¹广东药科大学药学院，广东 广州

²广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州

收稿日期：2020年8月27日；录用日期：2020年9月4日；发布日期：2020年9月11日

摘要

目的：探讨针对小核RNA基因，构建本科聚合酶链反应(PCR)教学实验的可行性。方法：调取NCBI数据库中小核RNA基因U1、U2、U4、U5及U6的序列，分别截取5’端和3’端部分序列作为上、下游引物，进行电子PCR，分析其靶点情况和引物效率。结果：电子PCR能清楚显示每对引物潜在的靶位点及相应PCR产物的大小。针对U1、U2、U4、U5、U6基因的引物，对应的靶位点数目分别为18、16、4、1、61，对应的PCR产物大小分别为164~166、187~188、144、117、95~108 bp。结论：针对U1、U2、U6基因的引物，其潜在的靶位点数量较多，且绝大部分靶位点的引物结合效率较好，相应的PCR扩增子长度较短，PCR容易实现，PCR连同电泳检测有望在2个小时内完成，比较适合构建本科PCR教学实验。

关键词

小核RNA，聚合酶链反应，教学实验

Bioinformatics Analysis of Establishment of PCR Teaching Experiments Targeting Small Nuclear RNA Genes

Yan Liu¹, Liuying Zhong¹, Jiaqi Xu², Zhenyu He^2*

¹School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou Guangdong

²School of Life Science and Biopharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou Guangdong

Received: Aug. 27^th, 2020; accepted: Sep. 4^th, 2020; published: Sep. 11^th, 2020

ABSTRACT

Objective: To establish PCR experiments targeting small nuclear RNA genes, which is expected to be used in undergraduate teaching. Methods: The sequences of snRNA coding genes U1, U2, U4, U5 and U6 in NCBI database were obtained, and the 5’ and 3’ end partial sequences were intercepted as upstream and downstream primers for In-Silico PCR. The targets and primer efficiency were analyzed. Results: The potential target sites of each pair of primers and the size of corresponding PCR products could be clearly displayed by In-Silico PCR. The corresponding target number of primers for U1, U2, U4, U5 and U6 genes were 18, 16, 4, 1, 61, and the corresponding PCR product sizes were 164 - 166, 187 - 188, 144, 117 and 95 - 108 bp. Conclusion: For the primers of U1, U2, U6 gene, there are many potential target binding sites, and most of them have good binding efficiency. The corresponding length of PCR amplicons is short, and the PCR is easy to realize. PCR together with electrophoresis detection is expected to be completed in two hours, which is suitable for the establishment of undergraduate PCR teaching experiment.

Keywords:Small Nuclear RNA, Polymerase Chain Reaction, Teaching Experiment

Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

PCR作为经典的分子生物学技术，很有必要纳入相关专业的本科实验教学体系，但目前使用市面上的教学用PCR试剂盒开展实验教学，时程长、成本高，且试剂盒提供的模板、引物背景不清楚，不太利于教学，亟需加以改进。

本研究旨在自主构建一个更贴近教学实际的PCR实验体系，其核心要素即模板(靶标)、引物的背景必须清晰，且能在较短时间内完成实验流程。我们选择小核RNA (snRNA)基因作为靶标，设计引物，通过电子PCR分析其可行性。

2. 方法

从GenBank中调取snRNA基因组DNA序列，找出编码区序列，再根据实际情况分别截取5’端和3’端部分序列作为上、下游引物进行电子PCR (见表1)，使用的在线分析程序为UCSC Genome Browser的In-Silico PCR [1] 和NCBI的primer-blast [2]。使用Primer Premier 5.0软件分析引物与模板的结合效率。

表1. snRNA编码基因序列信息及电子PCR所用引物序列

3. 结果

针对不同snRNA编码基因相应引物的配对情况、结合效率、潜在的靶位点数量及PCR产物的大小分别见表2~5。

表2. U1基因引物F1、R1电子PCR结果

表3. U2基因引物F2、R2电子PCR结果

表4. U4基因引物F4、R4及U5基因引物F5、R5电子PCR结果

表5. U6基因引物F6、R6电子PCR结果

4. 讨论

PCR是聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)的简称，用于体外扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的一种特殊的DNA复制，其最大特点是能使微量的DNA大量增加。PCR技术堪称分子生物学的支撑技术，在生命科学领域应用广泛，比如，在基因工程中，用于目的基因的制备；在临床上，用于遗传病的基因诊断、感染性疾病的病原体检测、肿瘤基因检测及器官移植的配型 [3]；在法医学鉴定中，用于亲权鉴定、个体识别 [4] [5]；在食品领域，用于食源性致病菌的鉴定、食品中成分种类的检测、食品中有效成分的检测、转基因食品的鉴定等 [6]；在药学领域，可用于中药的鉴定 [7]、个体化用药相关基因的检测 [8]；在环境科学领域，用于环境监测 [9]。因此，在《生物化学与分子生物学》以及相关的课程中开设PCR实验的意义不言而喻，它不仅能加深同学们对PCR原理的理解，而且能让同学们通过实践认识到该项技术的特点和价值。

目前已有多款教学用PCR试剂盒，大体上分为两类，第一类带有模板、上游引物、下游引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10× PCR缓冲液、超纯水；第二类带有模板、上游引物、下游引物、2× Taq PCR MasterMix、超纯水，其中的2× Taq PCR MasterMix包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，使用时，只需补加实验所需的引物和模板后，即可进行PCR反应，它比第一类要简便、快速。但无论是哪一类的试剂盒，公司出于商业利益考虑，均未公布模板和引物序列，由于无法知晓具体的靶标序列和引物序列，教师在讲解引物和模板的关系时只能泛泛而谈，在介绍引物的设计原则和PCR循环参数的设置时更是无法条分缕析，学生只能一知半解。

本研究旨在构建一个靶标、引物背景明确且简便、快速的教学用PCR体系，由于PCR反应体系包含五个基本要素：引物、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板和缓冲液(含Mg²⁺)，其中耐热DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液三个基本要素可以三合一，目前有现成的含有三者成分的混合物(Mix)可购买使用，可以大大节省配制PCR体系的时间，并且有一些Mix中含有的DNA聚合酶具有极强的抗抑制能力，对模板的纯度要求低，能够直接用未纯化的样本进行PCR扩增(所谓的直接PCR)，无需核酸纯化步骤，只需微量的原始样本作为PCR反应的模板，从而节约了实验时间和成本，为DNA扩增带来前所未有的便捷。余下的二个要素即模板、引物成为关键要素，本研究拟使用人的口腔上皮细胞为样本进行直接PCR，可以在实验课现场取样，取样几分钟内就可完成，且由于材料来自同学自身，能提高其学习兴趣。要使PCR达到良好的效果，模板(靶标)非常关键，如果靶标丰度高，意味着起始模板浓度高，不仅PCR的成功率会大大增加，而且运行的循环次数可以相应减少，从而缩短扩增时间。本研究拟选择snRNA编码基因为靶标，snRNA编码基因产物为snRNA (small nuclear RNA，小核RNA)，包括U1、U2、U4、U5、U6等，它们是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spliceosome)的主要成分，参与mRNA前体的加工过程 [10] [11]。理论上，适应机体生理功能的需要，这类基因应该有较高丰度，事实上，本研究的生物信息学分析显示U1、U2、U6基因确实丰度较高，与文献 [12] [13] 报道一致，它们存在基因家族，不仅有多拷贝的真基因，还有很多序列同源的假基因，因此引物结合的靶位点较多，PCR成功的概率很大，且每对引物扩增的数个靶位点的PCR产物大小一致或接近，容易形成集中的便于观察的产物条带，这些产物长度都在200 bp以下，分子量较小，电泳鉴定所需时间较少，能进一步缩短整个实验的时长。

根据生物信息学分析结果，使用口腔上皮细胞进行直接PCR，PCR反应条件可以如下设置：94℃预变性8 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 s，30个循环；72℃再延伸5 min。考虑到PCR仪的升温、降温，PCR运行的时间可以控制在1 h以内，PCR前的样本采集及体系配制可以在10 min内完成，在PCR运行的过程中，可以介绍PCR基本原理和配制琼脂糖凝胶，PCR结束后，点样、电泳及结果观察可以在40 min内完成，整个实验流程不超过2 h。

综上，根据我们自行设计的引物，靶向snRNA编码基因U1、U2、U6基因中的任何一个，都有望在2 h内获得良好的PCR结果，从而构建一个贴近本科教学实际的PCR实验。

致谢

感谢广东药科大学2018年教育教学改革项目的支持。

文章引用

刘妍,钟柳英,徐嘉琪,何震宇. 靶向小核RNA基因构建PCR教学实验的生物信息学分析
Bioinformatics Analysis of Establishment of PCR Teaching Experiments Targeting Small Nuclear RNA Genes[J]. 计算生物学, 2020, 10(03): 41-47. https://doi.org/10.12677/HJCB.2020.103005

参考文献