Open Journal of Fisheries Research
Vol.03 No.04(2016), Article ID:19201,5 pages
10.12677/OJFR.2016.34009

Detention Time of White Spot Syndrome Virus in the Body of Aedes albopictus Larva by Using Nest PCR Detection

Ziyan Wang, Xiongchao Ma, Fei Zhu

College of Animal Science and Technology, Zhejiang A & F University, Lin’an, Zhejiang

Received: Nov. 21st, 2016; accepted: Dec. 10th, 2016; published: Dec. 13th, 2016

Copyright © 2016 by authors and Hans Publishers Inc.

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ABSTRACT

White spot syndrome virus (WSSV), which causes high mortality in many economic shrimp aquaculture, and is widespread over the world, makes the large economic losses to the shrimp industry in China. In recent years, Procambarus clarkii farming is also threatened by WSSV. Gradually, there are many reports about the massive dead of P. clarkii because of the infection of WSSV. P. clarkii in aquiculture area around Hangzhou was found to carry WSSV through field sampling. Therefore, the route of transmission of WSSV in freshwater ecosystems is worth studying deeply. Aedes albopictus not only has very strong aggressivity, but also is an epidemiologically important vector for the transmission of many viral pathogens, including the dengue fever, Ross River virus and West Nile virus. Although A. albopictus is an important part of the fresh water ecological system, the research of A. albopictus larvae with white spot syndrome virus has not been reported. This test detects that the detention time of white spot syndrome virus in the body of A. albopictus larva is 48 h by using Nest PCR detection. This study provides new evidence for the transmission of WSSV in fresh water and provides a new scientific basis for the prevention Procambarus clarkii from white spot syndrome.

Keywords:Nest PCR, White Spot Syndrome Virus (WSSV), Aedes albopictus

巢式PCR检测白斑综合征病毒在白纹伊蚊幼虫体内的滞留时间

王紫燕,马雄超,朱斐

浙江农林大学,动物科技学院,浙江 临安

收稿日期:2016年11月21日;录用日期:2016年12月10日;发布日期:2016年12月13日

摘 要

白斑综合征病毒(WSSV)是对全球虾类养殖业危害最大,传播最广的病毒之一,至今已经造成了数十亿美元的损失。克氏原螯虾的养殖也受到WSSV的威胁,陆续有养殖的克氏原螯虾因感染WSSV而大量死亡的报道[1]。通过野外采样在杭州周边的养殖区均有发现克氏原螯虾携带有WSSV,因此对WSSV在淡水生态系统中的传播途径值得深入研究。白纹伊蚊既是一种攻击性很强的蚊子,也是一种重要的病毒媒介,它可以传播很多病原体,包括登革热、罗斯河病毒和西尼罗病毒。白纹伊蚊作为淡水水体生态系统中的重要一环,其幼虫携带白斑综合征病毒的研究仍未见报道。本试验通过巢式PCR技术检测出白斑综合征病毒在白纹伊蚊幼虫体内的滞留时间在48 h左右。本研究为WSSV在野外淡水水体中的传播媒介研究提供了新的证据,为防治克氏原螯虾感染白斑综合征提供了新的科学依据。

关键词 :巢式PCR,白斑综合征病毒,白纹伊蚊

1. 引言

巢式PCR (Nested-PCR)是一种变异的聚合酶链反应(PCR),使用两对PCR引物来扩增目的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似,第二对引物称为巢式引物在第一次PCR扩增片段的内部进行第二次PCR扩增,其产物片段短于第一次扩增的产物片段。巢式PCR的优点在于其扩增的特异性非常高。

白斑综合征病毒(WSSV)是对全球虾类养殖业危害最大,传播最广的病毒之一,至今已经造成了数十亿美元的损失。WSSV是Nimaviridae科的Whispovirus属的代表种 [1] ,具有囊膜,核衣壳呈杆状,电镜下其大小约为(70~150) nm × (250~380) nm,无包涵体,有尾状结构 [2] 。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾,属甲壳纲、十足目、螯虾亚目、刺蛄科、原螯虾属,是有一定经济价值的水产养殖品种,但是近年来克氏原螯虾的养殖也受到WSSV的威胁,陆续有养殖的克氏原螯虾因感染WSSV而大量死亡的报道 [3] [4] [5] 。通过野外采样在杭州周边的养殖区有均发现克氏原螯虾携带有WSSV,因此对WSSV在淡水生态系统中的传播途径值得深入研究。白纹伊蚊(Aedes albopictus)也被称为亚洲虎蚊,属于长角亚目蚊科,中等大小的黑色蚊虫,上面并具由白色鳞片形成的斑纹,白纹伊蚊源于东南亚,是东南亚和中国的常见蚊种 [6] 。白纹伊蚊既是一种攻击性很强的蚊子,也是一种重要的病原媒介,它可以传播很多病原体 [7] ,包括登革热、罗斯河病毒和西尼罗病毒 [8] [9] 。白纹伊蚊作为淡水水体生态系统中的重要一环,其幼虫携带白斑综合征病毒的研究仍未见报道。

2. 材料和方法

2.1. 材料

WSSV毒种分离自野外采集发病的克氏原螯虾(Procambarus clarkii),−80℃保存。聚合酶链式反应(PCR)扩增用Ex Taq酶,dNTP等购自宝生物公司。病毒DNA提取试剂盒购自上海生工公司。100 bp DNA Ladder Marker购自Fermentas公司。白纹伊蚊(Aedes albopictus)雌性成虫取自野外,于实验室内繁殖出幼虫后立即取用。

2.2. 方法

2.2.1. 白斑综合征病毒滞留试验

从野外捞取健康活泼的白纹伊蚊幼虫,经巢式PCR抽样检测肌肉组织样本全部为WSSV阴性,用作WSSV滞留试验。WSSV感染鳌虾的方法根据文献报道进行 [10] ,取10 g感染WSSV致死的克氏原螯虾肌肉剪碎匀浆,加入100 ml纯净水中,将白纹伊蚊幼虫放入,于3小时后捞出放入洁净的纯净水中,分别在换水后24、48和72小时取幼虫样品作巢式PCR检测。

2.2.2. WSSV的PCR检测

病毒DNA提取根据试剂盒的操作步骤来进行,提取出的DNA样品利用引物VP28a (Forward: 5’-AACCTCCGCATTCCTGTG-3’, Reverse: 5’-GTGCCAACTTCATCCTCATC-3’)和VP28b (Forward: 5’-cgcacagAcaata -3’ , Reverse: 5’-GTCTCAGTGCCAGAGTAGGT-3’)进行PCR反应扩增囊膜蛋白VP28基因片段。PCR反应体系:DNA模板(WSSV DNA) 1 μL;10 × PCR扩增缓冲液5 μL;MgCl2 (25 mM) 3 μL;dNTPs 1 μL;上游引物(20 mM) 1 μL;下游引物(20 mM) 1 μL;Taq酶1 μL。加超纯水至总体积为50 μL(以上都在冰上操作),置于PCR仪内进行扩增。PCR程序为:94℃ 2 min;94℃ 1 min,59℃ 1 min,72℃ 1 min,运行30个循环;72℃ 10 min;10℃ 5 min。PCR产物加入琼脂糖凝胶中进行电泳,电泳结束后用Immage master VDS成像系统检测目的条带。

3. 结果与分析

3.1. WSSV的PCR检测结果

利用引物VP28a,VP28b,VP28a和VP28b组合分别进行PCR反应扩增囊膜蛋白VP28基因片段,PCR扩增结果显示,引物VP28a,VP28b,VP28a和VP28b组合在1倍稀释的病毒DNA样品均可扩增出清晰的条带,但是VP28a和VP28b组合能在病毒DNA样品稀释12倍后扩增出特异性条带,而VP28a在病毒DNA样品稀释4倍后扩增不出特异性条带,VP28b在病毒DNA样品稀释2倍后扩增不出特异性条带(图1)。

3.2. 白斑综合征病毒滞留试验结果

取接种WSSV后24、48和72小时的白纹伊蚊幼虫样品做巢式PCR检测,PCR扩增结果显示,在接种WSSV后24 h,48 h和72 h白纹伊蚊幼虫体内都能检测到WSSV,其中以48 h的特异性条带最多,而72 h后仅能扩增出一条特异性条带(图2)。结果说明,WSSV在白纹伊蚊幼虫体内的滞留时间最多能维持到72 h。

4. 讨论

将病毒DNA样品进行1~12倍的逐步稀释后,分别用普通PCR和巢式PCR进行检测,分别使用VP28a单引物、VP28b单引物和VP28a与VP28b结合的巢式PCR引物。PCR检测结果表明,相比于普通的PCR,巢氏PCR的灵敏度较普通PCR高很多,扩增效率更高(图1)。

白斑综合征病毒滞留试验结果表明,白斑综合征病毒在白纹伊蚊幼虫体内的滞留时间集中在48 h左右(图2),在24 h的时候WSSV在白纹伊蚊幼虫体内的量较大,条带较亮,与阳性对照的亮度一样,在48 h的时候WSSV在大部分幼虫体内都有残留,但条带的亮度较浅。在72 h的时候WSSV虽然在幼虫

Figure 1. PCR amplification of VP28; marker indicates 100 - 1000 bp, 1 - 12 represented that the virus DNA samples were diluted 1 - 12 times respectively

图1. VP28的PCR检测结果;marker为100~1000 bp,1~12号分别代表病毒DNA样品进行1~12倍的稀释

Figure 2. PCR amplification of detention time of white spot syndrome virus in the body of Aedes albopictus larva; marker indicates 100 - 1000 bp; 1 - 6 stand for 6 different Aedes albopictus larvae samples respectively

图2. WSSV在白纹伊蚊幼虫体内滞留时间的PCR检测结果放大;marker为100~1000 bp,1~6代表6个不同的白纹伊蚊幼虫样本

体内也有存在,但是检测到的个体较少。由于克氏原螯虾是杂食动物,又有同类相残和食腐的习性,因此白纹伊蚊幼虫在水中可能成为传播WSSV的媒介,进而造成克氏原螯虾的大量死亡。本研究为WSSV在野外淡水水体中的传播媒介研究提供了新的证据,为防治克氏原螯虾感染白斑综合征提供了新的科学依据。

文章引用

王紫燕,马雄超,朱 斐. 巢式PCR检测白斑综合征病毒在白纹伊蚊幼虫体内的滞留时间
Detention Time of White Spot Syndrome Virus in the Body of Aedes albopictus Larva by Using Nest PCR Detection[J]. 水产研究, 2016, 03(04): 54-58. http://dx.doi.org/10.12677/OJFR.2016.34009

参考文献 (References)

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  2. 2. Escobedo-Bonilla, C.M., Alday Sanz, V., Wille, M., et al. (2008) A Review on the Morphology, Molecular Characterization, Morphogenesis and Pathogenesis of White spot Syndrome Virus. Journal of Fish Diseases, 31, 1-18. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2007.00877.x

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