信号通路阻断Fasdiual后可促进SCI大鼠神经功能的恢复，为后续研究奠定了一定的基础，但本文献存在一定的局限性，样本量较小，尽管脊髓打击模型简单易操作，但打击操作过程中仍然存在一定的差异性，今后需进一步完善不足之处。

文章引用

张树文,王 浩. Rho-Rock信号通路阻断剂对脊髓损伤大鼠神经功能修复的作用
Effect of Rho-Rock Signaling Pathway Block-er on Neurological Recovery in Rats with Spinal Cord Injury[J]. 临床医学进展, 2023, 13(10): 16525-16530. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.13102312

参考文献