ABSTRACT

In this paper, using China invention patent “rapeseed low poly peptides preparation method and products” (Patent No: 2007100533858) products as materials, the antitumor activity of the rapeseed low poly peptides was studied. The results showed that the rapeseed low poly peptides have inhibition to the growth of S₁₈₀ tumor; at the same time significantly improve a tumor-burdened immune function of mice; rise SOD value and reduce MDA value of mice serum; improve the formation of serum hemolysin HCIgM of tumor-burdened mice; and enhance the ability of macrophage cell and delayed-type hypersensitivity intensity.

Keywords:Rapeseed Low Poly Peptides, Antitumor Activity

菜籽低聚肽抗肿瘤活性研究

汤尚文¹，李云捷¹，于  博¹，肖志刚²，吴谋成^2*

¹湖北文理学院化学工程与食品科学学院，襄阳

²华中农业大学食品科技学院，武汉

Email: 41178619@qq.com, ^*wumch98@mail.hzau.edu.cn

收稿日期：2014年2月19日；修回日期：2014年3月24日；录用日期：2014年4月5日

摘  要

本文以中国发明专利“菜籽低聚肽的制备方法及产品”(专利号：2007100533858)的产品为材料，研究了菜籽低聚肽的抗肿瘤活性。结果表明，菜籽低聚肽对S₁₈₀肿瘤的生长具有抑制作用，同时明显提高荷瘤小鼠的免疫功能，使荷瘤小鼠血清中的SOD值升高和MDA值降低，提高荷瘤小鼠血清溶血素HCIgM的形成，增强巨噬细胞吞噬能力和迟发型超敏反应强度。

关键词

菜籽低聚肽，抗肿瘤活性

1. 引言

油菜是我国重要的油料作物之一，菜籽饼粕中的菜籽蛋白是一种非常优良的蛋白质源,其氨基酸生物效价PER值与WHO/FAO推荐值相近。专利“菜籽低聚肽的制备方法及产品”(专利号：2007100533858)所获得的分子量为1000~200道尔顿的菜籽低聚肽是目前分子量段最低的小肽群[1] ，具有极强的生物活性和多样性。本文试图以其产品1000~200道尔顿的菜籽低聚肽为材料，对其抗肿瘤、抗氧化、预防心脑血管疾病等方面的生物活性进行了较系统的初步研究，为菜籽低聚肽的进一步开发利用提供理论依据。

肿瘤是危害人类健康和生命最常见疾病之一，大量的实验和临床研究证明，肿瘤的发生、发展与机体的满意状态密切相关。正常的免疫功能是机体战胜疾病和恢复健康的主要因素。随着生物化学的发展，一些对肿瘤细胞具有抑制或杀死的多肽被不断发现，它们也可以通过激活机体自身免疫功能的肿瘤抗原肽、刺激巨噬细胞吞噬作用的加强或促进淋巴细胞增殖等途径来增强其抑制肿瘤的效果。

本文报导了分子量在1000~200之间的菜籽低聚肽抑制肿瘤生长的效果，为探讨开发与利用抑制肿瘤活性的菜籽低聚肽提供基础。

2. 材料

2.1. 实验材料

菜籽低聚肽RLP按专利“菜籽低聚肽的制备方法及产品”(专利号：2007100533858)方法制得[1] 。

昆明种SPF小鼠，雌性，5~6周龄，体重18~22 g；由湖北省卫生防疫站实验动物中心提供。

腹水型S₁₈₀肉瘤种鼠由华中科技大学同济医学院提供。

Wright染液：取0.1 g瑞氏粉加160 ml甲醇，溶解后棕色瓶保存。

Hank’s工作液：由A液，B液组成。

Hank’s A液：取160 g NaCl、8 g KCl、2 g MgSO₄∙7H₂O、2 g MgCl₂∙6H₂O加入800 ml水，另取2.8 g CaCl₂溶于100 ml水种，将两液混合后定容至1000 ml，加2 ml氯仿，4℃冰箱保存。

Hank’s B液：3.04 g Na₂HPO₄∙12H₂O、1.2 g KH₂PO₄和20 g葡萄糖加800 ml水，另取0.4 g酚红充分研磨，逐渐加入0.1 mol/LNaOH 10~15 ml，待酚红完全溶解后加水稀释至100 ml，将两液混合后加水定容至1000 ml，加2 ml氯仿，4℃冰箱保存。

Hank’s工作液由A液、B液和蒸馏水按1:1:18比例混合而成，经380 Pa灭菌10 min，冷却后4℃保存，可用一个月，临用前用3.5% NaHCO₃调节至PH 7.2~7.4。

Alsever抗凝液：取2.05 g葡萄糖、0.8 g柠檬酸钠和0.42 g NaCl，加水至100 ml，经380 Pa灭菌10 min，冷却后4℃保存备用。

绵羊红细胞(SRBC)：羊颈静脉血由湖北省卫生防疫站实验动物中心提供，Alsever液抗凝，4℃冰箱保存，用前生理盐水洗涤3次，配成20%浓度。

鸡红细胞(cock red blood cells，CRBC)：采自健康成年公鸡翼静脉，5倍Alsever液抗凝，4℃保存，临用前用前生理盐水洗涤3次，配成1%浓度。

豚鼠血清：豚鼠购自湖北省卫生防疫站实验动物中心，豚鼠心脏取血，将分离出的血清加入压积SRBC中(1:0.2, V/V)，4℃冰箱中放置30 min，离心取上清液，用生理盐水稀释成1:5血清备用。

2.3. 主要仪器

主要设备仪器见下表：

3. 实验方法

3.1. 接种方法

无菌获取S₁₈₀瘤种鼠的腹水，以生理盐水配制成细胞数位1 × 10⁶个/ml的细胞悬液：每只小鼠右前腋下接种0.2 ml。

3.2. 实验方法

实验动物随机分为正常对照组、荷瘤对照组、27.5 mg/(kg∙d)的Cy阳性对照组、25 mg/kg∙d菜籽低聚肽低剂量组、50 mg/kg∙d菜籽低聚肽中剂量组、75 mg/kg∙d菜籽低聚肽高剂量组。除正常对照组外，其余各组动物均接种肿瘤细胞液，接种次日开始按上述剂量分别用Cy和菜籽低聚肽灌胃，对照组用等容量的生理盐水灌胃，连续9天，第10天处死小鼠后实验。

3.3. 肿瘤抑制实验

眼眶取血后颈椎脱臼处死小鼠，摘取肿瘤、胸腺和脾，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干称重，分别计算抑瘤率、胸腺指数(mg胸腺/g体重)和脾指数(mg脾重/g体重)。

抑瘤率(%) = (对照组平均瘤重 − 剂量组平均瘤重)/对照组平均瘤重 × 100

3.4. 巨噬细胞吞噬实验

实验第十天，小鼠腹腔注射1%鸡红细胞(CRBC)1.0 ml，轻揉小鼠腹部，30 min后颈椎脱臼处死，腹腔注射2.5 ml Hank’s工作液，用注射器吸取腹腔液少许，于载玻片上推成涂片，自然干燥后用Wright染液染0.5~1 min后，以磷酸缓冲液冲去染液，干燥后电镜计数，按下式计算吞噬百分率计吞噬指数：

吞噬百分率 = 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数目(吞噬及未吞噬鸡红细胞的) × 100%

吞噬指数 = 被吞噬的鸡红细胞数/计数的巨噬细胞数目

3.5. 迟发型超敏反应(DTH)

实验第5天，小鼠腹部去毛，用1%二硝基氟苯(DNFB)丙酮麻油染液在去毛处均匀涂抹致敏(每鼠25 μL)，24 h后重复操作加强致敏一次。致敏第四天用10 μL DNFB溶液均匀涂抹右耳(两面)进行攻击，对照组同样涂耳但未致敏。24小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器在双耳相应部分各取下直径8 mm的耳片，称重，以两耳重差表示肿胀程度。

3.6. 血清溶血素含量测定

实验第2天，小鼠腹腔注射0.2 ml 20%绵羊红细胞(SRBC)进行免疫，隔7天后，再注射一次。眼眶取血后颈椎脱臼处死，分离血清，每只小鼠血清分成2份，一份不作任何处理，另外一份加等量的2-巯基乙醇后于37℃保温20 min以破坏IgM，再分别稀释500倍。

IgG溶血素的测定：取2-巯基乙醇处理血清0.5 ml和5%SRBC悬液0.5 ml充分混匀，加羊抗小鼠IgG (1:25稀释)和1:5稀释得豚鼠血清(补体)各0.5 ml，再加1.0 ml生理盐水。空白以0.5 ml生理盐水代替血清。

IgM溶血素的测定：取未处理血清0.5 ml、5%SRBC悬液0.5 ml、1:5稀释的补体0.5 ml和1.5 ml生理盐水混合于试管中。空白以0.5 ml生理盐水代替血清。

所有试管37℃保温1 hr，中间振摇一次，3000 r/min离心10 min，用空白调零后，上清液于540 nm处测定吸光度，根据下式计算IgG溶血素(HC_IgG)和IgM溶血素(HC_IgM)含量：

HC_IgG = 2-巯基乙醇处理血清的吸光度 × 稀释倍数

HC_IgM = 未处理血清的吸光度 × 稀释倍数

3.7. 菜籽低聚肽对小鼠血清MDA的影响

TBA法[2] [3] 。

3.8. 菜籽低聚肽对小鼠血清SOD的影响

羟胺法[2] [3] 。

4. 实验结果与分析

4.1. 菜籽低聚肽对荷S₁₈₀瘤小鼠的抑瘤作用和对小鼠免疫器官的影响

实验结果见表1所示。给小鼠25~75 mg/kg∙d剂量的抑瘤率与阳性环磷酰胺对照组抑瘤率59.21%相

比较，没有显著性差异。实验中还发现除Cy组外，各剂量受试组与对照组小鼠体重均正常增加，而且，RLP组小鼠体重增加更大一些。而Cy组小鼠与对照组小鼠比较，荷瘤对照组小鼠体重不但没有增加，还有所下降。说明Cy虽对荷瘤小鼠有一定的抑瘤作用，但亦有一定的负影响。而菜籽低聚肽对S₁₈₀瘤小鼠的不但具有抑瘤作用，对小鼠的正常增重没有影响，表明抑瘤效果更为明显。

免疫器官重量是反应机体非特异性免疫功能的重要指标，免疫抑制剂可以造成动物免疫器官重量下降或功能低下，而免疫促进剂可促使免疫器官重量接近或恢复至正常水平。

由表2可知，与正常对照组相比，各荷瘤组胸腺指数均下降，但只有Cy组有显著性差异；与荷瘤对照组相比，中、高剂量组胸腺指数达显著性水平，且接近于正常组水平。对于脾指数，菜籽低聚肽各组，均低于Cy组，远远低于荷瘤对照组。并随着剂量的增加，更接近于正常组。说明菜籽低聚肽有利于提高荷瘤小鼠免疫功能。

4.2. 菜籽低聚肽对荷S₁₈₀瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

由表3可知，荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均低于正常对照组。RLP各剂量组均可增强荷

瘤鼠巨噬细胞吞噬功能，特别是高剂量组。各组的吞噬指数也均升高。其中以75 mg/kg∙d RSP-R剂量效果最好，可使荷瘤鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数恢复到接近正常小鼠水平。

4.3. 菜籽低聚肽对荷S₁₈₀小鼠迟发型超敏反应的影响

二硝基氟苯(DNFB)是一种半抗原，与皮肤蛋白结合形成抗原，能刺激T淋巴细胞增值成致敏淋巴细胞，再次攻击后会诱发迟发型超敏反应(DTH)。表4的结果表明，RLP各剂量组均提高了荷瘤小鼠DTH反应强度，但只有高剂量组(75 mg/kg∙d)有较好的效果。

4.4. 菜籽低聚肽对荷S₁₈₀小鼠血清溶血素含量的影响

由表5可知，所有荷瘤鼠的IgG和IgM均明显低于正常对照组。RLP可提高荷瘤鼠的IgG和IgM溶血素含量，但与正常对照组比较，仍有显著性差异。

4.5. 菜籽低聚肽对荷S₁₈₀瘤小鼠血清中的SOD的影响

由表6可知，荷瘤鼠血清中的SOD值较正常对照组有所下降；各RLP剂量组的SOD值与荷瘤对照

组相比均升高，且中、高剂量组达显著水平，特别是高剂量组接近正常参照组。且RLP浓度与SOD值呈正依赖性关系。

4.6. 菜籽低聚肽对荷S₁₈₀瘤小鼠血清中的MDA的影响

由表7可知，与正常对照组相比，各荷瘤组的MDA值均升高；与荷瘤对照组相比，菜籽低聚肽各剂量组的MDA值均显著降低，其中中剂量组和高剂量组达显著水平，高剂量组接近正常对照组。

5. 小结

菜籽低聚肽在25~75 mg/kg∙d剂量下能显著得抑制肿瘤生长，与Cy对照组相比，没有阻碍小鼠生长的现象发生。菜籽低聚肽中、高剂量组可以显著提高巨噬细胞吞噬能力和迟发型超敏反应强度，但对HC_IgG和HC_IgM含量的提高没有显著影响，不过其中、高剂量组却可以显著提高荷瘤小鼠血清中的SOD值，降低MDA值。由此可见，菜籽低聚肽具有较显著的抑制肿瘤生长的作用。

6. 讨论

化疗药物在杀伤瘤细胞的同时也损害机体免疫细胞，因此，国内外学者开始应用免疫化学的综合疗法抗肿瘤。近年来，植物活性物质的研究越来越受到人们的关注，从天然植物中提取抑制肿瘤的活性多肽，特别是低聚肽也成为功能食品研究的一个发展方向。

本研究表明菜籽低聚肽能显著抑制移植性肿瘤S₁₈₀的生长，同时明显提高荷瘤小鼠的免疫功能，提高荷瘤小鼠血清溶血素HC_IgM的含量和巨噬细胞吞噬能力与迟发型超敏反应强度。提示菜籽低聚肽的体内抗移植性肿瘤的活性是通过增强机体的免疫功能来实现的。另外菜籽低聚肽可使荷瘤小鼠血清中的SOD值升高，MDA值降低，说明低聚肽抗肿瘤活性还与其抗氧化活性有关。

与本实验室以前获得的菜籽肽对肿瘤活性[2] [3] 相比较，菜籽低聚肽具有更为明显的抑制肿瘤的生物活性，为菜籽低聚肽的开发利用，并为我们更广泛地利用菜籽蛋白提供了一个新的思路。

参考文献 (References)

NOTES

^*通讯作者。