ABSTRACT

Human hepatocellular carcinoma (HHC) is one of the most common cancers in the world. The purpose of this study is to investigate the effect of ethyl coumarin-3-carboxylyl L-theanine (TEC) synthesized chemically by the theanine from natural tea on the growth of human HHC cell lines. The method of 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) was used to evaluate the effects of TEC at different concentrations on the growth of HHC SMMC7721 and HepG2 cell lines. The experimental results demonstrated that TEC at 16 to 250 μM significantly suppressed the growth of both SMMC7721 (P < 0.01) and HepG2 (P < 0.05) cells at dose- and time-dependent ways after the cells were treated with TEC for 48 and 72h, respectively. The inhibitory effect of TEC on SMMC7721 was much stronger than that of HepG2. Our present results suggest that TEC can significantly repress HHC cell growth and it is worthwhile to further study its anticancer activity.

Keywords:TEC, Human Hepatocellular Carcinoma, Growth Inhibition

茶乙香酰胺对人肝癌细胞生长的影响

张燕^1*，邓宝玲^2*，石晓玉¹，邵欣悦¹，张国营^1#

¹烟台大学药学院分子药理学实验室，烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学)，山东 烟台

²连云港中医药高等职业技术学校，江苏 连云港

收稿日期：2019年7月20日；录用日期：2019年8月8日；发布日期：2019年8月15日

摘 要

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，本文的目的是探究天然的茶叶活性成分茶氨酸化学合成获得的衍生物茶乙香酰胺(ethyl coumarin-3-carboxylyl L-theanine, TEC)对人肝癌细胞生长活性的影响。使用化学合成方法由茶氨酸合成茶乙香酰胺，通过细胞生长活性评价方法3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)检测分析不同浓度的TEC作用人肝癌SMMC7721和HepG2细胞48和72小时后的生长活性。实验结果表明：TEC在16-250 µM浓度能够显著性地抑制SMMC7721 (P < 0.01)和HepG2细胞(p < 0.05)的生长，呈现浓度-剂量及时效依赖性作用，并且，TEC对SMMC7721细胞的抑制作用比对HepG2细胞更强。我们目前的结果显示：茶乙香酰胺能够显著性抑制人肝癌SMMC7721细胞和HepG2细胞的生长，值得进一步研究其抗癌活性。

关键词 :茶乙香酰胺，肝癌细胞，抗肿瘤

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1. 引言

肝癌是预后较差的恶性肿瘤，发病率及病死率极高。迄今为止，肝癌的发生发展机制尚未完全明确。多学科综合治疗是治疗肝癌的主要手段 [1]。在我国，肝癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤致死率第二位 [2]。肝癌具有发病隐匿、发展迅速、转移及侵袭能力强、恶性度高的特点，严重危害着人类的生命健康。目前治疗肝癌的方法较多，根据不同的分期，选择的手术方式也不相同，以多学科联合治疗为主的个体化治疗策略在肝癌治疗中正逐渐的推广开来，使肝癌的5年生存率得到了提高，但肝癌复发和转移仍是目前亟待解决的难题 [3] - [8]。因此以抑制肝脏肿瘤生长为切入点，研究高效、低毒的新型抗肿瘤药物以及新的治疗方案是临床上迫切需要解决的问题。

茶叶在中国是最常见的饮品之一，茶氨酸是茶叶中普遍存在的氨基酸成分，茶氨酸口味鲜甜 [9] ，不仅可以作为食品添加剂 [10] ，其生理作用也逐渐成为研究重点。近年来，随着茶氨酸(N-乙基γ-谷氨酰胺)合成技术的逐渐成熟，其药理作用也逐渐明确，大量研究表明，茶叶能够减肥抗氧化、降血脂、降压、保护血管、抗辐射、抗病毒、抗肿瘤、提高机体免疫力等，在抑制肿瘤细胞发生和生长的同时，还可降低化疗药物的毒副作用 [11] - [17]。但茶氨酸本身结构及生理特点使其抗肿瘤作用较弱。本实验室对其化学结构进行了改造优化，合成了茶氨酸衍生物茶乙香酰胺(TEC)，其化学结构式(如图1)，显著提高了它对肺癌细胞生长的抑制作用 [18]。为了研发新型抗肝癌药物、了解TEC对人肝癌细胞的影响，本实验探究了TEC对于人肝癌SMMC7721细胞和HpeG2细胞的生长的抑制作用。

图1. 茶乙香酰胺的化学结构

2. 材料与方法

2.1. 主要试剂及仪器

人肝癌SMMC7721细胞系和HepG2细胞系购自中国科学院上海研究所；DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)购自Amersco公司；0.4%台盼蓝、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自Sigma公司；TEC由本实验室依据之前已经发表的方法 [18] 制备提供。

2.2. 仪器

3111型二氧化碳培养箱(Thermo公司)；TE2000-U型倒置荧光显微镜(Nikon公司)；全自动酶标仪(BIO-RAD公司)；离心机(Eppendorf公司)。

2.3. 细胞培养

取SMMC7721细胞和HepG2细胞复苏后，将其置于含有10%的FBS，1%的青链霉素的DMEM高糖培养液中，于37℃，5% CO₂的培养箱中培养。待细胞覆盖至全皿70%-80%且生长状态良好时可进行传代处理。

2.4. MTT法检测TEC对人肝癌SMMC7721细胞和HepG2细胞生长的影响

参照本实验室之前 [19] [20] [21] 报道的方法，用胰蛋白酶(0.25%)处理对数期的肝癌细胞，调整细胞浓度为2 × 10⁴/mL，接种在96孔板中，每组分三个复孔，在37℃二氧化碳培养箱培养24 h后分别以溶媒对照，加入等体积浓度为16、64、125、250 μM的TEC。于培养箱中培养48 h和72 h后分别取出，每孔各加入10 µL，5 mg/mL MTT溶液，37℃孵育4 h。吸去上清液，每孔加入150 µL DMSO溶解甲臢，于摇床(20RPM, 25℃)振摇15 min后，用酶标仪选取最适波长570 nm (630 nm参考波长校准)测定各孔的吸光度(A)，记录并计算出细胞相对生长率，以溶媒对照组为100%，计算各实验组的相对生长率来评价其对肝癌细胞生长的影响。

。

2.5. 统计学处理

实验结果采用SPSS17.0软件分析处理，以 $\bar{X}\pm SD$ 表示计算结果，采用t检验，计算是否具有显著性差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 实验结果

本实验用MTT法检测不同浓度TEC对人肝癌SMMC7721细胞(如图2)、HepG2细胞(如图3)生长的影响，其结果表明：随着药物浓度的增加和作用时间的延长其抑制作用显著增强，具有时间剂量依赖性。各实验组对人肝癌SMMC7721细胞的生长均具有显著抑制作用；实验组与溶媒对照组相比，TEC对人肝癌HepG2细胞的生长有较弱的抑制作用。16 µM的TEC与SMMC7721细胞分别作用48 h和72 h后，对其生长的抑制率分别为26.47%、47.19%，250 µM的TEC与SMMC7721细胞分别作用48 h和72 h的抑制作用分别为45.72%、72.76%，16µM的TEC与HepG2细胞分别作用48 h后，对其生长的抑制作用不显著，浓度达到64 µM、125 µM、250 µM作用48 h后抑制作用显著，其72 h后的抑制作用增加更显著，分别为7.27%、37.58%、56.56%。

图2. TEC对SMMC7721细胞生长的影响。^*代表48 h时，与溶媒对照组比有显著性差异， $\bar{X}\pm SD$ ，n = 3，^**P < 0.01；^#代表72 h时，与溶媒对照组比有显著性差异， $\bar{X}\pm SD$ ，n = 3，^###P < 0.001

图3. TEC对HepG2细胞生长的影响。^*代表48 h时，与溶媒对照组比有显著性差异， $\bar{X}\pm SD$ ，n = 3，^*P < 0.05；^#代表72 h时，与溶媒对照组比有显著性差异， $\bar{X}\pm SD$ ，n = 3，^#P < 0.05，^##P < 0.01，^###P < 0.001

4. 讨论

肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤。死亡率居全国恶性肿瘤死亡率的第2位，发病率居恶性肿瘤的第3位 [22]。目前肝癌诊断主要以AFP、超声检查、X线计算机断层成像(CT)、磁共振成像及肝穿刺活检为主要指标，与肝癌的高危因素结合来对肝癌进行诊断 [23] [24] [25] [26]。早期筛查肝癌高危人群是提高肝癌患者疗效的关键措施，有利于肝癌的早期发现、诊断及治疗。AFP作为监测肝癌的主要指标，高危人群进行早期筛查肝癌的主要手段是AFP和超声检查，建议至少间隔6个月进行1次检查。肝癌的综合治疗主要包括手术、介人治疗、放化疗等，尽管肝癌在诊断和治疗方面取得了一些进展，但由于它不易被早期诊断并且病情进程快，预后较差，仍然是全球癌症死亡的重要原因，5年生存率仍然很低 [27] [28] [29]。中国亦是肝癌的高发地区，发病人数较多且呈上升趋势，防治形势相当严峻 [30]。寻找高效低毒的抗肝癌药物显得格外重要。中药治疗肿瘤具有悠久的历史，具有低毒副作用、价格低廉等优点。目前已有较多的肿瘤研究学者从中草药中寻找高效低毒的抗肿瘤药物，已有大量的研究显示多种中草药对肿瘤生长有抑制作用。随着现代技术的进步及中医药的快速发展，许多中药的疗效逐渐被全世界认可，比如复方丹参滴丸、康莱特注射液等中药制剂。中草药因在治疗肿瘤方面的临床使用效果明显，并可延长患者的生存时间、改善生存质量而受到许多医学工作者的关注，但是其具体药效作用机制还有待进一步深入探究。传统中医药是从整体上系统地调控机体，可多靶点、多方位和多层面抑制肿瘤生长，这是它治疗疾病的优势 [31] - [39]。

目前在分子、基因层面探索中，中药抗肝癌药效作用机制已经成为时下研究的热点，但是中药复方的治病机制复杂多样决定了其独特的研究思路。天然茶叶是常见的中药成分，茶氨酸作为茶叶中特征性活性成分，是一种人体非必需的氨基酸，有多种药理活性，且安全无毒副作用，已经成为无限量的食品添加应用于食品工业，其药理活性也具有广阔的开发潜力。但是，鉴于茶氨酸的抗肿瘤药理作用较弱，前期本实验室对其化学结构进行改造修饰得到了茶乙香酰胺，初步研究其对肺癌细胞生长的影响，发现其对多种肺癌细胞有较强的抑制作用，TEC能够显著抑制肺癌细胞生长、迁移并诱导癌细胞凋亡，TEC药物分子作用机制可能与下调肺癌细胞中血管内皮生长因子受体VEGFR1、磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B, p AKT)、核转录因子NF-κB、抗凋亡蛋白(BCL2，apoptosis regulator, BCL2)、细胞周期蛋白(cyclin D1, CCND1)表达和上调促凋亡蛋白(BCL2 associated X, apoptosis regulator, BAX)有关，TEC抑制人肺癌细胞生长和迁移作用可能涉及到VEGFR/AKT/NF-κB这一信号通路。本实验研究证实了茶乙香酰胺对人肝癌细胞的生长有显著的抑制作用，是否与VEGFR/AKT/NF-κB通路有关值得进一步深入研究。

本实验通过MTT比色法测定其对人肝癌SMMC7721、HepG2细胞生长的影响。MTT是一种黄色染料，可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为不溶性的紫色甲臢(Formazan)并沉积于细胞中，而死细胞并没有此作用。二甲基亚砜(DMSO)可以溶解甲臢，用酶标仪测定其吸收值，就可间接反映出活细胞的相对数量。本实验研究结果显示TEC对人肝癌SMMC7721和HepG2细胞的生长均具有抑制作用，对SMMC7721细胞尤为显著，且呈现良好的有剂量-时间依赖性，为下一步的研究提供了一定的基础依据。茶氨酸的来源广泛，价格低廉，通过对其结构进行改造，提高抗肿瘤的活性，如果能将其开发成广谱的抗肿瘤药物将会具有广泛的应用前景。

基金项目

山东省自然科学基金资助项目(ZR2019MH076)。

文章引用

张 燕,邓宝玲,石晓玉,邵欣悦,张国营. 茶乙香酰胺对人肝癌细胞生长的影响
Effects of Ethyl Coumarin-3-Carboxylyl L-Theanine on the Growth of Human Hepatocellular Carcinoma Cells[J]. 药物化学, 2019, 07(03): 38-44. https://doi.org/10.12677/HJMCe.2019.73007

参考文献