重庆工贸职业技术学院，重庆

收稿日期：2022年2月1日；录用日期：2022年2月19日；发布日期：2022年3月3日

摘要

目的：研究豆腐柴叶汁混合乳酸菌发酵保健饮料。方法：以豆腐柴叶为主要原料，用嗜热链球菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为混合菌种，采用单因素试验和五因素四水平正交试验，以产酸量和乳酸活菌数为指标，确定最终发酵菌种和发酵液及发酵饮料口感调配的最佳配方。结果：用嗜热链球菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌按1:1:1比例作为混合菌种；发酵液最佳配方为豆腐柴料水比1:8 (g/mL)，脱脂乳5%，种子液接种量2%，发酵温度41℃ ± 1℃，发酵时间24 h；饮料调配最佳配方：蔗糖4%，柠檬酸0.04%，CMC 0.2%，黄原胶0.03%。

关键词

豆腐柴汁，乳酸菌，保健饮料，工艺，研究

Research on Workmanship of Premna microphylla Turcz. Juice Mixed with Lactic Acid Bacteria Health Drink

Anshu Xu, Yanling Wang

Chongqing Industry & Trade Polytechnic, Chongqing

Received: Feb. 1^st, 2022; accepted: Feb. 19^th, 2022; published: Mar. 3^rd, 2022

ABSTRACT

Objective: The object is to study the health beverage fermented by Premna microphylla Turcz. juice mixed with lactic acid bacteria. Methods: Taking Premna microphylla Turcz. leaves as the main raw material, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus as the mixed strains, single factor test and five factor four level orthogonal test were used to determine the best formula for the final fermentation strains, fermentation broth and the taste of fermented beverages with the acid production and the number of live lactic acid bacteria as the index. Results: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus were used as mixed strains in the ratio of 1:1:1. The optimum formula of fermentation broth was Premna microphylla Turcz. to water ratio of 1:8 (g/mL), 5% skimmed milk, 2% seed liquid inoculation amount, 41˚C ± 1˚C fermentation temperature and 24 hours fermentation time. The best formula for beverage is 4% sucrose, 0.04% citric acid, 0.2% CMC and 0.03% xanthan gum.

Keywords:Premna microphylla Turcz. Juice, Lactobacillus, Health Drink, Workmanship, Research

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

豆腐柴(Premna microphylla Turcz.)是马鞭草科豆腐柴属植物，其叶片含有丰富的营养成分和药用成分，包括氨基酸、碳水化合物、膳食纤维、可溶性糖、维生C、β胡萝卜素、果胶等 [1]。豆腐柴叶中果胶含量尤为丰富，其含量可高达20%~30%；其次蛋白质含量为18.7%，粗脂肪含量4.27%等。野生豆腐柴每100 g鲜叶中含21.8 mg的β-胡萝卜素和361.5 mg的维生素C (Vitamin C, Vc)。由于豆腐柴含有丰富的蛋白质和氨基酸及维生素以及抗氧化因子等特点，是一种难得的药食两用植物 [2] [3]。豆腐柴含有人体所需氨基酸，具有较高的药用食用价值 [4]。豆腐柴根的提取物可促进刀豆蛋白(ConA)诱导T淋巴细胞的增殖反应，野生豆腐柴中总黄酮含量较高 [5] [6]。尽管目前对豆腐柴利用研究很多 [7]，尤其是制成豆腐，俗称“观音豆腐”或“树叶豆腐”，是安徽省，浙江省和四川江油一带的特色小吃 [8]。但作为乳酸保健饮料的研究颇少。笔者利用豆腐柴汁为主要原料，三种乳酸菌为混合菌种，进行乳酸菌发酵，制成的乳酸菌发酵饮料。具有促进胃肠蠕动，调节体内微生态平衡，消除致癌因子、提高机体免疫力等保健功能 [9] [10]。涪陵区适合发展豆腐柴 [11]，利用豆腐柴为原料做乳酸菌饮料成本低，易于投产。

2. 材料与方法

2.1. 主要材料与试剂

2.1.1. 培养基及菌种

培养基：MRS培养基(市售)

菌种：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)简写La；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)简写Lp；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)简写St (菌种购买于中国食品发酵工业研究院)。

2.1.2. 材料

涪陵地产豆腐柴、食用级蔗糖和葡萄糖、脱脂奶粉(市售)。

2.1.3. 药品与试剂

碳酸钠、氢氧化钠、pH缓冲液(邻苯二甲酸氢钾)、柠檬酸、维生素C、氯化钠、纤维素酶10,000 u/g (罗恩试剂)、CMC-Na (食品级–河南华悦化工产品有限公司)、果胶酶3000 u/g (山东西北化学服务有限公司)、黄原胶(食品级–淄博中轩生化有限公司)。

2.2. 主要仪器与设备

SW-CJ-1FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)、SPX-300B型生化培养箱(上海跃进医疗器械厂)、HG72-1恒温干燥箱(北京市朝阳区来广营医疗器械厂)、GYB60-6S高压均质机(上海东华高压均质机厂)、2WZSH型阿贝折射仪(上海光学仪器厂)、飞利浦HR1871榨汁机、HH-1数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)等。

2.3. 方法

2.3.1. 豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料的工艺流程

菌种→活化→驯化→扩大培养→母发酵剂

↓

豆腐柴汁制备→调pH 6.3→杀菌(100℃10 min)→冷却至40℃接种→发酵→加入已杀菌的糖、柠檬酸、稳定剂(CMC-Na + 黄原胶)→均质(30 MPa)→杀菌(100℃10 min)→无菌灌装→产品

2.3.2. 豆腐柴汁制备

鲜叶称量→清洗→90℃~100℃漂烫1 min→冷却→加水(1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10) (g/mL) (不同季节采摘的鲜叶含水量不同) [12] →加质量分数0.04%Na₂CO₃和0.2 mol/L抗坏血酸混合液→打浆5 min (20℃~30℃、1000~3000 r/min)→四层纱布过滤→豆腐柴浆液 [13] →无水Na₂CO₃调pH 6.3→0.5%果胶酶 + 0.5%纤维素酶保温液化酶解60 min (50℃、150 r/min)→杀菌1 min (90℃~100℃)→冷至40℃→四层纱布过滤→静置→取上清液备用。

2.3.3. 菌种活化和驯化

用灭菌并冷却的10%脱脂乳(NFM)活化安瓿管里的冻干粉St (43℃培养24 h~48 h，传代3~4次)，放置冰箱备用 [14]。用同样的方法将Lp、La冻干粉用MRS液体培养基活化菌种，放置1℃~5℃冰箱备用 [15] [16]。

St、Lp和La的生长繁殖对营养素要求较高，豆腐柴汁虽然含有丰富蛋白质，仍需进行浓度梯度驯化，使其逐渐适应豆腐柴汁的生长环境 [17]。将活化后的三株单菌株和St:Lp、St:La、Lp:La、St:Lp:La四个混合菌株(V/V)分别接种在脱脂乳和豆腐柴汁比例为9:1的培养基中培养(42℃, 24 h)，测定其乳酸菌数达到1.0 × 10⁷ CFU/mL以上，同样方法8:2、7:3……1:9、纯豆腐柴汁培养。每次培养后均测定其乳酸菌数达到要求，反复多次，至产酸较快(24 h内分3个时段测定其pH值)生长良好为止。将驯化后的菌株分别用纯豆腐柴汁接种量10%~20% (V/V)进行扩大培养，同样方法测定乳酸菌数达到要求后作为母发酵剂放置1℃~5℃冰箱备用 [18]。

2.3.4. 单因素试验

1) 豆腐柴汁筛选

将备用豆腐柴汁分别接种驯化后的三株单一菌株和四组混合菌株母发酵剂，接种量5%，41℃恒温发酵24 h，测pH和产酸量(酸碱滴定法)及乳酸活菌数(MRS平板计数法)。筛选出产酸量和乳酸活菌数均较高的豆腐柴汁备用 [19]。

2) 菌种筛选

选择产酸量高，适应性强不易变异菌株是决定发酵成功的关键之一 [20] [21]。将备用的豆腐柴汁杀菌冷却后分别接种扩大培养的3株单一菌株和4种组合的混合乳酸菌进行筛选，接种量5%，43℃，24 h后测pH值、酸度和乳酸活菌数。以产酸较好，活菌数高、感官最好的菌种进行试验。

3) 种子液的筛选

用L₉(3⁴)正交试验筛选出最佳种子液配方，检测指标是乳酸菌数。见表1。

表1. 豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料种子液因素水平表

2.3.5. 发酵液筛选

选用L₁₆(4⁵)正交试验筛选，以产生乳酸量为检测指标 [22]。A料水比(g/mL)、B脱脂乳添加量(g/100mL)、C接种量(%)、D发酵温度(℃)、E发酵时间(h)。见表2。

表2. 豆腐柴汁乳酸菌发酵饮料发酵液因素水平表

2.3.6. 发酵饮料口感调配试验

选用L₉(3⁴)正交试验，以口感打分评比，其评价标准见表3。豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料口感调配试验正交因素水平见表4。

表3. 豆腐柴汁乳酸菌饮料口感调配评分标准

表4. 豆腐柴汁乳酸菌饮料口感调配试验因素水平表(g/100mL)

2.3.7. 成品质量测定

感官(色泽、香气和口感)、乳酸菌数(MRS平板计数法)、乳酸含量(GB5009.157-2016)、酸度(GB/T12456-90)酸碱滴定法、pH值(酸度计)、可溶性固形物(阿贝折光仪)。

2.4. 统计方法

将每次试验重复4次，结果三次平行取样，取均值，数据以平均值±标准差表示。实验数据用方差分析进行处理。

3. 结果与分析

3.1. 豆腐柴汁筛选

通过乳酸菌发酵试验筛选出最佳豆腐柴汁料水比，做重复试验，筛选出产酸较好，活菌数高、感官较好的豆腐柴汁。选择St:Lp:La混合菌种发酵，结果见表5。

表5. 不同料水比的豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料的pH及乳酸活菌数结果

由表5得知：产酸较好，活菌数高、感官最好的豆腐柴汁料水比为1:6、1:7、1:8。因为料水比过小如1:5 (g/mL)，滤汁过稠，难以过滤，产生气泡悬浮于滤汁中，影响酶解和乳酸菌生长；料液比例大如1:10 (g/mL)以上，滤汁过稀，营养成分减少，乳酸菌生长不良。

3.2. 菌株筛选

选取豆腐柴汁(料水比1:7 (g/mL))，分别接种经驯化后三株单一菌株和四组混合菌株母发酵剂进行发酵试验，测定pH、酸度及乳酸活菌数，结果见表6。

表6. 豆腐柴汁乳酸发酵菌株筛选结果

^*酸度以乳酸计%。

由表6得知：使用多种混合菌种发酵的产酸量显著高于单一菌种发酵后的产酸量，发酵汁酸甜爽口，口感纯正无异味，而单一菌种发酵后产酸量低，口感差，香味淡，豆腐柴味太浓。

为了准确选出发酵用最适宜的菌株，我们对四个组合的混合菌株做了重复试验，结果显示：混合菌株St:Lp:La (1:1:1)的各项指标优势最明显，发酵汁口感较其它几个均好，酸味纯正，无生青涩味，具有豆腐柴固有特殊气味，又具有乳香香味。用于食品发酵的乳酸菌较多，由于球菌和杆菌的共生作用，使用混合菌发酵明显优于单一菌种发酵 [23]。

3.3. 筛选最佳种子液

选择L₉(3⁴)正交试验，无误差列。将每次实验重复3次，取均值。豆腐柴汁灭菌冷却后接种，42℃，24 h后测定乳酸菌数，结果见表7。

表7. 豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料最佳种子液筛选结果表

由表7可见，9号样在试验过程中乳酸菌数最高。其配方为A₃B₃C₂D₁。方差分析也是A₃B₃C₂D₁。即豆腐柴叶汁混合乳酸菌发酵种子液：豆腐柴料水比1:8 (g/mL)，葡萄糖8%，脱脂乳4%，接种量3%，发酵温度42℃，发酵时间24 h；从极差分析中可看到，影响试验的四因素的大小顺序是B > A > D > C。

3.4. 最佳发酵液筛选

选用L₁₆(4⁵)正交试验，因素水平填入正交表1中，无误差列。每次试验重复4次，取均值，结果见表8。

表8. 豆腐柴汁乳酸菌发酵饮料发酵液正交表

由表8得知，11号和16号样品在试验过程中乳酸量较高，其配方为A₃B₃C₁D₂E₄和A₄B₄C₁D₃E₂，根据方差分析可得知优水平另一配方A₂B₃C₁D₃E₄，从极差分析中可见，影响试验的五因素的大小顺序是D > B > E > A > C。为了得到最佳工艺配方，将此3个配方作重复试验，结果见表9。

表9. 豆腐柴汁乳酸菌饮料发酵液的重复试验

由表9得知，11号样产酸量最高，感官品质最好，因此选择11号样为最佳配方，即A₃B₃C₁D₂E₄，即豆腐柴汁乳酸菌饮料发酵液最佳配方和参数为料水比1:8 (g/mL)，脱脂乳5%，混合菌株St:Lp:La (1:1:1)，种子液接种量2%，发酵温度41℃，发酵时间24 h。

3.5. 筛选饮料口感配方

选用L₉(3⁴)正交试验筛选最佳豆腐柴汁乳酸菌发酵液口感配方。按照表4设计正交试验表，添加蔗糖、柠檬酸、稳定剂。结果见表10。

表10. 豆腐柴汁乳酸菌饮料口感调配正交试验表

组织10个人对试验结果进行打分，其评价标准见表3，取平均值。其结果如下：表10中，2号、5号和8号调配得分较高，2号配方为A₁B₂C₂，5号配方为A₂B₂C₃，8号配方为A₃B₂C₁，根据方差分析可得到另一优水平配方(K号) A₃B₂C₁。为了得到最佳配方将这四个配方做重复试验，结果见表11。从极差分析中可见，影响试验的四因素的大小顺序是B > A > D > C。

表11. 豆腐柴汁乳酸菌发酵饮料口感调配重复试验

由表11得知，通过重复试验，2号配方得分最高，即在发酵液中添加蔗糖4%，柠檬酸0.04%，CMC-Na 0.2%，黄原胶0.03%。用40 MPa均质后杀菌得到产品。

3.6. 豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料成品质量测定 [24]

3.6.1. 感官(色泽、香气、口感)

黄绿色，具有豆腐柴特殊香味，滋味酸甜、爽口。

3.6.2. 乳酸菌数测定

采用MRS平板计数法，乳酸菌数都在1.00 × 10¹⁰ cfu/mL(平均值)以上。

3.6.3. 酸度测定

饮料装瓶前乳酸含量是0.61% (均值)，观察2个月后，乳酸含量是1.09% (均值)。

3.6.4. pH值

装瓶前3.45，观察2个月后3.54。

3.6.5. 可溶性固形物测定

饮料装瓶前12.7%，观察2个月后8.9%。

本实验产品为豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料，要求保质期内不发生分层、沉淀现象，通过添加稳定剂然后均质来提高饮料的稳定性 [25]。

4. 结论

以豆腐柴叶为主要原料生产保健饮料，充分利用野生资源，原料易得，成本低。实验结果用三种混合乳酸菌按1:1:1比例混合，对豆腐柴汁进行发酵。先用脱脂乳对菌种活化后再用脱脂乳与豆腐柴汁混合逐级驯化，最后用纯豆腐柴汁取代脱脂乳。每次驯化后测定的乳酸活菌数至少在1.00 × 10⁷ cfu/m以上。发酵液最佳配方为：豆腐柴汁料水比1:8 (g/mL)，脱脂乳5%，种子液接种量2%，发酵温度41℃ ± 1℃，发酵时间24 h。在发酵液中加入蔗糖和柠檬酸，使其酸甜适中，口感较好。最佳配方为蔗糖4%，柠檬酸0.04%，CMC-Na 0.2%，黄原胶0.03%。

由于豆腐柴营养成分丰富，既可作为功能食品开发，又可作药用成分原料，具有极大的开发利用价值。结合乳酸菌发酵饮料的优越性，本实验研究最后产品是豆腐柴汁杀菌型乳酸菌保健饮料，笔者想可否制成另一种活菌型豆腐柴汁混合乳酸菌发酵饮料。根据酸性饮料常识要求，活菌型饮料对包装和存放条件有严格要求，货架期短，在4℃低温条件下可保存至少1个月品质保持不变。因此活菌型乳酸菌发酵饮料对稳定剂的选择及工艺条件要求更高，这也是我以后进一步深入对豆腐柴的研究方向。

致谢

本项目得到重庆重庆市教育委员会2021年科学技术研究项目青年项目资金支持，重庆市涪陵区科技局2020年农业与社会事业领域资金大力支持，除了感谢以上两个单位以外，另外十分感谢重庆工贸职业技术学院给予本项目资金大力支持，感谢重庆工贸职业技术学院科研处和账务处的同志们，也感谢本项目组其它成员的辛勤劳作，谢谢！

基金项目

1) 重庆市教委2021年度科学技术研究计划青年项目–渝教科函[2021] 27号(KJQN202103605)；2) 重庆市涪陵区科技局2020年农业与社会事业领域科研项目(FLKJ, 2020ABB2015)。

文章引用

徐安书,王艳领. 豆腐柴汁混合乳酸菌保健饮料的研究工艺
Research on Workmanship of Premna microphylla Turcz. Juice Mixed with Lactic Acid Bacteria Health Drink[J]. 微生物前沿, 2022, 11(01): 11-21. https://doi.org/10.12677/AMB.2022.111002

参考文献