¹厦门大学物理系，生物仿生及软物质研究院，福建省柔性功能材料重点实验室，福建 厦门

²国科温州研究院，生物医学物理中心，浙江 温州

³瓯江实验室，浙江 温州

收稿日期：2022年4月7日；录用日期：2022年5月11日；发布日期：2022年5月18日

摘要

酰基磷酸酶(Acylphosphatase, AcP)是最小的基于蛋白质的生物酶之一，包含98个氨基酸残基，其天然构象由两个α螺旋和一个五链反平行的β折叠组成。AcP可以催化羧基–磷酸键的水解，在生物体代谢方面发挥着重要的生理作用。AcP是一种典型的两态折叠蛋白，它具有体积小、拓扑结构简单、分子内不存在二硫键的特点，是研究蛋白质折叠/去折叠机制的模型蛋白之一。在单分子力谱研究方面，人们已经用原子力显微镜研究了AcP的力学性能和去折叠行为。在本文中，基于稳定的磁镊单分子技术，我们测量了AcP在不同拉力下的去折叠速率。首先，我们构建了具有两种指纹信号(I27, SpyCatcher-SpyTag)的重组蛋白用于单分子操纵实验，然后通过拉力–伸长曲线中的特征确认正确的AcP去折叠信号，接下来开展了AcP在不同加载速率下的拉伸实验和恒定力下的拉伸实验。我们得到了AcP在20 pN到40 pN拉力区间内的去折叠速率，并分析了实验结果与原子力显微镜实验结果差异的原因与意义，结果暗示去折叠过渡态在不同拉力下会发生变化。

关键词

磁镊，去折叠，过渡态，酰基磷酸酶

Single Molecule Magnetic Tweezers Study of Unfolding Kinetics of Acylphosphatase

Xuening Ma¹, Haiyan Hong¹, Hao Sun^1,2,3, Hu Chen^1,2,3

¹Fujian Provincial Key Laboratory for Soft Functional Materials Research, Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Department of Physics, Xiamen University, Xiamen Fujian

²Center of Biomedical Physics, Wenzhou Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Wenzhou Zhejiang

³Oujiang Laboratory, Wenzhou Zhejiang

Received: Apr. 7^th, 2022; accepted: May 11^th, 2022; published: May 18^th, 2022

ABSTRACT

Acylphosphatase (AcP) containing 98 amino acid residues is one of the smallest globular enzymes. AcP can catalyze the hydrolysis of carboxyl-phosphate bonds and plays an important physiological role in the metabolic system of living organisms. The native state of AcP consists of two α helices and a five-stranded anti-parallel β sheet. AcP is a typical two-state protein, which has the characteristics of small size, simple topology and no disulfide bond in the molecule, which make it a model protein for studying the mechanism of protein folding/unfolding. The mechanical properties and unfolding behavior of AcP have been studied by atomic force microscopy (AFM). In this paper, based on the stable magnetic tweezers, we measured the unfolding rate of AcP at different constant stretching forces. Firstly, a recombinant protein construct with two kinds of fingerprint signals from I27 and SpyCatcher-SpyTag was produced for single-molecule manipulation experiment. The correct unfolding signal of AcP was identified through the fingerprint singles in the force-extension curve. Then we carried out stretching experiments of AcP at different loading rates and constant forces to obtain the unfolding rates of AcP from 20 pN to 40 pN. The difference between our results and the previous AFM experiment was discussed, and the result indicates that the unfolding transition state will change with force.

Keywords:Magnetic Tweezers, Unfolding, Transition State, Acylphosphatase

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

在细胞和有机体的生命活动中，蛋白质发挥着关键的结构和功能作用。最初氨基酸残基通过肽键共价连接形成非结构化的多肽链，随后多肽链进行构象搜索，从非结构化的无规线团构象折叠成为具有独特三维构象的天然结构，这是每种蛋白质具有特定功能的关键。蛋白质折叠产生各种高度特异性的结构，使细胞和有机体能够在生命活动中发展出多样性和选择性。蛋白质的氨基酸序列如何决定其三维结构引发了广泛关注，是结构生物学中的核心问题之一 [1]。

在蛋白质的折叠过程中，主要通过形成多个非共价键来补偿多肽链构象熵的减少，蛋白质的折叠态通过弱的非共价的分子内相互作用来稳定其三维结构。不同蛋白质需要的折叠时间不同，大多数在几微秒到几分钟内发生 [2]。蛋白质折叠的能量景观呈漏斗状，但并非光滑的，由于存在许多蛋白质可以暂时停留的陷阱，所以形成了崎岖不平的能量景观。初始的随机卷曲构象位于漏斗顶部，天然状态位于全局自由能最小值的漏斗底部，具有部分紧凑结构的中间体存在于局部自由能最小的陷阱处 [3]。

最初研究蛋白质折叠和去折叠的主要方法是生化体实验，通过控制温度、溶液的pH以及引入不同浓度的变性剂诱导蛋白质变性，最常用的变性剂是盐酸胍和尿素，通过改变其浓度，大多数蛋白质发生去折叠–折叠转变 [4] [5] [6]，然后可以利用光谱、质谱或核磁共振等方法对折叠/去折叠速率进行定量表征。在生化体实验中，每个蛋白质分子处于折叠–去折叠转变中的不同状态，然而其测量结果只能表征大量蛋白质所表现出的平均性质，这会掩盖单个蛋白质分子行为的复杂性，难以测量到瞬时中间态，会导致重要信息的丢失。

后来兴起的单分子操纵技术，包括原子力显微镜、光镊和磁镊，能有效克服生化体实验的局限性 [7] [8] [9]。三者都可以通过操纵单个分子获得拉力–伸长曲线，进而阐述有关的分子折叠/去折叠的机制。光镊操作灵活，但高强度的激光会加热介质小球，而溶液中不均匀的温度会对生物分子产生不同程度的影响，因此光镊一般用来施加30 pN以下的拉力。原子力显微镜利用微悬臂梁对所研究的分子进行拉伸，由于其较高的硬度，原子力显微镜难以对小于10 pN的力进行精确测量，并且测量时间受到机械漂移的影响。磁镊具有优异的稳定性，可以开展力渐变的实验，也可以进行恒定力测量或长时间的平衡态测量。此外，磁镊拉伸实验中，生物分子不会受到光损伤和热损伤，可实现长期、稳定地测量 [10] [11]。

酰基磷酸酶(Acylphosphatase, AcP)有98个氨基酸残基，是最小的球状蛋白生物酶之一。AcP广泛性存在于脊椎动物的细胞质中，催化有机酰基磷酸酯的水解，在糖酵解、嘧啶的生物合成等过程中发挥至关重要的生理和代谢作用 [12]。在许多组织和器官中，AcP作为两种同工酶被发现，被称为肌肉型AcP和器官普通型AcP，其天然构象由两个α螺旋和一个五链反平行的β折叠组成，两个β-α-β以排列紧凑的单元相互插入。AcP是单结构域蛋白，拓扑结构简单，没有二硫键等复杂因素，因此成为研究蛋白质折叠/去折叠机制的模型蛋白 [13]。

已经有生化体实验充分研究了AcP的折叠动力学，AcP的折叠遵循两态模型，28℃时AcP在水中的折叠速率为0.2 s⁻¹ [14] [15] [16] [17] [18]，属于折叠速率比较慢的蛋白质，这对于单分子测量是很不利的，对设备的稳定性有较高的要求。Arad-Haase等人通过原子力显微镜(Atomic force microscope, AFM)拉伸实验和分子动力学模拟研究了AcP的去折叠行为，通过对不同的拉伸速率下的去折叠拉力的分析，他们确定了AcP在不受拉力时的去折叠速率和去折叠过渡态的伸长变化 [19]，但线性外推到无拉力情况的有效性并没有得到验证。在本文中，我们利用稳定的磁镊 [20]，开展了不同加载速率下的拉伸实验，并通过力跳变实验测量了AcP在更小的拉力作用下(20 pN~40 pN)的去折叠速率。

2. 材料与方法

2.1. AcP样品的制备

我们设计并合成了HisTag-AviTag-I27₂-AcP-I27₂-SpyTag蛋白构建体的基因(金斯瑞，中国)，然后将其插入质粒pET151中。将上述质粒(氨苄青霉素抗性)和另一个具有BirA基因(生物素连接酶)的质粒(氯霉素抗性)以等摩尔比混合，然后转化到大肠杆菌菌株BL21中，后将菌液BL21均匀涂覆在固体培养基上，倒置过夜培养。挑选固体培养基上生长的菌落，将其接种于液体培养基(补充有氯霉素、氨苄青霉素、D-生物素)中，37℃、200 rpm摇床培养至菌体光密度达到0.6，然后加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5 mM，以诱导重组蛋白表达，在25℃培养基中表达AcP蛋白12 h。利用低温离心机在4℃、2500 g条件下收集菌体30 min，并在裂解缓冲液(50 mM Tris、500 mM氯化钠、50%甘油、5 mM 咪唑、5 mM 2-巯基乙醇，pH 8.0)中超声裂解。使用 Ni-NTA Sefinose Resin (生工，中国)纯化重组蛋白，在液氮中速冻并储存在−80℃ [21]。

2.2. 微流室的制备

22 mm × 32 mm和22 mm × 22 mm的盖玻片用于制备微流室。首先用超声波清洗机和等离子体清洗机清洁后，将载玻片浸入1% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，货号A3648，Sigma)的甲醇溶液中1 h，然后分别用甲醇和去离子水冲洗，烘干，从而使载玻片硅烷化。将一片22 mm × 32 mm的APTES功能化的盖玻片和另一片22 mm × 22 mm的洁净盖玻片居中对齐，沿长边粘贴封口膜，然后在玻片的短边处点胶形成矩形凹槽，以形成微流室。然后将直径为3.0 µm 的聚乙烯微球(货号17145，Poly-sciences)冲入腔室并孵育20 min，使其粘附在盖玻片表面，用作参考球以消除实验过程中的空间漂移。用200 µL PBS缓冲液冲洗后，将1% Sulfo-SMCC (货号247420，Thermo Science)冲入微流腔室并孵育20 min。再将N-SpyCatcher蛋白稀释在PBS缓冲液中，冲入腔室并孵育1 h。然后用含量为1% BSA的1XPBS溶液冲洗腔并孵育过夜以钝化表面。

2.3. 单分子磁镊实验

将重组蛋白以适宜浓度稀释在含量为1% BSA的1XPBS溶液中，冲入微流腔室并孵育20 min。向腔室冲入适量的链霉亲和素包被的顺磁球M270，形成用于磁镊拉伸实验的由单个蛋白质连接到玻璃表面的磁球链接。再将含有1% BSA和 10 mM抗坏血酸钠的1XPBS缓冲液冲入腔室，然后将微流室两端的凹槽封口以形成稳定的内部环境。磁镊搭建在倒置显微镜上，用100X油浸物镜对磁球进行成像。依托于稳定的自组装磁镊，我们开展了不同类型的磁镊拉伸实验，用于测量AcP的拉力依赖的去折叠动力学 [22]。

3. 实验结果

3.1. 识别AcP的正确去折叠信号

用于磁镊拉伸实验的蛋白质–磁球链接如图1(a)所示，通过链霉亲和素和N-SpyCatcher蛋白将结构为AviTag(biotin)-I27₂-AcP-I27₂-SpyTag的重组蛋白连接在磁球和盖玻片之间。磁铁产生外部磁场，对磁球施加竖直向上的力，通过快速移动磁铁调控力的大小，以此开展磁镊拉伸实验。如图1(b)所示，在1.5 pN/s的恒定的拉力加载速率下，力从0 pN增加至80 pN，拉力–伸长曲线记录了三种不同类型的信号。首先在26 pN处记录了一个约26 nm的去折叠信号，通过蠕虫状链(worm-like chain, WLC)模型分析，蛋白质轮廓长度增加了约36 nm，这符合我们的目的蛋白AcP的理论去折叠步长，被认为是AcP的去折叠

图1. 蛋白质–磁球链接的结构示意图和典型的拉力–伸长曲线。(a) 重组蛋白AviTag(biotin)-I27₂-AcP-I27₂-SpyTag分别通过链霉亲和素和N-SpyCatcher蛋白连接到棕色磁球和硅烷化的盖玻片上，磁球受竖直向上的拉力，灰色小球用作参考以消除实验过程中的空间漂移，插图显示了AcP的晶体结构(PDB: 1APS)；(b) 在1.5 pN/s的拉力加载速率下，拉力–伸长曲线依次记录了AcP的去折叠，SpyTag/SpyCatcher复合物的去折叠/折叠转变，四个I27蛋白的去折叠的信号

信号(图4(b))。随后在28~32 pN左右出现了几个~3.5 nm的折叠/去折叠转变，这是来自于SpyTag/SpyCatcher复合物的特征信号 [21]。当力增加至80 pN并维持在恒定80 pN拉力后，依次出现了四个典型的步长大小约为25 nm的信号，这来自于I27的去折叠转变 [20]。SpyTag/SpyCatcher复合物和I27提供的特征指纹信号被用于识别正确连接的单个蛋白质链接，以此确保AcP实验数据的准确性。

3.2. 不同拉力加载速率下的AcP的去折叠测量

为了探究不同拉力加载速率下AcP的去折叠动力学，我们设置了0.25 pN/s、0.5 pN/s、1 pN/s、2 pN/s、4 pN/s五种不同的拉力加载速率，以此开展磁镊拉伸实验，并统计不同速率下的去折叠力。为了减小实验结果误差，我们在每个加载速率下进行了多次循环拉伸，共记录了四根独立测量的蛋白质分子的数据，每个加载速率下累计统计超过150个去折叠事件，并计算了每个加载速率下的平均去折叠力。如图2所示，我们利用以下公式对数据点进行拟合：

$F_u^{\text{*}}=\frac{k_{B}T}{x_u}\ln \frac{r{x}_u}{k_u^0{k}_{B}T}$ (1)

其中， $F_u^{\text{*}}$ 表示不同加载速率下的最可几去折叠力(实验结果表明最可几去折叠力与平均去折叠力非常接近)， $k_B$ 表示玻尔兹曼常数， $T$ 表示绝对温度， $r$ 表示拉力加载速率， $x_u$ 表示去折叠距离(去折叠过渡态与自然状态构象在拉力方向上的伸长的差)， $k_u^0$ 表示力为零时的去折叠速率。对0.25 pN/s到4 pN/s区间内五个不同的加载速率的实验结果进行拟合并得到 $k_u^0=2.0\times {10}^{-3}$ s⁻¹和 $x_u=1.3$ nm。在我们的测量中，测量所用的去折叠拉力比AFM的实验要小，实验结果中去折叠距离比AFM实验的0.6 nm的结果要大，同时外推到零拉力的情况得到的去折叠速率比AFM的结果要小。这表明AcP在更小的拉力作用下时，其去折叠过渡态可能与大拉力作用时不同。

图2. 不同加载速率下的平均去折叠力。我们统计不同加载速率下的去折叠力并对其取平均值，误差棒代表去折叠力的标准偏差。利用(式1)拟合数据点(蓝色实线)，得到力为零时的去折叠速率 $k_u^0=2.0\times {10}^{-3}$ s⁻¹和去折叠距离 $x_u=1.3$ nm

3.3. 力跳变实验探究AcP在不同拉力下的去折叠速率

典型的力跳变实验可以被用来探究蛋白质的去折叠动力学 [23]。我们在20 pN~40 pN的力范围内开展了力跳变实验。如图3(a)所示，在同一个蛋白质分子上，力从1 pN分别跃迁至20 pN、25 pN、30 pN、35 pN、40 pN，并分别保持80 s、25 s、7 s、5 s、5 s，以记录AcP的去折叠过程。为了获得足够多的实验数据，我们进行了多个力跳变的循环实验，在每次循环之前，力跳变至小力1 pN并保持20 s，使AcP成功折叠到其自然状态。我们收集了三根独立测量的蛋白质系绳的数据，每个力下累计记录超过120个去折叠事件。如图3(b)所示，在不同力下，根据自然状态寿命的累积分布获得AcP自然状态的存活概率，利用指数拟合确定不同力下的去折叠速率。我们发现，去折叠速率对力比较敏感，随着力从20 pN增加至40 pN，去折叠速率由0.05 s⁻¹增加至9.2 s⁻¹。

图3. 力跳变实验测量不同力下AcP的去折叠速率。(a) 典型的力跳变实验记录AcP的去折叠过程。它显示了在同一根蛋白质系绳上进行五次力跳变循环，在不同的力下保持不同的时间来记录AcP的去折叠过程。在每次循环之前，拉力减小到1 pN并保持20 s，使AcP折叠到自然状态。插图显示了放大的AcP的去折叠过程；(b) AcP的自然状态在不同力下的存活概率。AcP在不同力下的去折叠速率由指数拟合曲线确定(红色实线)

3.4. 力依赖的去折叠速率的理论分析

通过力跳变实验确定AcP在不同力下的去折叠速率，将其以对数坐标绘制在图4(a)中。贝尔模型可以用来描述蛋白质的去折叠速率与所受拉力之间的关系：

$k_u\left(f\right)=k_u^0\exp \left(f{x}_u/k_{B}T\right)$ (2)

其中， $k_u\left(f\right)$ 是力依赖的去折叠速率， $f$ 是蛋白质受到的拉力， $k_u^0$ 是蛋白质在力为零时的去折叠速率， $x_u$ 是蛋白质从折叠态到过渡态的去折叠距离。利用贝尔模型拟合AcP在20 pN~40 pN的去折叠速率，我们得到AcP在力为零时的去折叠速率 $k_u^0=4.0\times {10}^{-4}$ s⁻¹和去折叠距离 $x_u=1.1$ nm。

蠕虫状链模型(WLC)可以被用来描述多肽链在拉力方向上伸长对于外力 的响应：

$\frac{fA}{k_{\text{B}}T}=\frac{x_{\text{chain}}}{L}+\frac{1}{4}{\left(1-\frac{x_{\text{chain}}}{L}\right)}^{-2}-\frac{1}{4}$ (3)

其中A是多肽链的驻留长度，在小力下A约为0.8 nm，轮廓长度L约为35.8 nm (每个氨基酸为0.365 nm和AcP蛋白含有98个氨基酸)； $x_{\text{chain}}$ 是多肽链沿受力方向的伸长。通过力跳变实验获得的去折叠步长如图4(b)所示，统计不同力下的去折叠步长并取平均值。蓝色曲线表示由WLC模型确定的AcP在不同拉力下的伸长变化 $x_{\text{chain}}$，AcP在自然状态的N-C距离为2.5 nm，我们的实验数据与WLC模型确定的理论值相吻合，进一步证明了我们实验数据的准确性。

图4. 不同拉力下的AcP的去折叠速率和转变步长。(a) 通过力跳变实验得到AcP在不同拉力下的去折叠速率。我们通过贝尔模型拟合20 pN到40 pN的去折叠速率，得到力为零时的去折叠速率 $k_u^0=4.0\times {10}^{-4}$ s⁻¹和去折叠距离 $x_u=1.1$ nm。力的误差来自5%的拉力校准引入的不确定性，去折叠速率的误差棒是平均寿命的标准误差；(b) 通过力跳变实验得到不同力下AcP的平均去折叠步长。去折叠步长的误差棒是标准偏差。蓝色曲线代表蠕虫状链拟合，轮廓长度约为35.8 nm，持久长度约为0.8 nm

4. 实验结论

在本文中，我们基于重组蛋白AviTag(biotin)-I27₂-AcP-I27₂-SpyTag开展了磁镊拉伸实验。实验中通过SpyTag-SpyCatcher在30 pN左右的典型3.5 nm的信号和I27在大力下去折叠的信号作为指纹信号，可以非常准确的区分正确的单个蛋白质–磁球链接与其它非特异性链接。虽然多个I27的去折叠信号可以提供指纹信号，但它需要施加较大的接近100 pN的拉力以使其在数秒内发生去折叠，在这么大的拉力下链接容易断掉，很大可能性是由于链霉亲和素与生物素之间链接的断裂。与I27不同，SpyTag-SpyCatcher的指纹信号在30 pN就可以被观察到，而且由于SpyTag-SpyCatcher在30 pN的构象转变既包含局部的去折叠，又包含重新恢复构象的可逆过程，所以可以作为拉力校准信号来对不同磁球的拉力进行校准。本实验给出了双指纹信号同时进行拉力校准的单分子力谱实验的应用实例。

磁镊实验可以精确地控制拉力以不同的恒定加载速度增大或减少，也可以在不同的拉力间进行快速跳变并稳定保持恒定拉力。我们测量得到了AcP在不同的拉力加载速度下的去折叠力，并在不同的恒定拉力下测量的AcP的去折叠速率。相对于AFM实验，我们在更小的拉力下完成了测量，实验结果显示AcP在小力下的去折叠距离明显变大。图4(a)中的试验点与标准的贝尔模型比较已经有些偏差。这显示AcP去折叠过渡态可能会随着拉力不同而变化。

在小于20 pN的拉力下，我们发现AcP的去折叠信号会和I27的去折叠信号发生混淆，一方面二者的去折叠速率开始变得比较接近，另外他们的去折叠转变的步长也差别不大 [24]。所以在更小拉力下的测量，需要去除I27或者换用与AcP尺寸有较大差别的其它蛋白质代替I27作为连接手柄。我们也曾尝试测量AcP在小于3 pN的折叠速率，但是由于时间–伸长曲线波动较大，AcP在小力下的折叠步长较小，导致我们未能在实验中直接观察到AcP的折叠信号。AcP在更小拉力下的折叠与去折叠过程需要设计新的实验进行进一步的深入研究，只有同时测量它在不同拉力作用下的折叠速率和去折叠速率，才可以准确得到它的折叠自由能，进一步分析清楚AcP的自由能曲面的精细结构。

基金项目

本论文获得国家自然科学基金项目(批准号：11874309，12174322)以及111项目(B16029)的资助。

文章引用

马雪宁,洪海燕,孙 皓,陈 虎. 酰基磷酸酶去折叠动力学的单分子磁镊研究
Single Molecule Magnetic Tweezers Study of Unfolding Kinetics of Acylphosphatase[J]. 生物物理学, 2022, 10(02): 22-30. https://doi.org/10.12677/BIPHY.2022.102003

参考文献