Botanical Research
Vol.05 No.04(2016), Article ID:18050,7 pages
10.12677/BR.2016.54018

Knockout Vector Construction of Tobacco Vacuolar pH-Related NtPH1 Gene by Plant CRISPR/Cas9 System

Jiamin Li, Min Wang, Kun Ma, Xiaoyu Hong, Chaojun Cui, Junyu Chen, Qinlong Zhu

College of Life Sciences, South China Agricultural University, Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology of Guangdong Province, Guangzhou Guangdong

Received: Jul. 1st, 2016; accepted: Jul. 19th, 2016; published: Jul. 25th, 2016

Copyright © 2016 by authors and Hans Publishers Inc.

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ABSTRACT

The alkaline pH level of plant vacuoles is an important factor for coloration of blue flowers. Tobacco NtPH1 gene is an orthologous gene of PhPH1 that controls the vacuolar pH in petunia petals. To study the function of NtPH1 gene, we constructed a knockout vector with two target sites of NtPH1 gene using plant CRISPR/Cas9 System. The two target sequences in NtPH1 genomic DNA are a 60 bp apart. PCR amplified the small nuclear RNA promoters (AtU6-26 and AtU6-29) and two sgRNAs, respectively. For each sgRNA cassette, the overlapping sequence between promoter and sgRNA was the target sequence of 20 bp. The overlapping PCR was completed to in vitro splice the two sgRNA cassettes. Then the two sgRNA cassettes were cloned into pYLCRISPR/Cas9Pubi-H vector by Golden Gate cloning. After positive colony PCR, restriction enzyme digestion and further sequencing, the knockout vector, pCas9-PH1T1T2, was successfully constructed. This work laid a foundation for further study on the function of NtPH1 gene, and future application of this gene in genetic engineering of blue flowers.

Keywords:Tobacco, Vacuolar pH, NtPH1, CRISPR/Cas9 System, Vector Construction

烟草液泡pH相关基因NtPH1的CRISPR/Cas9敲除载体的构建

李嘉敏,汪敏,马坤,洪晓喻,崔超军,陈君宇,祝钦泷

华南农业大学生命科学学院,广东省植物功能基因组与生物技术重点实验室,广东 广州

收稿日期:2016年7月1日;录用日期:2016年7月19日;发布日期:2016年7月25日

摘 要

植物液泡pH的碱性程度是蓝色花形成的一个重要因素。烟草NtPH1是矮牵牛蓝色花形成相关的控制液泡pH的PhPH1基因的直系同源基因。为了研究其功能,本研究利用植物CRISPR/Cas9系统构建NtPH1的双靶点敲除载体。通过对NtPH1基因片段的序列分析,选择两个PAM序列相距60 bp的位点作为靶序列,通过重叠PCR直接把两个靶位点分别拼接到AtU6-29和AtU6-26两个启动子驱动的sgRNA表达盒上,再利用Golden Gate克隆的方法把其连入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体,重组克隆经菌落PCR筛选、质粒DNA酶切鉴定与测序,获得了NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2。这为进一步开展NtPH1基因的功能研究与蓝色花的基因工程应用奠定了基础。

关键词 :烟草,液泡pH,NtPH1,CRISPR/Cas9系统,载体构建

1. 引言

观赏植物的花色是其最重要的商品性状之一。花的呈色除花青素苷本身的性质与种类外,还受到花瓣液泡的pH值、助色素的含量以及金属离子的络合作用等因素共同影响 [1] 。尽管自然界的花卉色彩丰富,但却普遍缺少蓝色系的花,蓝色花的基因工程研究一直是近年来的研究热点。蓝色花的产生,首先需要蓝色基因F3′5′H (类黄酮-3′, 5′-羟基化酶)的存在,其直接催化产生蓝色花的主要呈色物质——飞燕草素苷(delphinin)及其衍生物 [2] 。其次,随着液泡pH逐渐升高可使花青素苷呈色由红向蓝转变,偏碱性的液泡pH是蓝色呈现所必需的 [3] ,如花瓣中含有飞燕草素苷的天竺葵(Pelargonium hortorum)和凤仙花(Impatiens balsamina),由于液泡pH偏酸而无法显现蓝色 [3] 。

目前关于蓝色基因F3′5′H的克隆和功能研究已有很多报道 [4] ,而关于液泡pH的调控研究却很少。矮牵牛PhPH5编码P3A-ATPase的质子泵,其突变直接导致花瓣液泡酸化程度降低,从而使花朵变为蓝色 [5] 。矮牵牛PhPH1编码P3B-ATPase,其自身无H+转运的活性,通过与PH5形成复合体共同作用调控矮牵牛花瓣液泡酸化,最终决定花朵呈色,其突变导致该复合体不能正常工作,而使花瓣显示蓝色 [6] 。

CRISPR/Cas9系统是通过sgRNA介导对靶位点进行定位并利用Cas核酸酶对核酸实现双链断裂(double-strand break, DSB)来实现基因组定点编辑,作为一种新兴的技术已比较成熟,被广泛用于植物功能基因组研究中 [7] 。本实验室的Ma等已成功开发了一套简单、高效和能实现多靶点编辑的植物CRISPR/Cas9载体系统 [8] ,该系统利用重叠PCR方法在体外直接拼接不同靶位点sgRNA的表达盒,然后再用Golden Gate克隆 [9] 或Gibsion克隆 [10] 的方法把多个sgRNA表达盒一步组装到含Cas9表达盒的植物双元载体中。利用该系统已经成功在水稻、拟南芥、杨树等中实现了准确的基因组编辑 [8] [11] 。

烟草NtPH1是同为茄科的矮牵牛PhPH1基因的直系同源基因,两者具有高度的序列一致性,推测具有与PhPH1相似的功能。本研究利用植物CRISPR/Cas9系统成功构建了NtPH1的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2,为进一步开展NtPH1基因的功能研究,以及利用其进行蓝色花的基因工程操作奠定了基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料、菌株与试剂

含Cas9表达盒的双元表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,含sgRNA表达盒载体质粒pYLsgRNA- AtU6-26和pYLsgRNA-AtU6-29,均由本实验室构建和保存。大肠杆菌菌株E. coli DH10B由实验室保存。

高保真DNA聚合酶KOD FX购于TOYOBO;T4 DNA连接酶、限制性内切酶均购于NEB;DNA胶回收试剂盒购于TAKARA;其它试剂均为国产和分析纯。

2.2. 靶位点选择

选择NtPH1第7外显子正义或反义链设计两个20 bp碱基靶序列,两个靶序列PAM序列(NGG)间间隔约60 bp,GC%含量50%~60%,G/C分布均匀。

2.3. 靶位点sgRNA表达盒的体外拼接

以质粒pYLsgRNA-AtU6-26为模板,通用引物UF(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)与特异引物R-T1 (5’-ctggatgacgcgattatggcaatcactacttcgactctagc-3’,下划线为靶序列T1),扩增约470 bp左右的AtU6-26启动子,引物F-T1(5’-ccataatcgcgtcatccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’,下划线为靶序列T1)与通用引物gR-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)扩增约136 bp的gRNA序列,上述PCR产物各取0.2 µL和0.1 µL混合后,用Bsa I位点的通用引物Pps-R (5’-TTCAGAggtctcTACCGACTAGTATGGAAT CGGCAGCAAAGG-3’,下划线为Bsa I位点)和Pgs-2 (5’-AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCA AGCTC-3’,下划线为Bsa I位点)进行重叠PCR扩增,获得靶点T1的sgRNA表达盒。

以质粒pYLsgRNA-AtU6-29为模板,通用引物UF与特异引物R-T2 (5’-cttcgagggcttaaacttgtcaatca ctacttcgactctagc-3’,下划线为靶序列T2),扩增约400 bp左右的AtU6-29启动子,引物F-T2 (5’-acaa gtttaagccctcgaagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’,下划线为靶序列T2)与通用引物gR-R扩增约136 bp的gRNA序列,上述PCR产物各取0.2 µL和0.1 µL混合后,用Bsa I位点的通用引物Pps-2和Pgs-L进行重叠PCR扩增,获得靶点T2的sgRNA表达盒。PCR扩增体系和条件按照KOD FX推荐进行。

2.4. 双元载体上两个靶位点sgRNA表达盒的Golden Gate法组装

由于Bsa I位点切开后,再连上形成的新位点已不能被Bsa I切割,因此直接把双元载体质粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-H与T1和T2的sgRNA表达盒,直接混合后,加入Bsa I内切酶和T4 DNA连接酶,同时进行酶切连接。15 µL反应体系为:1 µL 10 x CutSmart buffer,80 ng pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒,ATP (终浓度1.0 mM),T1,T2 sgRNA表达盒各30 ng,10 U Bsa I内切酶,40 U T4 DNA连接酶,不足的用水补足。反应条件:在可调温度的热板或PCR仪上,先3个循环(37℃ 10 min,10℃ 5 min,20℃ 5 min),再进行10个循环(37℃ 3 min,10℃ 5 min,20℃ 5 min)。反应产物透析后直接电击DH10B,用靶点特异引物T1 (5’-ccataatcgcgtcatccag-3’)和T2 (5’-cttcgagggcttaaacttgt-3’)筛选阳性克隆,最后提质粒用Spe I酶切检测,测序最终确定。整个载体构建的流程如图1

3. 结果与分析

3.1. 靶位点序列的确定

根据NtPH1第7外显子序列,分别搜索PAM序列NGG,或其互补链的CCN,并且靶位点GC%含量在45%~60%之间,最终确定两个靶位点序列T1和T2 (图2),其中T1是CCN的互补链,距离T2位点的PAM约有60 bp左右。

Figure 1. Schematic diagram for construction of plant CRISPR/Cas9 vector system: (a) Golden Gate cloning using IIS class Bsa I; (b) in vitro splicing of different sgRNAs and one-step Golden Gate cloning

图1. 植物CRISPR/Cas9双靶点敲除载体构建示意图:(a) 利用IIS型限制性内切酶Bsa I的Golden Gate克隆原理;(b) 不同sgRNA表达盒的体外拼接和利用Golden Gate克隆方法一步连入双元表达载体中

Figure 2. The location and characterization of two target sequences

图2. 靶序列位置与特征

3.2. sgRNA表达盒直接拼接

用通用引物UF与特异引物R-T1,扩增pYLsgRNA-AtU6-26质粒,获得预期约470 bp左右的AtU6-26启动子,引物F-T1与通用引物gR-R扩增获得预期约136 bp的gRNA序列(图3(a))。上述PCR产物混合后,通用引物Pps-R和Pgs-2进行重叠PCR扩增,获得预期600 bp左右的T1 sgRNA表达盒(图3(b))。

用通用引物UF与特异引物R-T2,扩增pYLsgRNA-AtU6-29质粒,获得预期约400 bp左右的AtU6-29启动子,引物F-T2与通用引物gR-R扩增获得预期约136 bp的gRNA序列(图3(a))。上述PCR产物混合后,通用引物Pps-2和Pgs-L进行重叠PCR扩增,获得预期530 bp左右T2 sgRNA表达盒(图3(b))。

3.3. NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2构建

Golden Gate克隆法就是利用限制性内切酶IIS这类酶,如Bsa I,其识别位点与切割位点是分离的,别且能产生4个任意碱基的突出末端,其酶切连接产物能够实现无缝连接,和产生新的不被Bsa I识别的位点,是一种广泛使用的方法。把pYLCRISPR/Cas9Pubi-H与T1和T2的sgRNA表达盒纯化产物混合后,边切边连,产物转化大肠杆菌DH10B后,随机挑选12个重组克隆,用靶点特异引物T1/T2进行PCR筛选,结果显示,12个克隆都能扩出预期大小的带(图4),说明这种方法具有较高的连接效率。

进一步提取PCR阳性克隆的质粒,用Spe I酶切后,产生预期1.2 kb大小的两个sgRNA表达盒的连接带(图5),最后测序确定,表明NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2已被成功构建。

(a) (b)

Figure 3. In vitro splicing of sgRNA cassette: (a) PCR amplifying promoters and sgRNAs; (b) Overlapping PCR products of sgRNA cassettes

图3. sgRNA表达盒体外重叠PCR拼接:(a) 含靶序列重叠区的启动子和sgRNA PCR产物;(b) sgRNA表达盒拼接PCR

Figure 4. The colony-screening PCR of pCas9-PH1T1T2 vector

图4. pCas9-PH1T1T2载体的菌落PCR筛选

Figure 5. Restriciton enzyme analysis of pCas9-PH1T1T2 vector

图5. pCas9-PH1T1T2载体的酶切鉴定

4. 讨论

植物基因功能研究,采用的方法主要是超量表达和RNAi干涉的方法。其中,由于RNAi是转录后水平的调控,其对目标基因转录的抑制作用差异较大、特异性较差,效果也不理想 [8] 。而CRISPR/Cas9系统能够实现以往难以做到的基因组定点编辑,能够实现基因组水平上的目标基因的准确敲出,直接获得突变体。作为一种新兴的基因组定点编辑技术,CRISPR/Cas9系统已广泛应用于植物基因功能的研究中 [7] 。

本研究所使用的植物CRISPR/Cas9基因编辑载体系统,与目前的一些植物编辑载体系统相比,具有更大的优势和特点。如与Zhou等的系 [12] 统相比,我们的这套载体系统具有更加简单、快速高效的特点,不同靶位点的sgRNA表达盒,是体外拼接的,无需进行一次体内转化,多个sgRNA表达盒能够通过Golden Gate克隆或Gibsion克隆的方法,一步组装到双元载体上,只需要一次转化大肠杆菌感受态,就能实现多基因多靶点的载体构建。由于sgRNA对靶位点的结合能力会影响编辑效率,所以在选择靶位点时要尽量提高靶序列的GC含量(一般50%~60%),避免与sgRNA形成二级结构 [8] 。靶位点的选择,除了正义链上的NGG外,还可以考虑正义链上CCN (对应反义链上的NGG),并且双靶点之间如果间隔几十个碱基,则这两个靶位点间的序列被删除突变的几率更大。

蓝色花的形成除了需要蓝色基因F3′5′H外,花瓣液泡pH的偏碱性也是一个重要的条件 [3] [5] [6] 。烟草NtPH1基因是同为茄科的矮牵牛PhPH1基因 [6] 的直系同源基因,可能具有相似的对液泡pH的调控作用,对于其功能的研究也尚未报道。本研究已成功构建了NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2,下一步将利用农杆菌介导的叶盘转化法,转化入烟草中,研究其对液泡pH的调控作用,为蓝色花基因工程研究打下基础。

5. 结论

利用本实验室开发的高效CRISPR/Cas9系统,成功构建了烟草NtPH1基因的双靶点基因组敲除载体,为进一步研究其功能奠定了基础。

基因项目

国家级大学生创新创业训练计划项目(201610564006);广东省公益研究与能力建设项目(2016A020210084)。

文章引用

李嘉敏,汪敏,马坤,洪晓喻,崔超军,陈君宇,祝钦泷. 烟草液泡pH相关基因NtPH1的CRISPR/Cas9敲除载体的构建
Knockout Vector Construction of Tobacco Vacuolar pH-Related NtPH1 Gene by Plant CRISPR/Cas9 System[J]. 植物学研究, 2016, 05(04): 132-138. http://dx.doi.org/10.12677/BR.2016.54018

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