Hans Journal of Biomedicine
Vol.07 No.04(2017), Article ID:22369,6 pages
10.12677/HJBM.2017.74013

The Inhibition Effects of Oridonin on Bcap-37 Cells

Yang Yu1, Yanlong Liu2, Xiaofang Wang2, Guo Qian3, Wei You1

1Department of Breast Surgery, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou Henan

2Wenzhou Medical University, Wenzhou Zhejiang

3Ningbo Fourth Hospital, Ningbo Zhejiang

Received: Sep. 29th, 2017; accepted: Oct. 13th, 2017; published: Oct. 19th, 2017

ABSTRACT

To investigate the effects of oridonin on Bcap-37 cells, MTT was used to measure the inhibition effects of oridonin on Bcap-37 cells and RT-PCR was used to measure the Bcl-2 and Bax mRNA expression. Our results showed the inhibition effects of oridonin on Bcap-37 cells by time- and dose-dependent manner. Bcl-2 mRNA expression decreased and Bax mRNA expression increased by oridonin treatment for 24 hours (p < 0.05).

Keywords:Oridonin, Bcap-37 Cells

冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用

于洋1,刘彦隆2,王小芳2,钱国3,尤伟1

1河南省人民医院乳腺外科,河南 郑州

2温州医科大学,浙江 温州

3宁波市第四医院,浙江 宁波

收稿日期:2017年9月29日;录用日期:2017年10月13日;发布日期:2017年10月19日

摘 要

研究冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用。MTT法检测冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用,RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达。研究结果表明冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用Bcap-37细胞24 h,Bcl-2的mRNA表达显著降低,Bax的mRNA表达显著增加(p < 0.05)。

关键词 :冬凌草甲素,Bcap-37细胞

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1. 引言

冬凌草甲素(oridonin, ORI)是从冬凌草中提取的一类四环二萜类化合物,具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性 [1] 。近年来人们对其研究的重点集中在其抗肿瘤活性上,发现其对多种实体瘤如肝癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌等有效果。目前,冬凌草甲素在抗乳腺癌方面的作用尤为显著。冬凌草甲素可以诱导人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞发生凋亡 [2] [3] 。本文将探讨冬凌草甲素作为一种潜在的抗乳腺癌制剂,对乳腺癌细胞Bcap37的作用。

2. 材料与方法

2.1. 细胞与试剂

乳腺癌细胞株Bcap-37购自中科院上海细胞生物学研究所。冬凌草甲素购自成都普思生物科技有限公司。RPMI1640购于Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。

2.2. 方法

2.2.1. 细胞培养

细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液, 37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。

2.2.2. MTT 法检测细胞增殖活力

将生长状态良好的Bcap-37细胞以1.0 × 104个/孔的密度传代培养于96孔板中,待细胞贴壁后,每板按照分组加入含不同浓度冬凌草甲素的完全培养液,使其终浓度为0、10、20、40 μM,每组5个复孔,并设置调零孔,继续分别培养12、24和48小时。并于培养后12、24、48 h时,取出培养板,每孔加入20 μL浓度为5 mg∙mL−1的MTT溶液,培养箱中继续孵育4 h,弃去培养液,每孔加入100 μl DMSO,震荡溶解沉积在孔底的蓝紫色结晶,并在10 min内于570 nm波长处检测各孔吸光度值(A570),并计算细胞活力:细胞活力(%) = (加药组A570 − 空白组A570)/(对照组A570 − 空白组A570) × 100%。实验独立重复3次。

2.2.3. 实时PCR 检测Bcl-2和Bax的mRNA水平

用Trizol法提取总RNA,A260/A280比值为1.8~2.0,经逆转录反应合成cDNA。然后利用SYBR荧光实时PCR法检测Bcl-2和Bax mRNA相对表达量。实验所用引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以β-actin为内参照基因,β-actin引物序列:上游,5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3';下游,5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'。Bcl-2引物序列:上游, 5'-ATCGCCCTGTGGATGACTGAG-3';下游,5'-CAGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG -3'。Bax引物序列:上游,5'-GGACGAACTGGACAGTAACATGG-3';下游,5'-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACAAC-3'。反应体系为10 μl,包含Power SYBR Green PCR Master Mix 5 μl,上游引物0.2 μl,下游引物0.2 μl,cDNA 模板0.5 μl,ddH2O 4.1 μl。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,58℃退火45 s,40个循环。每个样本设3个复孔,同时设无模板阴性对照。反应结束后,各个样本的Ct值分别取平均数。以对照组的靶基因表达量为1,2-ΔΔCt即为实验组相对对照组靶基因表达的倍数。

2.3. 统计学处理

采用SPSS13.0 统计软件处理实验数据,数据均以−x + s表示,组间均值比较采用单因素方差分析。P < 0.05 认为统计学有显著差异。

3. 结果

3.1. 冬凌草甲素对乳腺癌Bcap37细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性

观察10,20,40 μM冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞存活的作用。取对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞消化后加入96孔板,调节细胞密度为10,000个每孔,5%CO2 37 ℃ 孵育过夜。移除培养基,每孔加入用培养基配制的浓度梯度药物100 μl,每个药物浓度设置5复孔。5%CO2 37 ℃ 孵育24小时,倒置显微镜下观察。避光条件下,每孔加入20 μl MTT溶液,5%CO2 37 ℃ 孵育4小时后移除含MTT的培养基。每孔加入100 μl二甲基亚砜,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪,在570 nm波长处测量各孔吸光值,计算细胞增殖活力。结果显示,冬凌草甲素作用24小时可明显抑制Bcap37人乳腺癌细胞株的增殖,且呈现明显的剂量依赖性(图1)。

3.2. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞的抑制作用呈时间依赖性

观察40 μM冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞的作用。取对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞消化后加入96孔板,调节细胞密度为10,000个每孔,5%CO2,37℃孵育过夜。移除培养基,每孔加入用培养基配制的浓度梯度药物100 μl,每个药物浓度设置5复孔。5%CO2 37 ℃ 分别孵育12,24和48小时,

Figure 1. The inhibition of oridonin on Bcap37 cells shows dose-dependence

图1. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞Bcap37生长的抑制作用呈剂量依赖性(*P < 0.05)

倒置显微镜下观察。避光条件下,每孔加入20 μl MTT溶液,5%CO2,37℃孵育4小时后移除含MTT的培养基。每孔加入100 μl二甲基亚砜,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪,在570 nm波长处测量各孔吸光值,计算细胞活力。结果显示,作用12,24和48小时后,冬凌草甲素可明显抑制Bcap37人乳腺癌细胞株的增殖,且呈现明显的时间依赖性(图2)。

3.3. 冬凌草甲素(Oridonin)对Bcap37细胞Bcl-2 mRNA的抑制作用

取对数生长期的乳腺癌细胞,消化并接种于无菌培养瓶中。以不同浓度的冬凌草甲素处理24小时后,收集细胞,用ABI PRISM® 6100 Nucleic Acid PrepStation试剂盒提取细胞总RNA。总RNA的质量和完整性用分光亮度计在260 nm/280 nm下分析。等量的RNA用SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System在Gene Amp® PCR System 9700反转录为cDNA。扩增反应在PCR扩增仪上进行。用β-actin作为内参定量。检测Bcl-2 mRNA的表达含量。本实验研究发现冬凌草甲素作用于Bcap37细胞24小时,随药物浓度的升高,Bcl-2 mRNA的表达逐渐下降(图3)。

3.4. 冬凌草甲素(Oridonin)对Bcap37细胞Bax mRNA的调节作用

取对数生长期的乳腺癌细胞,消化并接种于无菌培养瓶中。以不同浓度的冬凌草甲素处理24小时后,收集细胞,检测Bax mRNA的表达含量。本实验研究发现冬凌草甲素作用于Bcap37细胞24小时,随药物浓度的升高,Bax mRNA的表达上调。由此可推断冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap37细胞的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡(图4)。

Figure 2. The inhibition of oridonin on Bcap37 cells shows time-dependence

图2. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞Bcap37生长的抑制作用呈时间依赖性(*P < 0.05)

Figure 3. The effects of oridonin on Bcl-2 mRNA expression of Bcap37 cells

图3. 冬凌草甲素对Bcap37细胞Bcl-2 mRNA的调节作用(*P < 0.05)

Figure 4. The effects of oridonin on Bax mRNA expression of Bcap37 cells

图4. 冬凌草甲素对Bcap37细胞Bax mRNA的调节作用(*P < 0.05)

4. 讨论

本研究发现冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用Bcap-37细胞24 h,Bcl-2的mRNA表达显著降低,Bax的mRNA表达显著增加。由此推断冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap37细胞生长的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡。

冬凌草甲素在抗乳腺癌方面的作用已有大量报道。崔桥等发现,冬凌草甲素诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡 [4] 。朱仁书等发现,冬凌草甲素可显著抑制MCF-7细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,并呈现出一定的剂量–效应与时间–效应关系 [2] 。江永青等通过体外实验证实冬凌草甲素可通过激活Caspase途径,下调抑制凋亡基因Bcl-xl的表达,同时上调促进凋亡基因Bid及caspase3的表达,进而诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡 [3] 。彭延延等通过体外实验表明冬凌草甲素通过下调MMP-2和MMP-9明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭 [5] 。汪茗等研究表明冬凌草甲素可通过调控PI3K/Akt通路,抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞中PI3K的活性,使下游p-Akt、p-GSK3β蛋白表达降低,进而诱发细胞凋亡 [6] 。岳静发现冬凌草甲素对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用呈时间依赖性、浓度依赖性;冬凌草甲素阻滞MCF-7细胞于G2/M期,且可诱导其凋亡;冬凌草甲素可下调wnt4、GSK3β-catenin的表达 [7] 。李秀才发现冬凌草成分冬凌草素乙和冬凌草素甲诱导乳腺癌MCF-7细胞停滞于S/G2/M期,减慢G1/S期进程 [8] 。李瑞芳发现在一定的浓度范围内,冬凌草甲素可下调K562细胞的端粒酶活性。同时细胞周期各时相分布发生变化,G0/G1期或G2/M期细胞增多,S期细胞减少 [9] 。

余越美等研究发现冬凌草甲素可以诱导乳腺癌细胞Bcap-37发生凋亡,其可能与Survivin和GADD34的调控相关 [10] 。杜海爽等研究发现冬凌草甲素可抑制乳腺癌Bcap-37细胞的增殖,该作用可能与p21mRNA表达上调及cdc、cyclin B1 mRNA表达下调有关 [11] 。本研究也发现冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。同时我们的研究结果也表明冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap-37细胞生长的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡。

基金项目

浙江省自然科学基金项目(LQ13H280002),河南省基础与前沿技术研究计划项目(142300410388,132300410048),宁波市自然科学基金( 2015A 610234)。

文章引用

于 洋,刘彦隆,王小芳,钱 国,尤 伟. 冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用
The Inhibition Effects of Oridonin on Bcap-37 Cells[J]. 生物医学, 2017, 07(04): 79-84. http://dx.doi.org/10.12677/HJBM.2017.74013

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