Hans Journal of Biomedicine
Vol. 09  No. 04 ( 2019 ), Article ID: 31968 , 8 pages
10.12677/HJBM.2019.94023

Comparison of Four Methods for Extracting the Genomic DNA of Staphylococcus aureus

Zhiqing Zou1, Min Zhang1, Xiaoyue Dai1, Wen Xia1, Yaling Zhou2, Lei He2, Jiayu Bai1, Ye Su1, Dinesh Kumar Kesavan1, Liang Wu1*, Qing Yin2, Huaxi Xu1

1School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu

2Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu

Received: Aug. 9th, 2019; accepted: Aug. 23rd, 2019; published: Aug. 30th, 2019

ABSTRACT

Objective: To compare the effects of four methods, including boiling method, improved alkali cracking method, magnetic bead method and adsorption column method, for extracting the genomic DNA of S. aureus, selecting methods with better extraction quality and more suitable for automation, to provide technical support for rapid detection of clinical S. aureus infection. Methods: 20 clinical strains of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) were isolated and their DNA was extracted by boiling method, improved alkali cracking method, magnetic bead method and adsorption column method. The extraction effects of spa gene, mecA gene and femB gene in S. aureus were detected by polymerase chain reaction (PCR). Results: In the DNA gene template extracted by magnetic bead method, all samples detected spa genes, mecA genes and femB genes; in the DNA gene template extracted by adsorption column method, all samples detected spa genes and mecA genes, while 19 samples detected femB genes; in the DNA gene template extracted by improved alkali cracking method, all samples detected spa genes, and 19 samples detected mecA genes and femB genes; in the DNA gene template extracted by boiling method, only 7 samples and 8 samples detected spa genes, mecA genes and none of the samples detected femB genes. Conclusion: The DNA gene template extracted by improved alkali cracking method, magnetic bead method and adsorption column method can be used for PCR assay, but the direct boiling method is not suitable for clinical S. aureus genomic DNA extraction. Magnetic bead method uses the shortest time, which is more suitable for a large number of rapid automatic extraction.

Keywords:Staphylococcus aureus, DNA Extraction, PCR Detection

4种方法提取金黄色葡萄球菌基因 DNA效果的比较

邹治情1,张敏1,戴晓玥1,夏雯1,周亚玲2,何蕾2,白佳玉1,苏叶1, Dinesh Kumar Kesavan1,吴亮1*,阴晴2,许化溪1

1江苏大学医学院,江苏 镇江

2江苏大学附属医院,江苏 镇江

收稿日期:2019年8月9日;录用日期:2019年8月23日;发布日期:2019年8月30日

摘 要

目的:比较4种方法,包括煮沸法、改良碱裂解法、磁珠法和吸附柱法提取金黄色葡萄球菌基因DNA效果,为临床金黄色葡萄球菌感染的快速检测提供技术支撑。方法:选取20株临床分离耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,分别使用煮沸法、改良碱裂解法、磁珠法和吸附柱法提取基因DNA。通过PCR法扩增所提取DNA模板中金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和femB基因,以评估4种方法提取效果。结果:磁珠法制备的模板中,PCR法可以扩增出所有标本的spa基因、mecA基因和femB基因;吸附柱法制备的模板中,所有标本均可扩增出spa基因和mecA基因,而仅19个标本扩增出femB基因;以改良手工碱裂解法制备的模板,所有标本均可扩增出mecA基因,19标本可以扩增出spa基因和femB基因;煮沸法制备的模板中,PCR法可以分别扩增出7个标本的spa基因,8个标本的mecA基因,所有标本均未扩增出femB基因。结论:改良碱裂解法、吸附柱法和磁珠法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA均可以用于PCR扩增,直接煮沸法提取效果较差,不适合用于临床金黄色葡萄球菌基因组DNA提取;磁珠法用时最短,更适合于大量快速自动化提取。

关键词 :金黄色葡萄球菌,DNA提取,PCR检测

Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

金黄色葡萄球菌是人类皮肤表面一种常见致病菌 [1] ,可以引起多种化脓性感染 [2] ,也是目前最重要的医院内感染性病原体。随着近年来β-内酰胺类抗生素的广泛应用 [3] ,临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的分离率迅速上升 [4] ,并且患者病死率也逐年增加 [5] 。在MRSA菌感染的治疗中,早期诊断具有重要意义,分子生物学技术(如PCR法)是目前最具前景的诊断方法。

金黄色葡萄球菌是革兰阳性菌 [6] ,具有较厚的细胞壁结构,主要含有肽聚糖附磷壁酸,而且90%的金黄色葡萄球菌细胞表面都含有蛋白A,并与细胞壁中的肽聚糖结合成致密的共价交联结构 [7] ,增加了提取该菌基因组DNA的难度。现有的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法包括煮沸法 [8] 、免疫磁珠法 [9] 、各种裂解法(包括CTAB裂解、SDS裂解等) [10] ,但目前尚缺乏对上述方法提取效果的横向比较研究 [11] 。

PCR技术是近20年来迅速发展的一种快速检测方法 [12] ,在医学检验中发挥重要作用,具有高灵敏性和特异度的优良品质,还兼具操作简便、成本较低等诸多优势 [13] 。获得质量合格的模板DNA是开展PCR检测的先决条件,本研究比较了现有的4种常用金黄色葡萄球菌基组DNA提取方法,现将结果汇报如下 [14] 。

2. 材料和方法

2.1. 材料

2.1.1. 菌种来源

本研究中使用的20株MRSA菌株均来自于江苏大学附属医院检验科微生物室鉴定分离。所有菌株均经VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)鉴定为MRSA菌。

2.1.2. 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司;酵母浸出液、胰蛋白酶(英国OXIOD公司);羊血琼脂培养平板、Muller-Hinton培养基(法国生物梅里埃公司);溶菌酶(美国Amersco公司);蛋白酶K溶液(20 mg/mL) (美国Merck公司);琼脂糖(西班牙进口分装);2 × Taq Master Mix (Dye Plus) (南京Vazyme公司);TanonTM DNA Maker (上海天能公司);改良碱裂解法中所需试剂配制包括,溶液1 (含25 mol/L Tris·HCl,10 mmol/L EDTA-Na2和50 mmol/L葡萄糖),经高压灭菌后于4℃保存;溶液2含有0.2 mol/L NaOH和10% (w/v) SDS,该液现配现用;溶液3含有醋酸钾150 mg,冰醋酸11.5 mL,以灭菌蒸馏水定容至100mL,室温下保存备用。其他试剂均为国产分析纯。

2.1.3. 引物

参考李克诚 [15] 等报道合成spa检测引物,参考黄辉 [16] 等报道合成mecA基因和femB基因(见表1),由苏州涨迅生物公司合成。

Table 1. Staphylococcus aureus spa, mecA and femB gene amplification primers

表1. 金黄色葡萄球菌spa、mecA和femB基因扩增引物

2.1.4. 主要仪器

电热恒温培养箱(绍兴市苏珀仪器有限公司);气浴恒温振荡器(江苏科析仪器有限公司);恒温水浴锅(嘉兴俊思电子有限公司);梯度PCR仪(西安TIANLONG科技有限公司);低温高速离心机(德国Eppendorf公司);凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2.2. 方法

2.2.1. 细菌复苏和培养

所有细菌均先涂布于羊血琼脂平板,于37℃温箱中培养,12 h后挑取单个菌落接种于3 mL液体LB培养液,37℃、220 rpm连续振摇培养12 h后,取上述新鲜饱和菌液1.5 mL,以12,000 r/min离心2 min,弃上清,收集沉淀用于细菌基因组DNA提取。

2.2.2. 磁珠法

向2.2.1收集的菌种沉淀中加入500 μL LBS溶液,100 μL溶菌酶溶液(20 mg/mL)和20 μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL),充分重悬后于37℃中温育30 min,再转至56℃中温育10 min,其间注意颠倒混匀3次,加入40 μL混匀的磁珠悬浮溶液,充分吹打混匀后于56℃孵育10 min,磁性分离1 min。向样品管加入600 μL Buffer WS1,涡旋震荡30 s,磁性分离1 min;继续向样品管加入600 μL Buffer WS2,涡旋震荡30 s,磁性分离1 min;向样品管加入600 μL Buffer WS3,涡旋震荡30 s,磁性分离1 min;最终向样品管加入50 μL Buffer ES,将磁珠悬浮,65℃混匀温浴5 min以上,磁性分离1 min后用移液器小心吸取上清转移到另一干净的灭菌离心管,此即提取的细菌DNA,−20℃冷冻保存备用。

2.2.3. 吸附柱法

取2.2.1收集的菌种沉淀,向沉淀中加入180 μL溶菌酶溶液(20 mg/mL)于37℃温育30 min,再向管中加入20 μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL),混匀后加入220 μL缓冲液GB,于70℃放置10 min,再加220 μL无水乙醇沉淀核酸,将上一步所得溶液和絮状沉淀全部加入一个吸附柱CB3中,以12,000 r/min离心30 s,倒掉废液;向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD,12,000 r/min离心30 s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中;向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW,12,000 r/min离心30 s,倒掉废液,吸附柱CB3放入收集管中,重复一次;将吸附柱CB3放回收集管中,12,000 r/min离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置10 min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μL缓冲液TE,室温放置5 min,12,000 r/min离心2 min,将溶液收集到离心管中,−20℃冷冻保存备用。

2.2.4. 改良碱裂解法

取2.2.1收集的菌种沉淀,加入200 μL溶液1充分重悬后加入20 μL溶菌酶溶液(20 mg/mL)充分吹吹打完全重悬后于37℃恒温培养箱孵育过夜,次日加20 μL蛋白酶K溶液于55℃水浴30 min,后加300 μL溶液2 (现配现用),上下颠倒5~10次,静置5 min,充分混匀,加入300 μL预冷溶液3,上下颠倒5~10次充分混匀(可见大量白色絮状沉淀),置冰上5 min后12,000 r/min离心10 min,取上清600 μL,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇,剧烈震荡30 s后12000 r/min离心10 min,小心吸取上清至一新的Ep管内,加入0.7倍体积异丙醇,颠倒混匀后在−20℃放置1~4 h,12000 r/min离心10 min后弃尽上清,用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀2次,弃尽上清放置空气中自然晾干,于白色沉淀中加入50 μL灭菌双蒸水,−20℃冷冻保存备用。

2.2.5. 煮沸法

取2.2.1收集的菌种沉淀,加200 μL灭菌双蒸水充分吹打重悬混匀,于沸水中煮沸10 min,以12,000 r/min离心10 min收集上清液,于−20℃冷冻保存备用。

2.2.6. PCR法检测spa基因、mecA基因和femB基因

PCR反应体系中含有2 × Taq Master Mix预混液12.5 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,以灭菌双蒸水补足体系至25 μL。反应条件为94℃预变性5 min,94℃变性30 s,spa基因55℃退火1 min;mecA基因51℃退火1 min;femB基因57℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,最终72℃延伸10 min。PCR反应结束后,以1.2%琼脂糖电泳检测PCR产物。

3. 结果

3.1. spa基因检测结果

图1(a)和图1(b)所示,以磁珠法和吸附柱法制备的DNA模板中spa基因可以全部被检出;如图1(c)所示,改良碱裂解法制备的DNA模板中可以检出19株菌的spa基因,仅1株菌未检出;如图1(d)所示,煮沸法制备的DNA模板中,仅检出7株菌spa基因。

M: DNA marker 1~20: 20株MRSA菌

Figure 1. Staphylococcus aureus spa gene detection results in DNA templates prepared by four methods; (a) Magnetic bead method; (b) Adsorption column method; (c) Modified alkali lysis; (d) Boiling method

图1. 4种方法制备的DNA模板中金黄色葡萄球菌spa基因检测结果;(a) 磁珠法;(b) 吸附柱法;(c) 改良碱裂解法;(d) 煮沸法

M: DNA marker 1~20: 20株MRSA菌

Figure 2. Detection results of Staphylococcus aureus mecA gene in DNA template prepared by four methods; (a) Magnetic bead method; (b) Adsorption column method; (c) Modified alkali lysis; (d) Boiling method

图2. 4种方法制备的DNA模板中金黄色葡萄球菌mecA基因检测结果;(a) 磁珠法;(b) 吸附柱法;(c) 改良碱裂解法;(d) 煮沸法

3.2. mecA基因检测结果

图2(a)~图2(c)所示,以磁珠法、吸附柱法和改良碱裂解法制备的DNA模板中均可以检出mecA基因;如图2(d)所示,煮沸法制备的DNA模板仅能检出8株菌的mecA基因。

3.3. femB基因检测结果

图3(a)所示,以磁珠法制备的DNA模板中均可以检出femB基因;如图3(b)~图3(c)所示,以吸附柱法和改良碱裂解法制备的DNA模板中有19株菌femB基因均可被检出出;如图3(d)所示,以煮沸法制备的DNA模板均未扩增出femB基因。

M: DNA marker 1~20: 20株MRSA菌

Figure 3. Detection results of Staphylococcus aureus femB gene in DNA template prepared by four methods; (a) Magnetic bead method; (b) Adsorption column method; (c) Modified alkali lysis; (d) Boiling method

图3. 4种方法制备的DNA模板中金黄色葡萄球菌femB基因检测结果;(a) 磁珠法;(b) 吸附柱法;(c) 改良碱裂解法;(d) 煮沸法

4. 讨论

金黄色葡萄球菌具有坚固的细胞壁,其基因组DNA提取难度远大于其他细菌 [17] 。本研究比较了目前常用的4种基因组DNA提取方法效果发现,磁珠法、吸附柱法和手工碱裂解法均具有较好的提取效果,而煮沸法提取效果较差。

磁珠法的提取时间是3种方法中(磁珠法、吸附柱法和手工碱裂解法)最短的。磁珠法采用包裹有氧化硅的磁性纳米粒子 [18] ,粒径约为20 nm,利用氧化硅在高盐、低pH值条件下能吸附生物核酸,而在低盐、高pH值条件下释放核酸的特性,结合外部磁场实现从生物样本中分离核酸的目的 [19] 。在外加磁场作用下将负载核酸的磁珠从样品中分离洗脱,加入适当溶液使核酸脱离磁珠可得到纯化的核酸 [20] 。磁珠法可以省去离心过滤等费时步骤,操作简便且不使用氯仿和异丙醇有毒试剂;磁珠与DNA的特异性结合保证了提取质量,十分适合后续分子生物学研究 [21] 。目前已有基于磁珠法的基因组DNA自动化提取仪,极大地方便了临床中开展金黄色葡萄球菌的检测工作。

吸附柱法采用特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌的基因组DNA [22] ,其硅基质材料为特有新型材料,能够高效专一吸附DNA,避免蛋白质、酯类以及多糖等生物大分子的污染,提取的基因组DNA片段大,纯度高,质量稳定可靠。手工碱裂解法破壁能力强 [23] ,提取DNA质量相对煮沸法较好,虽然成本较低但是操作复杂用时过长约需2天,并且提取过程需要多种有毒试剂,对操作人员伤害较大并且不利于绿化环保,所提取DNA模版虽可用于实验研究,但是程序繁琐复杂无法完成大批量自动化提取。煮沸法虽然操作简便但是提取效果很差,不稳定性极高,DNA模版质量很低无法用于后续研究,不推荐用于金黄色葡萄球菌的DNA提取。综合所述,我们可以根据实际需求选取最合适最恰当的方法。

基金项目

镇江市2017年度科技创新资金(重点研发计划–社会发展项目) SH2017024;江苏省2018年度预防医学科研课题Y2018108;江苏省博士后科研基金资助项目(1601002C);江苏大学大学生科研立项(18A482)。

文章引用

邹治情,张 敏,戴晓玥,夏 雯,周亚玲,何 蕾,白佳玉,苏 叶,Dinesh Kumar Kesavan,吴 亮,阴 晴,许化溪. 4种方法提取金黄色葡萄球菌基因DNA效果的比较
Comparison of Four Methods for Extracting the Genomic DNA of Staphylococcus aureus[J]. 生物医学, 2019, 09(04): 154-161. https://doi.org/10.12677/HJBM.2019.94023

参考文献

  1. 1. Pankratova, G., Hederstedt, L. and Gorton, L. (2019) Extracellular Electron Transfer Features of Gram-Positive Bacteria. Analytica Chimica Acta, 1076, 32-47. https://doi.org/10.1016/j.aca.2019.05.007

  2. 2. Tateda, K., Ohno, A., Ishii, Y., et al. (2019) Investigation of the Susceptibility Trends in Japan to Fluoroquinolones and Other Antimicrobial Agents in a Nationwide Collection of Clinical Isolates: A Longitudinal Analysis from 1994 to 2016. Journal of Infection and Chemotherapy, 25, 594-604. https://doi.org/10.1016/j.jiac.2019.03.008

  3. 3. Monciardini, P., Bernasconi, A., Iorio, M., et al. (2019) Antibacterial Aromatic Polyketides Incorporating the Unusual Amino Acid Enduracididine. Journal of Natural Products, 82, 35-44. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.8b00354

  4. 4. Gentile, A., Bakir, J., Ensinck, G., et al. (2018) Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections: Hospitalization and Case Fatality Risk in 10 Pediatric Facilities in Argentina. Archivos Argentinos de Pediatría, 116, E47-E53. https://doi.org/10.5546/aap.2018.eng.e47

  5. 5. Amirsoleimani, A., Brion, G.M., Diene, S.M., et al. (2019) Prevalence and Characterization of Staphylococcus aureus in Wastewater Treatment Plants by Whole Genomic Sequencing. Water Research, 158, 193-202. https://doi.org/10.1016/j.watres.2019.04.035

  6. 6. Belbekhouche, S., Bousserrhine, N., Alphonse, V., et al. (2019) From Beta-Cyclodextrin Polyelectrolyte to Layer-by-Layer Self-Assembly Microcapsules: From Inhibition of Bacterial Growth to Bactericidal Effect. Food Hydrocolloid, 95, 219-227. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2019.04.037

  7. 7. Chauhan, J., Kwasny, S.M., Fletcher, S., et al. (2019) Optimization of a Small-Molecule Lipid II Binder. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 29, 1849-1853. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2019.04.046

  8. 8. 田小兰, 冯俊丽, 汪艺. 一种快速高效的DNA提取方法及其在qPCR检测金黄色葡萄球菌中的应用[J]. 食品科技, 2019(2): 344-350.

  9. 9. Du, M.H., Li, J.W., Zhao, R.X., et al. (2018) Effective Pre-Treatment Technique Based on Immune-Magnetic Separation for Rapid Detection of Trace Levels of Salmonella in Milk. Food Control, 91, 92-99. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.03.032

  10. 10. Minarovicova, J., Cabicarova, T., Kaclikova, E., et al. (2018) Culture-Independent Quantification of Pathogenic Bacteria in Spices and Herbs Using Real-Time Polymerase Chain Reaction. Food Control, 83, 85-89. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2016.12.025

  11. 11. Ernst, C., Bartel, A., Elferink, J.W., et al. (2019) Improved DNA Extraction and Purification with Magnetic Nanoparticles for the Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Veterinary Microbiology, 230, 45-48. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2019.01.009

  12. 12. Umesha, S. and Manukumar, H.M. (2018) Advanced Molecular Diagnostic Techniques for Detection of Food-Borne Pathogens: Current Applications and Future Challenges. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 58, 84-104. https://doi.org/10.1080/10408398.2015.1126701

  13. 13. Li, J., Li, X.L., Shi, X.J., et al. (2019) A Designed Experiment: Polymorphism Analysis of Angiotensin-Converting Enzyme Gene from Human Buccal Epithelial Cells. Biochemistry and Molecular Biology Education, 47, 168-174. https://doi.org/10.1002/bmb.21215

  14. 14. 刘晔华, 陈锦艳, 江雁, 等. 磁珠法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的评价[C]//第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛. 2016: 1.

  15. 15. 李克诚, 李琼, 夏菲, 等. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌spa基因分型[J]. 疾病监测, 2012, 27(11): 877-880.

  16. 16. 黄辉, 陈颖, 安如俊, 等. MRSA中mecA及femB基因的检测与耐药相关性[J]. 微生物学杂志, 2009, 29(3): 54-56.

  17. 17. Nasser, A., Moradi, M., Jazireian, P., et al. (2019) Staphylococcus aureus versus Neutrophil: Scrutiny of Ancient Combat. Microbial Pathogenesis, 131, 259-269. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2019.04.026

  18. 18. Zhang, J., Zhu, M.S., Yang, Y.J., et al. (2018) Extraction of Genomic DNA via Superparamagnetic Fe3O4 Magnetic Colloidal Nanocrystal Clusters. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 18, 8105-8110. https://doi.org/10.1166/jnn.2018.16399

  19. 19. Meng, X.Y., Yang, G.T., Li, F.L., et al. (2017) Sensitive Detection of Staphylococcus aureus with Vancomycin-Conjugated Magnetic Beads as Enrichment Carriers Combined with Flow Cytometry. ACS Applied Materials & Interfaces, 9, 21464-21472. https://doi.org/10.1021/acsami.7b05479

  20. 20. Zhang, H.L., Huang, F.C., Cai, G.Z., et al. (2018) Rapid and Sensitive Detection of Escherichia coli O157:H7 Using Coaxial Channel-Based DNA Extraction and Microfluidic PCR. Journal of Dairy Science, 101, 9736-9746. https://doi.org/10.3168/jds.2018-14730

  21. 21. Luo, J., Yu, J.P., Yang, H., et al. (2018) Parallel Susceptibility Testing of Bacteria through Culture-Quantitative PCR in 96-Well Plates. International Journal of Infectious Diseases, 70, 86-92. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2018.03.014

  22. 22. Wang, J., Shen, H.J., Huang, C., et al. (2017) Highly Efficient and Multidimensional Extraction of Targets from Complex Matrices Using Aptamer-Driven Recognition. Nano Research, 10, 145-156. https://doi.org/10.1007/s12274-016-1273-9

  23. 23. 李佳, 李亚娟, 胡俊菁, 等. 奶牛乳房炎主要致病菌DNA不同提取方法的比较[J]. 中国兽医杂志, 2017(2): 40-41.

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